昝立峰，范宇光，包海鷹，圖力古爾，葉 嘉

1邯鄲學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，邯鄲 056005；2海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，?？?571199；3吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)藥用菌物資源及其開發(fā)利用重點研究室，長春 130118

楊樹桑黃(Sanghuangporusvaninii(Ljub.) L.W.Zhou & Y.C.Dai)隸屬于銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)桑黃菌屬(Sanghuangporus)的多年生大型藥用真菌[1]。生長于山楊(Populusdavidiana)活立木、倒木及樹樁上，主要分布于中國長白山和小興安嶺地區(qū)以及日本、朝鮮、韓國等東北亞國家[2]。楊樹桑黃具有利五臟，軟堅和胃，護肝益氣之功效，臨床上主治胃失和降，肝陽上亢，腎虛精虧。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)楊樹桑黃具有良好的抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化和保肝護肝等多種藥理活性，從其子實體中分離得到麥角甾-4,6,8(14),22(23)-四烯-3-酮、櫻花亭、二氫莰非素、7-甲氧基二氫莰非素、3,4,5-三羥基-7-甲氧基-二氫黃酮醇、4-(3,4-二羥苯基)-3-丁烯-2-酮、hispolon等麥角甾、黃酮、吡喃酮類活性成分[3-4]。

楊樹桑黃是目前市場上主要商品化的“桑黃”物種，栽培技術(shù)較為成熟，其子實體栽培包括木段栽培和木屑代料栽培兩種模式。有研究發(fā)現(xiàn)[5]，木段和木屑代料栽培桑黃子實體提取物對腫瘤細胞增殖具有良好的抑制作用，且發(fā)現(xiàn)活性成分黃酮、多酚含量與腫瘤細胞增殖抑制和體外抗氧化能力趨勢一致。Huo[6]研究發(fā)現(xiàn)楊樹桑黃水提取物對小鼠各器官沒有明顯的毒副作用，主要成分為多糖、核苷酸、多酚類化合物，其中多酚為其主要活性成分。目前楊樹桑黃子實體質(zhì)量標(biāo)準中僅包括總多糖、總酚及麥角甾醇的含量，而關(guān)于野生和不同栽培楊樹桑黃子實體中活性指標(biāo)成分的系統(tǒng)分析未見詳細報道，同時桑黃中吡喃酮酚類成分易在分離過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)變化，不易準確鑒定其結(jié)構(gòu)。超高效液相色譜-串聯(lián)四級桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)技術(shù)兼具液相色譜的高效分離能力與質(zhì)譜的高靈敏度、高檢測能力，在藥物有效成分分析、藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究等方面具有獨特的優(yōu)勢。本研究擬采用UPLC-QTOF-MS技術(shù)，根據(jù)化合物保留時間、分子離子峰及二級質(zhì)譜裂解碎片并參照相關(guān)文獻系統(tǒng)分析野生和栽培楊樹桑黃子實體中的活性成分，旨在為進一步指導(dǎo)楊樹桑黃開發(fā)及提升質(zhì)量控制標(biāo)準提供技術(shù)支持，同時為其藥用功能研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

野生楊樹桑黃、栽培楊樹桑黃子實體于2020年8月由海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院范宇光博士提供并鑒定，3～8 ℃低溫放置備用。

甲醇和甲酸為色譜級，購自美國Sigma公司，其余試劑為分析純，實驗用水為超純水。Seplite AB-8型大孔吸附樹脂購買于西安藍曉科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Acquity UPLC-G2 QTOF聯(lián)用系統(tǒng)(Waters公司)；Waters BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；N-1200B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(東京理化器械株式會社)；Mill-Q Advantage A10超純水儀(Millipore公司)。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

