張 霞，錢(qián)雪情，劉玲艷，秦張一，楊 濤，李國(guó)友

1中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所，成都 610041；2中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

毛殼菌屬真菌(Chaetomium)屬于子囊菌綱(Ascomycetes)球殼菌目(Sphaeriales)毛殼菌科(Chaetomiaceae)，廣泛存在于空氣、土壤及生物有機(jī)體中，目前已有400多個(gè)種被報(bào)道[1]。既往研究表明，毛殼菌屬真菌能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)類(lèi)型豐富的次級(jí)代謝產(chǎn)物，其中以細(xì)胞松弛素和azaphilone類(lèi)化合物為主要類(lèi)型[2]，同時(shí)毛殼菌屬真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物具有廣泛的生物活性，如抗菌[3-5]、抗炎[1,6]、細(xì)胞毒[7-11]等。本課題組長(zhǎng)期致力于毛殼菌屬真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)及其生物活性研究，先后從螺卷毛殼(C.cochliodes)[12,13]、反卷毛殼(C.convolutum)[14]、球毛殼(C.globosumCIB-160)[15]、細(xì)麗毛殼(C.gracile)[16]等毛殼霉次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離到了多種不同結(jié)構(gòu)類(lèi)型的活性物質(zhì)。繩生毛殼霉(C.funicola)是一株潛在病原菌，曾在被感染的皮膚組織中發(fā)現(xiàn)過(guò)[17]。1969年報(bào)道了從繩生毛殼霉分到的1個(gè)大環(huán)二內(nèi)酯化合物[18]，1987年，Itoh等[19]從C.funicolaJS 525分離到了泛醌類(lèi)化合物。目前關(guān)于繩生毛殼次級(jí)代謝產(chǎn)物研究報(bào)道僅有上述兩篇，同時(shí)缺乏相關(guān)生物活性研究報(bào)道。本文對(duì)一株繩生毛殼霉(C.funicolaCIB-604)的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并對(duì)部分化合物進(jìn)行了抑菌活性和細(xì)胞毒活性測(cè)試。在此，我們將對(duì)該菌次級(jí)代謝產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及生物活性進(jìn)行報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

AVANCE 400型、600型核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；MicrOTOF-QII高分辨質(zhì)譜儀(德國(guó)Bruker公司)；半制備色譜柱(250 mm×21.2 mm，10 μm，蘇州納微生物科技有限公司；250 mm×10 mm，5 μm，日本YMC公司)；半制備液相色譜儀(伍豐LC-100)；高效液相色譜儀(江蘇漢邦科技有限公司)；Varioskan Flash全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀、Attune NxT流式細(xì)胞儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific)。

1.1.2 試劑與材料

乙腈、二氯乙烷、甲醇、石油醚、乙酸乙酯等有機(jī)溶劑(成都力信和化工)，工業(yè)級(jí)，重蒸后使用；柱色譜硅膠(100～200、200～300目)及薄層色譜硅膠(GF254)(青島海洋化工廠)；反相C18硅膠(蘇州納微生物科技有限公司)；Sephadex LH-20(GE Healthcare Bio-Sciences AB)；氘代試劑CDCl3、CD3OD、DMSO-d6等(美國(guó)Sigma-Aldrich)；TLC顯色劑為5%硫酸-乙醇溶液；氨芐青霉素、氟康唑(上海麥克林生化科技有限公司)；DEME培養(yǎng)基、雙抗、胎牛血清、胰酶(Sigma公司)；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(中國(guó)凱基生物公司)。

1.1.3 菌株及細(xì)胞株

真菌CIB-604由本實(shí)驗(yàn)室從土壤樣本中分離得到，并從形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)角度進(jìn)行了鑒定。在PDA平皿上，CIB-604的菌落具白色氣生菌絲，日生長(zhǎng)速率3～4 mm；第3天開(kāi)始產(chǎn)褐色至黑色子囊果，橢圓形或近球形，憑借假根固著于培養(yǎng)基表面；子囊果附屬絲多頂生，挺直、剛毛狀，向頂部漸細(xì)，呈暗褐色，具隔；子囊孢子卵形或橢圓形，呈褐色，細(xì)小端具單個(gè)頂生芽孔。同時(shí)將CIB-604的ITS擴(kuò)增序列結(jié)果提交到NCBI進(jìn)行同源比對(duì)，使用MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)(鄰接法)，CIB-604與Chaetomiumfunicola聚為一支。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，將CIB-604鑒定為繩生毛殼霉(C.funicola)。