楊樹桑黃子實體粉碎至20～40目，稱取粉末200 g，先采用正己烷在40 ℃脫脂3次，陰干后用80%的乙醇按料液比1∶7.5在45 ℃浸提3次，每次1.5 h，合并提取液并離心過濾，過濾液在溫度為45～50 ℃減壓濃縮為水混懸液，水混懸液采用大孔吸附樹脂吸附分離純化，85%乙醇解吸得到解吸液，解吸液減壓蒸發(fā)濃縮后冷凍干燥得到粉末，分析前取適量用甲醇溶解并過0.22 μm濾膜，即得樣品溶液。

1.3.2 色譜條件

色譜柱為Waters BEH C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動相A為甲醇，B相為水溶液(含0.1%甲酸)，流動相梯度洗脫過程如下：5%A(0～2 min)，5%→100%A(2～30 min)，100%A(30～35 min)，100%→5%A(35～35.1 min)，5%A(35.1～40 min)；流速為0.3 mL/min；進樣量為10 μL；柱溫40 ℃。

1.3.3 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)負離子模式掃描，掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)50～1 200，毛細管電壓為2 800 V，樣品錐孔電壓30 V，萃取錐孔電壓1 V，離子源溫度100 ℃，脫溶劑溫度300 ℃，錐孔氣50 L/h，脫溶劑氣流速900 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊樹桑黃乙醇提取物分析

圖1為楊樹桑黃子實體乙醇提取物的UPLC-QTOF-MS離子流色譜圖，從圖中看出UPLC分離條件可以有效地將提取物中的活性成分分開，在UPLC-QTOF-MS條件下得到質(zhì)譜圖，從野生與栽培楊樹桑黃子實體中共鑒定出40個化合物，包括小分子有機酸8個、兒茶素類化合物3個、吡喃酮20個、黃酮9個，其中野生和栽培子實體中共有成分14個，包括小分子有機酸3個、吡喃酮酚類物質(zhì)11個，但各成分相對含量在野生和栽培子實體中差異明顯，吡喃酮酚類物質(zhì)在木屑栽培和木段栽培子實體中相對含量較高，且木屑栽培略高于木段栽培子實體；野生子實體中特有成分14個，包括小分子有機酸1個、兒茶素類3個、吡喃酮1個、黃酮9個，其中兒茶素類和黃酮類化合物僅在野生子實體中發(fā)現(xiàn)，而在兩種栽培子實體中均未發(fā)現(xiàn)；栽培子實體中出現(xiàn)12種特有成分，8種為兩種栽培子實體共有成分，4種為木屑栽培子實體中出現(xiàn)，主要為小分子有機酸和吡喃酮。小分子有機酸、兒茶素類、吡喃酮、黃酮化合物在ESI離子源負離子模式下主要產(chǎn)生[M-H]-準分子離子峰，具體信息見表1所示。

圖1 楊樹桑黃子實體提取物負離子模式下的離子基峰圖Fig.1 The base peak ion (BPI) of the negative mode in extracts from S.vaninii 注：A：野生；B：木屑袋料栽培；C：木段栽培。Note: A: Wild fruiting body;B: Bag-cultivated fruiting body;C: Wood cultivated fruiting body.

表1 UPLC-QTOF-MS鑒定楊樹桑黃提取物中的化合物Table 1 Identification of compounds from S.vaninii extracts by UPLC-QTOF-MS

續(xù)表1(Continued Tab.1)

2.2 化合物鑒定

2.2.1小分子有機酸

在負離子模式下，從野生與栽培楊樹桑黃子實體中鑒定出小分子有機酸8個，二級質(zhì)譜(MS/MS)主要通過失去羧基(COO-)得到特征碎片。

化合物1保留時間1.38 min，分子離子峰為m/z191.109 2[M-H]-，分子式為C6H8O7，MS/MS質(zhì)譜中母離子裂解失去1分子羧基(44 Da)產(chǎn)生碎片m/z147.030 1[M-H-CO2]-，出峰保留時間較短，比較碎片信息，推測化合物為檸檬酸。

化合物2保留時間2.86 min，分子離子峰為m/z169.013 3 [M-H]-，分子式為C7H6O5。MS/MS質(zhì)譜中通過母離子裂解失去1分子羧基(44 Da)產(chǎn)生特征碎片m/z125.024 2，確定為沒食子酸，僅在野生子實體中出現(xiàn)。

化合物3保留時間2.90 min，分子離子峰為m/z242.976 5 [M-H]-，分子式為C8H4O9。MS/MS質(zhì)譜中分子離子峰裂解分別失去3分子羧基(44 Da)產(chǎn)生碎片m/z198.986 4、154.997 5、111.007 2，在線查閱Chemical spider數(shù)據(jù)庫，推測化合物為呋喃四羧酸，該化合物僅在木屑栽培子實體中出現(xiàn)。

化合物4、6保留時間分別為5.40、7.32 min，分子離子基峰分別為m/z153.018 5 [M-H]-和m/z137.023 8 [M-H]-，分子式分別為C7H6O4和C7H6O3，分子量相差16。MS/MS質(zhì)譜中分別出現(xiàn)m/z109.030 2、108.021 9特征碎片，推測化合物通過裂解分別失去1分子羧基(44 Da)和1分子醛基(29 Da)得到特征碎片，參考文獻[7]推測化合物4和6分別為原兒茶酸和原兒茶醛。

化合物5保留時間為6.44 min，僅在木屑栽培子實體質(zhì)譜中檢測到，分子離子峰為m/z209.007 5 [M-H]-，分子式為C9H6O6。MS/MS質(zhì)譜中分子離子峰失去1分子羧基(44 Da)產(chǎn)生碎片m/z165.019 4，繼續(xù)失去1分子羧基(44 Da)得到特征碎片m/z121.026 3，推測化合物為苯三甲酸。

化合物7保留時間8.09 min，分子離子峰為m/z198.987 0 [M-H]-，分子式為C7H4O7，MS/MS質(zhì)譜中分別失去2分子羧基產(chǎn)生碎片m/z154.996 8、111.007 4，在線從Chemical spider和PubMed數(shù)據(jù)庫查閱結(jié)構(gòu)圖，比較分析推測化合物為袂康酸。

化合物8保留時間10.47 min，栽培子實體中檢測到分子離子峰為m/z179.034 5 [M-H]-、分子式為C9H8O4的化合物，MS/MS質(zhì)譜失去1分子羧基得到碎片m/z135.043 8，參考文獻[8]推測化合物為咖啡酸。

2.2.2 兒茶素類化合物

從野生楊樹桑黃子實體提取物中鑒定出3個兒茶素類化合物，且出現(xiàn)多個同分異構(gòu)現(xiàn)象，而在兩種栽培子實體提取物中均未發(fā)現(xiàn)此類化合物。

化合物9保留時間為8.91、12.18 min，分子離子峰均為m/z289.071 4 [M-H]-，分子式為C15H14O6。MS/MS質(zhì)譜中產(chǎn)生沒食子酸特征碎片m/z169.014 3、125.023 0，推測其為同分異構(gòu)體，根據(jù)化合物保留時間，并參考文獻[9]推測化合物分別為兒茶素和表兒茶素。

化合物10保留時間為11.44、12.95 min，分子離子峰均為m/z457.077 0 [M-H]-，分子式為C22H18O11。MS/MS質(zhì)譜中分子離子峰失去1分子沒食子酰基(152 Da)產(chǎn)生碎片m/z305.062 6，而分子離子峰失去1分子沒食子酸得到兒茶素碎片離子m/z289.070 6，同時產(chǎn)生m/z169.013 2特征碎片，兒茶素碎片離子進一步通過C環(huán)的1,4鍵斷裂得到碎片m/z125.022 9，綜合碎片裂解規(guī)律和保留時間并參考文獻[9]鑒定為沒食子兒茶素沒食子酸酯和表沒食子兒茶素沒食子酸酯，其二級質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律見圖2所示。