繩生毛殼霉(C.funicolaCIB-604)以及用于抑菌實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、白色念珠菌(Candidaalbicans)均保存于中科院成都生物研究所。人腫瘤細(xì)胞株SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)ATCC公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 發(fā)酵

液體培養(yǎng)基：改良后的PDB培養(yǎng)基，土豆200 g，葡萄糖20 g，酵母膏1.5 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，水1 000 mL。121 ℃滅菌30 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：大米加2倍體積的水浸泡過(guò)夜后，過(guò)濾并分裝于500 mL三角瓶中，并加入0.3%的蛋白胨。121 ℃滅菌30 min。

繩生毛殼霉CIB-604接種于PDA斜面，30 ℃恒溫培養(yǎng)5天進(jìn)行活化，再轉(zhuǎn)接于液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 rpm條件下培養(yǎng)3天。將長(zhǎng)好的種子液轉(zhuǎn)接于大米固體培養(yǎng)基中，30 ℃下靜止培養(yǎng)30天。

1.2.2 提取與分離

繩生毛殼霉CIB-604大米固體發(fā)酵物共10 kg，用乙酸乙酯(20 L)浸提(60 ℃)3次，每次24 h，合并濾液后減壓濃縮得到浸膏78.1 g。總浸膏經(jīng)硅膠柱層析，石油醚-乙酸乙酯體系梯度洗脫(30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、2∶1、1∶1、0∶1，V/V)，經(jīng)TLC分析合并為8個(gè)部分(A～H)。E段(4.95 g)再次經(jīng)硅膠柱層析分離得到8個(gè)亞組分(E1～E8)，化合物7(21.4 mg)、8(14.9 mg)分別從E4、E6段析出后重結(jié)晶得到。G段(3.79 g)進(jìn)一步通過(guò)反相硅膠柱分離，以甲醇-水(20∶80、30∶70、40∶60、50∶50、60∶40、80∶20、100∶0，V/V)洗脫分離得到14個(gè)亞組分(G1～G14)，G2段(51.3 mg)通過(guò)Sephadex LH-20柱(VEDC∶VMeOH= 1∶1)分為G2-1～G2-4四個(gè)部分，G2-2(37.0 mg)進(jìn)一步以20%乙腈水(V/V，含0.3‰三氟乙酸)為洗脫劑，經(jīng)半制備液相柱(10 mL/min)分離得到化合物1(5.7 mg，tR= 15.5 min)和化合物3(4.7 mg，tR= 9.8 min)。G5段(35.6 mg)經(jīng)半制備HPLC(10 mL/min，27%乙腈水，V/V)分離得到化合物2(13.0 mg，tR= 23.2 min)。G13(196.8 mg)再次經(jīng)正相硅膠柱分離得到7個(gè)組分(G13-1～G13-7)，G13-2段(47.7 mg)進(jìn)一步通過(guò)半制備液相柱(10 mL/min，86%乙腈水，V/V)得到化合物4(7.7 mg，tR= 52.9 min)、5(12 mg，tR= 69.4 min)、6(4.5 mg，tR= 73.6 min)。

1.2.3 抑菌活性測(cè)試

采用雙層瓊脂擴(kuò)散法[20]考察化合物1～6對(duì)兩株細(xì)菌(大腸桿菌、枯草芽孢桿菌)以及一株真菌(白色念珠菌)的抑制活性。細(xì)菌培養(yǎng)基為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，真菌培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基。樣品用DMSO溶解并配制成0.1 mg/mL，在對(duì)應(yīng)孔中加入180 μL。陰性對(duì)照為DMSO；細(xì)菌陽(yáng)性對(duì)照藥物為氨芐青霉素(50 μg/mL)，真菌陽(yáng)性對(duì)照藥物為氟康唑(50 μg/mL)。