圖2 化合物10的二級質(zhì)譜圖及其裂解途徑Fig.2 The MS2 spectrum and fragmentation pathway of compound 10 at negative ion mode

化合物11保留時間為14.97、15.89 min，分子離子峰為m/z441.083 0 [M-H]-，分子式為C22H18O10，與化合物10僅相差1分子羥基，MS/MS質(zhì)譜同樣產(chǎn)生m/z289.069 0、169.012 2、125.022 7碎片離子，推測化合物11為兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯。

2.2.3 吡喃酮類化合物

化合物12保留時間13.80 min，分子離子峰為m/z423.069 7[M-H]-，元素組成分析化合物分子式為C22H16O9。MS/MS質(zhì)譜中母離子失去1分子羧基(44 Da)產(chǎn)生碎片m/z379.081 1，母離子失去1分子咖啡酸產(chǎn)生碎片m/z243.029 9，母核離子發(fā)生裂解失去碎片C3H2O3得到特征碎片m/z159.043 0，參考文獻[11]推測化合物為phellibaumin D。

化合物13保留時間14.20 min，分子離子峰為m/z177.055 5[M-H]-，分子式為C10H10O3。MS/MS質(zhì)譜中母離子失去1分子羥基(16 Da)產(chǎn)生碎片m/z161.025 1，母離子失去碎片C2H3O(43Da)產(chǎn)生特征碎片m/z134.036 2，參考文獻[12]，推測化合物為4-(3,4-二羥基苯基)-3-丁烯-2-酮[4-(3,4-dihydroxyphenyl)-3-buten-2-one]。

化合物14保留時間14.72 min，分子離子峰為m/z288.996 4 [M-H]-，分子式為C13H6O8。MS/MS質(zhì)譜中母離子失去1分子羧基(44 Da)產(chǎn)生特征碎片m/z245.012 0，進一步裂解失去2分子CO得到碎片m/z217.017 5、189.018 3，同時發(fā)現(xiàn)母離子失去2分子羥基得到碎片m/z257.052 5，參考文獻[13]推測化合物為phelligridin J。

化合物16保留時間16.51 min，分子離子峰為m/z421.092 7 [M-H]-，分子式為C23H18O8。MS/MS質(zhì)譜中母離子失去1分子羥基產(chǎn)生碎片m/z405.066 9 [M-OH]-，母離子失去1分子C2H2O離子得到碎片m/z379.083 4 [M-H-C2H2O]-，失去1分子二羥基苯乙烯離子得到碎片m/z285.030 4 [M-H-C8H8O2]-，分子離子峰失去1分子4-(3,4-二羥基苯基)-3-丁烯-2-酮得到hispidin特征碎片離子m/z243.027 4 [M-H-C10H10O3]-，hispidin母核離子進一步裂解產(chǎn)生碎片離子m/z217.049 5、159.044 1，參考文獻[14]推測化合物為interfungin B。

化合物18保留時間18.86 min，分子離子峰為m/z463.104 5 [M-H]-，二倍分子離子峰為m/z927.213 9 [2M-H]-，分子式為C25H20O9。MS/MS質(zhì)譜中產(chǎn)生hispidin特征碎片m/z243.029 3，推測化合物為hispidin衍生物，二級質(zhì)譜產(chǎn)生碎片m/z405.059 0 [M-H3-CH3-CO-CH]-、379.082 1 [M-H-CH3-CO-CH-CO]-、259.060 8 [M-H-C6H5O2-C5H3O2]-、243.029 3 [M-H-C6H5O2-C6H7O2]-，hispidin母核進一步裂解產(chǎn)生碎片m/z217.050 2、159.044 5、135.044 4，根據(jù)二級質(zhì)譜裂解規(guī)律并參考文獻[16]推測化合物為davallialactone，裂解規(guī)律如圖3所示。

圖3 化合物18的二級質(zhì)譜圖及其裂解途徑Fig.3 The MS2 spectrum and fragmentation pathway of compound 18 at negative ion mode

化合物19保留時間18.93 min，分子離子峰為m/z521.112 9 [M-H]-，分子式為C27H22O11，一級質(zhì)譜中出現(xiàn)m/z463.104 5 [M-H]-離子峰，推測化合物與davallialactone結(jié)構(gòu)相似。MS/MS質(zhì)譜中裂解碎片產(chǎn)生碎片m/z463.097 5、405.064 7、379.084 8、259.061 9、243.029 5、159.044 8、135.043 8，由裂解碎片可知m/z463.097 5碎片與分子離子峰分子量相差58(C2H2O2)，參考文獻[17]推測化合物為baumin。

化合物20保留時間21.80 min，分子離子峰為m/z423.165 3 [M-H]-，二倍分子離子峰為m/z847.333 4 [2M-H]-，分子式為C22H16O9。MS/MS質(zhì)譜中裂解失去1分子咖啡酸產(chǎn)生特征碎片m/z243.029 7，吡喃酮母核裂解產(chǎn)生碎片m/z159.044 9、135.044 9，參考文獻[11]推測化合物可能為phellibaumin B或D。

化合物21保留時間為23.10、24.66 min，分子離子峰均為m/z489.083 7 [M-H]-，二倍分子離子峰為m/z979.169 7 [2M-H]-，分子式為C26H18O10。MS/MS質(zhì)譜中裂解產(chǎn)生碎片m/z445.093 1 [M-H-CO2]-、403.086 4 [M-H-C3H2O3]-、377.068 5 [M-H-C5H4O3]-、335.061 4 [M-H-C8H9O2-OH]-、241.049 9 [M-H-C8H9O2-C5H3O3]-，hispidin母核進一步裂解產(chǎn)生碎片m/z159.045 7、135.044 4，根據(jù)質(zhì)譜裂解規(guī)律，參考文獻[18]推測化合物為hypholomine B及其異構(gòu)，裂解規(guī)律如圖4所示。

圖4 化合物21的二級質(zhì)譜圖及其裂解途徑Fig.4 The MS2 spectrum and fragmentation pathway of compound 21 at negative ion mode

化合物22保留時間23.77、24.80 min，分子離子峰均為m/z461.088 3 [M-H]-，分子式為C25H18O9。MS/MS質(zhì)譜中裂解產(chǎn)生碎片m/z377.065 6 [M-H-C4H4O2]-、243.026 6 [M-H-C12H10O4]-，吡喃酮母核裂解產(chǎn)生典型碎片m/z159.043 6、135.045 1，參考文獻[19]推測化合物為inoscavin A及其異構(gòu)體。

化合物23保留時間26.44 min，分子離子峰為m/z473.086 4 [M-H]-，分子式為C26H18O9。二級質(zhì)譜分子離子峰失去1分子CO2產(chǎn)生碎片m/z429.096 3，分子離子峰裂解產(chǎn)生碎片m/z405.060 2 [M-H-C4H4O]-、283.057 8[M-H-C10H6O4]-、243.028 6[M-H-C13H10O4]-，得到hispidin母核進一步裂解產(chǎn)生碎片m/z217.048 1、159.044 6、135.046 8，參考文獻[20]推測化合物為hypholomine A。

化合物24保留時間26.60 min，分子離子峰為m/z351.046 9 [M-H]-，分子式為C19H12O7。二級質(zhì)譜分子離子峰裂解失去1分子二羥基苯(C6H4O2)產(chǎn)生特征碎片m/z243.029 6，特征碎片進一步裂解產(chǎn)生碎片m/z159.042 7、135.045 5，參考文獻[11]推測化合物為phellibaumin A。