1.2.4 抗腫瘤活性

1.2.4.1 MTT法檢測(cè)化合物體外細(xì)胞毒活性

采用MTT法測(cè)試了部分化合物對(duì)人腫瘤細(xì)胞株SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7的細(xì)胞毒活性。細(xì)胞株用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基(100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素)在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞株，按大約3 000細(xì)胞/孔的量接種于96孔板，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后，將不同濃度梯度的樣品分別加入到培養(yǎng)中，并設(shè)置空白對(duì)照，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h。再向培養(yǎng)基中加入20 μL MTT培養(yǎng)液(5 mg/mL)染色4 h。移去MTT溶液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩10 min后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)在570 nm波長(zhǎng)下各孔的吸光值，并計(jì)算抑制率及IC50。

1.2.4.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡

取對(duì)數(shù)期細(xì)胞株，調(diào)整細(xì)胞密度為3 000/mL，每孔1 mL接種于6孔板中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，加入樣品(濃度為10 μM)處理，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。36 h后，胰酶消化細(xì)胞，1 500 rpm離心5 min，去除上清液，再用PBS洗2次。檢測(cè)方法根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作：Binding buffer重懸細(xì)胞，先后加入Annexin V和PI，混勻后避光孵育15 min，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 化合物結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1白色粉末；5%硫酸乙醇不顯色；ESI-MS：m/z312.43 [M + Na]+；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.62(1H，s，H-3)，8.88(1H，s，H-6)，3.15(1H，dd，J=11.6，5.0 Hz，H-11)，1.98(1H，dd，J=12.6，5.0 Hz，H-12)，2.11(1H，t，J= 12.4 Hz，H-12)，2.60(3H，s，H-14)，1.20(3H，s，H-15)，0.76(3H，s，H-16)，0.94(3H，s，H-17)；13C NMR(100 MHz，DMSO-d6)δ：76.4(C-1)，153.5(C-2)，118.4(C-3)，165.2(C-4)，146.8(C-6)，124.1(C-7)，197.0(C-8)，68.1(C-9)，48.2(C-10)，69.4(C-11)，45.3(C-12)，207.0(C-13)，24.7(C-14)，11.0(C-15)，14.6(C-16)，21.2(C-17)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定為chaetoindicin A(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)。

圖1 化合物1～8的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of compounds 1-8

化合物2淺黃色粉末；5%硫酸乙醇顯色為藍(lán)綠色；ESI-MS：m/z290.35 [M + H]+；1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ： 2.63(1H，dd，J=14.6,9.9 Hz，H-1)，3.18(1H，dd，J=14.9,1.0 Hz，H-1)，4.86(1H，dd，J=9.6 ,1.0 Hz，H-2)，9.52(1H，s，H-6)，7.54(1H，s，H-9)，1.49(3H，s，H-11)， 1.71(3H，s，H-12)，2.08(3H，s，H-13)，2.61(3H，s，H-14)；13C NMR(100 MHz，C5D5N)δ：36.1(C-1)，92.3(C-2)，175.4(C-3a)，107.9(C-4)，185.9(C-5)，124.6(C-5a)，148.7(C-6)，162.8(C-8)，121.0(C-9)，149.8(C-9a)，72.2(C-9b)，71.2(C-10)， 28.0(C-11)，27.6(C-12)，8.8(C-13)，25.2(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定為chaetoindicin B。

化合物3淺黃色粉末；5%硫酸乙醇顯色為藍(lán)綠色；ESI-MS：m/z290.32 [M + H]+；1H NMR(400 MHz，C5D5N)δ：2.66(1H，dd，J=12.3,10.1 Hz，H-1)，3.11(1H，dd，J=12.4,4.7 Hz，H-1)，5.38(1H，dd，J=10.0,4.6 Hz，H-2)，9.45(1H，s，H-6)，7.62(1H，s，H-9)，1.47(3H，s，H-11)，1.66(3H，s，H-12)，2.01(3H，s，H-13)，2.63(3H，s，H-14)；13C NMR(150 MHz，C5D5N)δ：36.8(C-1)，91.8(C-2)，174.9(C-3a)，107.2(C-4)，185.1(C-5)，122.2(C-5a)，148.2(C-6)，162.2(C-8)，120.2(C-9)，149.5(C-9a)，74.2(C-9b)，69.8(C-10)，26.6(C-11)，26.1(C-12)，8.0(C-13)，24.5(C-14)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報(bào)道基本一致，故鑒定為chaetoindicin C。