化合物25保留時間27.42 min，分子離子峰為m/z379.046 8 [M-H]-，分子式為C20H12O8。MS/MS質(zhì)譜中裂解產(chǎn)生碎片m/z335.051 1 [M-H-CO2]-、269.003 4 [M-H-C6H6O2]-，分子離子峰失去1分子二羥基苯甲酸基得到特征碎片m/z243.026 6 [M-H-C8H7O3]-，特征碎片進一步裂解產(chǎn)生碎片m/z159.044 9、135.045 1，參考文獻[21]推測化合物為phelligridin D。

化合物26保留時間28.13 min，分子離子峰為m/z477.121 8 [M-H]-，分子式為C26H22O9。MS/MS質(zhì)譜中分子離子峰裂解失去1分子甲基和1分子氧產(chǎn)生碎片m/z446.094 0 [M-H-CH3O]-，失去1分子甲基和1分子異丙酮基得到碎片m/z405.057 2 [M-H-C3H5O-CH3]-，碎片繼續(xù)失去1分子CO得到碎片m/z377.066 2，進一步裂解得到特征碎片m/z243.024 8，母核裂解產(chǎn)生碎片m/z159.045 7，參考文獻[21]推測化合物為phelligridin F。

化合物27保留時間28.21 min，分子離子峰為m/z419.078 4 [M-H]-，分子式為C23H16O8。MS/MS質(zhì)譜中裂解產(chǎn)生碎片m/z403.039 6 [M-H-OH]-、377.070 1 [M-H-C2H2O]-、283.058 4 [M-H-C7H4O3]-，分子離子峰失去1分子Hispolon得到特征碎片m/z243.028 3 [M-H-C10H8O3]-，特征碎片繼續(xù)裂解產(chǎn)生碎片m/z159.044 3，根據(jù)二級質(zhì)譜裂解碎片，參考文獻[22]推測化合物為inoscavin C。

化合物28保留時間28.57 min，分子離子峰為m/z395.076 7 [M-H]-，分子式為C21H16O8。MS/MS質(zhì)譜中裂解產(chǎn)生碎片m/z363.052 8 [M-H-2OH]-、285.043 5 [M-H-C6H6O2]-，母離子失去1分子甲基和1分子二羥基苯甲醛基得到特征碎片m/z243.028 4 [M-H-C8H6O3]-，母核繼續(xù)裂解產(chǎn)生碎片m/z159.044 3、135.043 0，參考文獻[22]推測化合物為inoscavin D。

化合物29保留時間28.68 min，分子離子峰為m/z623.082 9 [M-H]-，分子式為C33H20O13。MS/MS質(zhì)譜中裂解產(chǎn)生碎片m/z579.078 8 [M-H-CO2]-、535.322 6 [M-H-2CO2]-、419.036 3 [M-H-C10H4O5]-，母離子失去1分子二羥基苯甲醛和1分子hispidin得到特征碎片m/z243.028 4 [M-H-C20H12O8]-，母核裂解產(chǎn)生碎片m/z159.044 3、135.043 0，參考文獻[23]推測化合物為phelligridin I(inonoblin A)。

化合物30保留時間29.57 min，分子離子峰為m/z363.050 8 [M-H]-，分子式為C20H12O7。MS/MS質(zhì)譜中裂解產(chǎn)生碎片m/z345.227 0 [M-H-OH]-、281.140 0 [M-H-C4H3O2]-、227.125 6 [M-H-C7H4O3]-、159.044 3[M-H-C23H12O11]-、135.043 0，根據(jù)裂解規(guī)律并參考文獻[21]推測化合物為phelligridin C。

化合物31保留時間30.32 min，分子離子峰為m/z435.108 7 [M-H]-，分子式C24H20O8。MS/MS質(zhì)譜中產(chǎn)生碎片m/z403.083 0[M-H-CH3-OH]-、273.073 2 [M-H-C9H6O3]-、243.028 9[M-H-C11H12O3]-、159.044 3、135.043 0，參考文獻[22]推測化合物為inoscavin B。

2.2.4 黃酮類化合物

野生楊樹桑黃中黃酮化合物主要是以柚皮素和二氫莰非素為母核的化合物及其衍生物，裂解規(guī)律相似，母核裂解產(chǎn)生黃酮典型碎片m/z151、119，而栽培楊樹桑黃子實體中未發(fā)現(xiàn)典型黃酮化合物。

化合物32保留時間17.81 min，分子離子峰為m/z287.056 1 [M-H]-，元素組成分析分子式為C15H12O6，二級質(zhì)譜中產(chǎn)生特征碎片m/z259.061 3 [M-H-CO]-，進一步失去1分子羥基得到碎片m/z243.029 6，母核進一步裂解產(chǎn)生碎片m/z151.001 6，參考文獻[24]推測化合物為二氫莰非素。

化合物33保留時間23.98 min，分子離子峰m/z271.061 2 [M-H]-，分子式為C15H12O5，二倍分子量為543.128 8 [2M-H]-。二級質(zhì)譜碎片失去1分子CO得到碎片離子m/z243.029 7，母核進一步裂解失去碎片離子C4H8O4和CH3OH，分別得到典型黃酮碎片離子m/z151.003 0、119.050 5，參考文獻[24]推測其為柚皮素。

化合物34保留時間25.87、27.10 min，分子離子峰均為m/z301.0711 [M-H]-，分子式為C16H14O6。二級質(zhì)譜由分子離子失去1分子CH3產(chǎn)生碎片離子m/z285.038 7，母離子失去1分子CO產(chǎn)生特征碎片離子m/z273.076 3，母離子進一步裂解產(chǎn)生黃酮裂解產(chǎn)生的典型碎片m/z178.996 1、151.001 4，參考文獻[20]推測其為橙皮素及其異構(gòu)體7-甲基圣草酚。

化合物35保留時間27.78 min，分子離子峰m/z393.096 0 [M-H]-，分子式為C22H18O7，二級質(zhì)譜由分子離子峰失去1分子鄰羥基甲苯(C7H6O-)得到碎片m/z287.054 2，母核離子分別失去1分子CO和1分子CO2得到碎片離子m/z259.060 7、243.026 9，母核離子進一步裂解得到典型黃酮碎片離子m/z151.002 8、119.049 3，參考文獻[11]中報道桑黃子實體中出現(xiàn)的二羥基甲苯基團均為鄰羥基甲苯，由此推測化合物可能為3,5,7-trihydroxy-6-(2-hydroxybenzyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-2,3-dihydro-4H-chromen-4-one(phelligrin D)。

化合物36保留時間29.82 min，野生子實體中出現(xiàn)的最強離子峰，分子離子峰為m/z285.076 5 [M-H]-，分子式為C16H14O5，二級質(zhì)譜由分子離子峰失去1分子甲基得到碎片m/z271.060 6，母核離子繼續(xù)失去1分子CO得到碎片離子m/z243.027 2，分子離子峰裂解失去C4H8O4得到碎片m/z165.017 2，母核離子繼續(xù)裂解產(chǎn)生典型黃酮碎片離子m/z151.002 4、119.049 4，參考文獻[24]推測其為櫻花亭。

化合物37保留時間32.62 min，分子離子峰m/z377.104 5 [M-H]-，分子式為C22H18O6，二級質(zhì)譜由分子離子峰失去1分子鄰羥基苯得到碎片m/z283.060 3，母離子失去1分子鄰羥基甲苯得到碎片m/z271.061 4，母核離子裂解產(chǎn)生典型黃酮碎片離子m/z151.002 7、119.049 3，參考文獻[11]推測其為phelligrin A或B。

化合物38保留時間32.84、33.42 min，分子離子峰均為m/z391.118 9 [M-H]-，分子式為C23H20O6，推測其為同分異構(gòu)體，該化合物與化合物37僅相差1分子甲基，同時二級質(zhì)譜裂解產(chǎn)生碎片與phelligrin A或B基本一致，參考文獻[11]推測化合物為methylphelligrin A或B。