化合物4白色粉末；5%硫酸乙醇顯色為黃色；ESI-MS：m/z467.21 [M + Na]+；1H NMR(400 MHz，CD3OD)δ：3.95(1H，m，H-3)，5.58(1H，d，J= 1.8 Hz，H-7)，2.76(1H，m，H-14)，0.67(3H，s，H-18)，1.00(3H，s，H-19)，1.06(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.21(1H，dd，J= 15.2，7.7 Hz，H-22)，5.27(1H，dd，J= 15.2，7.2 Hz，H-23)，0.85(3H，d，J= 7.2 Hz，H-26)，0.87(3H，d，J= 7.3 Hz，H-27)，0.95(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(100 MHz，CD3OD)δ：26.6(C-1)，31.0(C-2)，67.8(C-3)，37.1(C-4)，80.2(C-5)，200.1(C-6)，120.9(C-7)，165.0(C-8)，76.1(C-9)，44.3(C-10)，29.3(C-11)，36.2(C-12)，46.2(C-13)，52.8(C-14)，23.4(C-15)，29.1(C-16)，57.4(C-17)，12.6(C-18)，21.6(C-19)，41.7(C-20)，20.6(C-21)，136.7(C-22)，133.6(C-23)，42.8(C-24)，34.4(C-25)，20.1(C-26)，20.5(C-27)，18.2(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22,23]報(bào)道基本一致，故鑒定為(22E,24R)-3β,5α,9α-trihydroxy-ergosta-7,22-dien-6-one。

化合物5無(wú)色針晶；5%硫酸乙醇顯色為紫紅色；ESI-MS：m/z451.24 [M + Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.93(1H，m，H-3)，3.31(1H，d，J= 2.6 Hz，H-6)，4.22(1H，br s，H-7)，0.58(3H，s，H-18)，1.14(3H，s，H-19)，1.01(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，5.16(1H，dd，J= 14.8，7.4 Hz，H-22)，5.21(1H，dd，J= 15.3，7.1 Hz，H-23)，0.83(3H，d，J= 6.5 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J= 6.6 Hz，H-27)，0.91(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：31.0(C-1)，30.3(C-2)，68.7(C-3)，39.3(C-4)，65.8(C-5)，62.7(C-6)，67.3(C-7)，134.6(C-8)，127.1(C-9)，38.1(C-10)，23.5(C-11)，35.8(C-12)，42.2(C-13)，49.7(C-14)，24.0(C-15)，29.1(C-16)，53.8(C-17)，11.4(C-18)，23.0(C-19)，40.6(C-20)，21.1(C-21)，135.7(C-22)，132.1(C-23)，43.0(C-24)，33.2(C-25)，19.8(C-26)，20.1(C-27)，17.8(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報(bào)道基本一致，故鑒定為(22E,24R)-5α,6α-epoxy-ergosta-8,22-dien-3β,7α-diol。

化合物6白色粉末；5%硫酸乙醇顯色為紫紅色；ESI-MS：m/z451.24 [M + Na]+；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：3.94(1H，m，H-3)，3.16(1H，d，J= 3.6 Hz，H-6)，4.44(1H，d，J= 3.2 Hz，H-7)，0.89(6H，s，H-18，19)，1.04(3H，d，J= 6.7 Hz，H-21)，5.20(1H，dd，J= 15.2，7.6 Hz，H-22)，5.25(1H，dd，J= 15.2，7.0 Hz，H-23)，0.84(3H，d，J= 6.7 Hz，H-26)，0.86(3H，d，J= 6.7 Hz，H-27)，0.93(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：32.3(C-1)，31.2(C-2)，68.8(C-3)，39.7(C-4)，67.9(C-5)，61.5(C-6)，65.2(C-7)，125.3(C-8)，38.7(C-9)，36.0(C-10)，19.1(C-11)，36.7(C-12)，43.1(C-13)，152.8(C-14)，25.1(C-15)，27.3(C-16)，57.0(C-17)，18.2(C-18)，16.7(C-19)，39.4(C-20)，21.4(C-21)，135.4(C-22)，132.4(C-23)，43.0(C-24)，33.2(C-25)，20.1(C-26)，19.8(C-27)，17.8(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24,25]報(bào)道基本一致，故鑒定為5α,6α-epoxy-(22E,24R)-ergosta-8(14),22-diene-3β,7α-diol。

化合物7無(wú)色針晶；5%硫酸乙醇顯色為紫紅色；ESI-MS：m/z397.12 [M + H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：3.64(1H，m，H-3)，5.58(1H，dd，J= 5.4，2.4 Hz，H-6)，5.38(1H，dd，J= 5.5，2.8 Hz，H-7)，0.63(3H，s，H-18)，0.96(3H，s，H-19)，1.03(3H， d，J= 6.7 Hz，H-21)，5.20(1H，dd，J= 15.4，7.6 Hz，H-22)，5.15(1H，dd，J= 15.4，7.6 Hz，H-23)，0.84(3H，d，J= 7.0 Hz，H-26)，0.82(3H，d，J= 7.0 Hz，H-27)，0.92(3H，d，J= 6.6 Hz，H-28)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：38.5(C-1)，32.0(C-2)，70.6(C-3)，41.0(C-4)，139.9(C-5)，119.7(C-6)，116.5(C-7)，141.5(C-8)，46.4(C-9)，37.1(C-10)，21.2(C-11)，39.3(C-12)，43.0(C-13)，54.7(C-14)，23.1(C-15)，28.4(C-16)，55.9(C-17)，12.2(C-18)，16.4(C-19)，40.5(C-20)，21.2(C-21)，135.7(C-22)，132.2(C-23)，42.9(C-24)，33.1(C-25)，20.1(C-26)，19.8(C-27)，17.6(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報(bào)道基本一致，故鑒定為麥角甾醇。

化合物8無(wú)色針晶；5%硫酸乙醇顯色為綠色；ESI-MS：m/z429.23 [M + H]+；1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：3.97(1H，m，H-3)，6.52(1H，d，J= 8.4 Hz，H-7)，6.26(1H，d，J= 8.4 Hz，H-6)，0.85(3H，s，H-18)，0.92(3H，s，H-19)，1.01(3H，d，J= 6.8 Hz，H-21)，5.23(1H，dd，J= 15.2，7.4 Hz，H-22)，5.17(1H，dd，J = 15.2，7.4 Hz，H-23)，0.86(3H，d，J= 7.0 Hz，H-27)，0.82(3H，d，J= 7.0 Hz，H-26)，0.94(3H，d，J= 6.8 Hz，H-28)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：34.9(C-1)，30.3(C-2)，66.7(C-3)，37.1(C-4)，82.3(C-5)，135.6(C-6)，129.9(C-7)，79.6(C-8)，51.2(C-9)，37.2(C-10)，23.6(C-11)，39.5(C-12)，44.7(C-13)，51.8(C-14)，28.9(C-15)，20.8(C-16)，56.4(C-17)，12.2(C-18)，18.4(C-19)，40.0(C-20)，21.0(C-21)，135.4(C-22)，132.5(C-23)，43.0(C-24)，33.3(C-25)，19.9(C-26)，20.2(C-27)，13.1(C-28)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報(bào)道基本一致，故鑒定為過(guò)氧麥角甾醇。

2.2 抗菌活性

抗菌活性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物1～6在100 μg/mL濃度時(shí)，對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均沒(méi)有生長(zhǎng)抑制活性。

2.3 抗腫瘤活性

2.3.1 MTT法檢測(cè)化合物的體外細(xì)胞毒活性

采用MTT法考察了化合物1～6對(duì)人腫瘤細(xì)胞株SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7的體外細(xì)胞毒活性測(cè)試。結(jié)果表明，化合物2和4對(duì)所有測(cè)試的腫瘤細(xì)胞株均表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性(見(jiàn)表1)，其中，化合物4對(duì)SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7這四個(gè)細(xì)胞株的IC50分別為3.10 ± 0.80、4.81 ± 1.01、8.25 ± 2.28、5.36 ± 1.29 μM，細(xì)胞毒活性均強(qiáng)于化合物2。