化合物39保留時間33.54 min，分子離子峰m/z499.139 3[M-H]-，分子式為C29H24O8，與化合物35分子量相差106(C7H6O)，即推測與化合物35相差1分子鄰羥基甲苯，二級質(zhì)譜裂解規(guī)律與化合物35基本相似，產(chǎn)生典型黃酮碎片，推測化合物為3,5,7-trihydroxy-6,8-bis(2-hydroxybenzyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-2,3-dihydro-4H-chromen-4-one(phelligrin E)。

化合物40保留時間為37.10 min，分子離子峰為m/z483.143 3 [M-H]-，分子式為C29H24O7，該化合物與化合物37分子量相差106，即推測可能相差為1分子鄰羥基甲苯，同時二級質(zhì)譜裂解產(chǎn)生碎片與phelligrin A或B基本一致，參考文獻[11]推測化合物為5,7-dihydroxy-6,8-bis(2-hydroxybenzyl)-2-(4-hydroxyphenyl)-2,3-dihydro-4H-chromen-4-one(phelligrin C)，化合物二級質(zhì)譜圖及裂解規(guī)律如圖5所示。

圖5 化合物40的二級質(zhì)譜圖及其裂解途徑Fig.5 The MS2 spectrum and fragmentation pathway (right) of compound 40 at negative ion mode

3 結(jié)論

本研究采用超高效液相色譜-四級桿-飛行時間質(zhì)譜(UPLC-QTOF-MS)對野生和栽培楊樹桑黃子實體乙醇提取物中的化學(xué)成分進行系統(tǒng)分析，桑黃中多酚、黃酮化合物含有多個酚羥基，呈酸性，在負離子模式下具有較高的離子化效率，因此選擇負離子模式并結(jié)合相關(guān)文獻對其成分結(jié)構(gòu)進行推測，結(jié)果從野生和栽培楊樹桑黃子實體乙醇提取物中鑒定出小分子有機酸8個、兒茶素類3個、吡喃酮類20個、黃酮9個，其中phelligrins C～E 3個黃酮化合物推測可能為新化合物，均為phelligrin A或B的同系物，準確結(jié)構(gòu)還需進一步鑒定。野生和栽培子實體中共有成分14個，其中11個為吡喃酮酚類成分。

分析結(jié)果顯示野生楊樹桑黃子實體中含有豐富的黃酮、兒茶素類和吡喃酮類化合物，且出現(xiàn)多個同分異構(gòu)現(xiàn)象，而栽培桑黃子實體中主要是吡喃酮和小分子有機酸化合物，均未發(fā)現(xiàn)典型黃酮及兒茶素類化合物，結(jié)合文獻[5]報道的總酚含量與腫瘤細胞增殖抑制和體外抗氧化能力趨勢一致，且栽培子實體的活性高于野生子實體，本次UPLC-QTOF-MS分析結(jié)果顯示栽培子實體中吡喃酮酚類物質(zhì)的相對峰面積明顯高于野生子實體，且木屑栽培略高于木段栽培子實體，綜合分析認為吡喃酮酚類化合物是野生和栽培子實體中的主要活性成分之一，主要包括化合物hispidin和4-(3,4-二羥基苯基)-3-丁烯-2-酮、phelligridimer A、davallialactone、hypholomine B、inoscavin A和B，且化合物davallialactone和hypholomine B在楊樹桑黃子實體中含量較高，表現(xiàn)出良好的抗氧化、腫瘤細胞增殖抑制和降血糖活性[25，26]。在楊樹桑黃子實體質(zhì)量標(biāo)準制定中建議將總酚含量結(jié)合吡喃酮化合物davallialactone和hypholomine B作為質(zhì)量標(biāo)準的指標(biāo)成分，完善桑黃的質(zhì)量標(biāo)準控制體系。本研究可以為楊樹桑黃子實體的質(zhì)量標(biāo)準提升和功能研究奠定了理論基礎(chǔ)。