表1 化合物2和4對(duì)SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7細(xì)胞株的細(xì)胞毒活性Table 1 Cytotoxicity of compounds 2 and 4 against SK-Hep-1,A549,HCT-116 and MCF-7

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響

為進(jìn)一步考察和比較化合物2和4對(duì)腫瘤細(xì)胞凋亡的影響，我們選取其中兩株細(xì)胞株SK-Hep-1和A549進(jìn)行了深入研究。結(jié)果如圖2所示，化合物2在10 μM的濃度下對(duì)SK-Hep-1和A549細(xì)胞的凋亡率分別為22.77%、11.50%，被化合物2處理過(guò)的SK-Hep-1細(xì)胞主要集中于Q3區(qū)域，說(shuō)明其主要是引起該細(xì)胞的早期凋亡；而在相同濃度處理下，化合物4相比于2具有更強(qiáng)的誘導(dǎo)凋亡作用，對(duì)SK-Hep-1和A549細(xì)胞的凋亡率分別為32.54%、17.83%，其中，對(duì)SK-Hep-1主要是引起細(xì)胞早期凋亡(25.6%)，誘導(dǎo)A549凋亡主要為晚期凋亡(10.3%)。

圖2 化合物2和4對(duì)SK-Hep-1和A549細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of compounds 2 and 4 on apoptosis of SK-Hep-1 and A549 cells

3 討論與結(jié)論

本文從一株繩生毛殼霉(C.funicolaCIB-604)的大米固態(tài)發(fā)酵物中分離得到了8個(gè)次級(jí)代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)類(lèi)型包括3個(gè)異喹啉生物堿(1～3)和5個(gè)甾醇類(lèi)化合物(4～8)，均首次從繩生毛殼霉中分離得到?；衔?～3是最早由本課題組從印度毛殼霉(C.indicum3.202)的次級(jí)代謝產(chǎn)物中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)新穎的異喹啉生物堿[21]，迄今為止，繩生毛殼霉是第二種能夠產(chǎn)生該類(lèi)新穎異喹啉生物堿的真菌，推測(cè)繩生毛殼霉可能含有和印度毛殼霉相同的異喹啉生物堿生物合成途徑。本論文對(duì)化合物1～6進(jìn)行了抗菌活性和細(xì)胞毒活性測(cè)試，其抗菌活性結(jié)果表明在100 μg/mL的濃度時(shí)，化合物1～6對(duì)大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌均沒(méi)有表現(xiàn)出抑制效果；細(xì)胞毒活性結(jié)果表明化合物2和4對(duì)人腫瘤細(xì)胞SK-Hep-1、A549、HCT-116和MCF-7均顯示出細(xì)胞毒活性，且化合物4對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果強(qiáng)于化合物2；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果表明化合物2和4主要誘導(dǎo)SK-Hep-1細(xì)胞早期凋亡，而化合物2對(duì)A549細(xì)胞早期和晚期凋亡的影響差別不大，化合物4誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡主要是晚期凋亡。本論文首次報(bào)道了化合物2對(duì)腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性，分析結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，化合物3是2的差向異構(gòu)體，但其細(xì)胞毒活性明顯低于化合物2，說(shuō)明羥基與異丙基之間的相對(duì)構(gòu)型對(duì)其細(xì)胞毒活性有顯著影響。與化合物5、6相比，4具有顯著細(xì)胞毒活性，分析結(jié)構(gòu)特征可以發(fā)現(xiàn)，化合物4的分子結(jié)構(gòu)中有一個(gè)典型的活性中心——α，β-不飽和羰基結(jié)構(gòu)單元，其能夠與細(xì)胞中蛋白質(zhì)的巰基發(fā)生烷基化反應(yīng)，從而與腫瘤細(xì)胞結(jié)合并將其殺死[28]。綜上所述，本論文對(duì)繩生毛殼霉CIB-604次級(jí)代謝產(chǎn)物及生物活性的研究結(jié)果為科學(xué)認(rèn)識(shí)、合理開(kāi)發(fā)利用該菌奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。