田 莉胡月明崔海軍趙濟華

(1.河北省唐山中心醫(yī)院病理科,河北 唐山 063000;2.河北省唐山市工人醫(yī)院泌尿外科,河北 唐山 063000;3.華北理工大學臨床醫(yī)學院,河北 唐山 063210)

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

36只清潔級BALB/c-nu/nu無胸腺雄性裸鼠,3周齡,體重(18.5±2.4)g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2019-0009],飼養(yǎng)在華北理工大學實驗動物中心[SYXK(冀)2020-012]。飼養(yǎng)條件:白晝、黑夜交替,各12 h,溫度23℃～27℃,自由進食和喝水。本實驗嚴格按照3R原則進行,并通過了唐山中心醫(yī)院倫理會批準(20200034)。

1.1.2 細胞

前列腺癌細胞系PC-3M來自中國科學院上海細胞庫。

1.1.3 臨床資料

選取25例于2017年5月至2018年12月在本院行手術治療的前列腺癌患者為研究對象,前列腺癌的診斷符合原發(fā)性前列腺癌的診斷標準,且經(jīng)HE染色病理確診(圖1A)。患者年齡46～78歲,平均年齡(65.24±5.87)歲。臨床分期Ⅰ期、Ⅱ期和Ⅲ期患者分別為3、8和14例;淋巴結轉(zhuǎn)移、未轉(zhuǎn)移患者分別為18、7例。排除標準:(1)同時患有其他惡性腫瘤的患者;(2)重要臟器如心臟、腎、肝等臟器功能障礙者;(3)合并自身免疫系統(tǒng)疾病、心血管疾病等患者。所有患者術前未接受任何治療。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則。采用實時熒光定量聚合酶鏈式反應(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測前列腺癌組織及癌旁組織中OSTN-AS1和miR-330表達水平。

事實上，在中國白酒國際化的進程中，茅臺、五糧液等名優(yōu)酒企從未停止過開拓海外市場的步伐，也為此付出了巨大的努力。但從整體來看，白酒不管從銷量、宣傳、認識度上都只占海外酒業(yè)市場上極其微小的一部分，以至于在海外酒業(yè)市場調(diào)查數(shù)據(jù)中有關中國白酒的數(shù)據(jù)和資料少之又少。這是因為即使有大企業(yè)去進軍海外市場的行為，但由于海外市場推廣的花費巨大，這些大企業(yè)充其量只是在海外宣傳了自身的品牌，讓海外酒業(yè)市場上多了自家產(chǎn)品的銷售，但并沒有真正將“中國白酒”這一品牌概念刻入海外消費者心中，沒能實質(zhì)性地提高白酒的競爭力。綜上所述，大酒企并不能承擔起“大豬”這一角色。

1.2 主要試劑與儀器

胎牛血清購自美國Hycolne公司;RPMI 1640培養(yǎng)基、細胞周期檢測試劑盒和雙熒光素酶活性檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;TRIzol試劑和LipofectamineTM2000試劑盒購自美國Invitrogen公司;OSTN-AS1小干擾RNA(si-OSTN-AS1)、亂序無意義陰性序列(si-NC)、miR-330抑制劑(anti-miR-330)和模擬物(mimcs)、抑制劑陰性序列(anti-miR-NC)、模擬對照序列(miR-NC)、引物序列、熒光素酶報告載體購自上海吉瑪制藥技術有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司;QP-50 CO2培養(yǎng)箱,山東濟南鑫貝西生物技術有限公司;GeneAmp970型PCR儀,美國Applied Biosystems公司;FACSCalibur型流式細胞儀,美國BD公司;CKX41型倒置顯微鏡,日本Olympus公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染

用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)培養(yǎng)PC-3M細胞。于6孔板中培養(yǎng)PC-3M細胞(2.5×104個/孔),培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)基。將LipofectamineTM2000試劑分別與si-OSTN-AS1(si-OSTN-AS1組)、si-NC(si-NC組)、anti-miR-330(antimiR-330組)、anti-miR-NC(anti-miR-NC組)、si-OSTN-AS1和anti-miR-330(si-OSTN-AS1+anti-miR-330組)、si-OSTN-AS1和anti-miR-NC(si-OSTN-AS1+anti-miR-NC組)混合均勻,加入6孔板中,孵育細胞6 h。然后更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,RT-qPCR法檢測OSTN-AS1或miR-330表達驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.3.2 RT-qPCR法檢測OSTN-AS1、miR-330和基質(zhì)金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)mRNA表達

TRIzol試劑提取組織或細胞中總RNA,然后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后,行PCR擴增。引物序列:OSTN-AS1上 游5’-AGCTGAGAGTCTGTCAAGGG-3’,下游5’-CTTCACAAGGCAGCAGGAAG-3’;miR-330上游5’-GTGCTGCGATGTTGCGAAACCCG-3’,下游5’-CGCGGCCTAGATTCGATCGTAG-3’;MMP-2上游5’-CCACAAGCCACGAGTTTTCa-3’,下游5’-TTGGGCTTTAGAGGGGATGG-3’;GAPDH上游5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’,下 游5’-ATGGC ATGGACTGTGGTCAT-3’;U6上 游5’-GCTTCGGC AGCACATATACTAAAAT-3’,下 游5’-CGCTTCAC GAATTTGCGTGTCAT-3’。2-△△Ct法計算OSTN-AS1和MMP-2 mRNA相對GAPDH、miR-330相對U6的表達量。

1.3.3 流式細胞儀檢測細胞周期

于24孔板中培養(yǎng)各組細胞(2.5×104個/孔),每組設3個復孔。培養(yǎng)24 h后,收集細胞。加70%冰乙醇固定,4℃過夜。4℃、800 r/min離心,棄上清。加入PBS清洗細胞2次。加入400 μL結合緩沖液,重懸細胞。加入50 μL RNA酶,37℃孵育30 min。在避光環(huán)境下加入50 μL碘化丙啶,并孵育30 min,最后用流式細胞儀檢測細胞周期。

1.3.4 克隆形成實驗

于24孔板中培養(yǎng)各組細胞(2.5×104個/孔),每組設3個復孔。培養(yǎng)14 d,棄培養(yǎng)基。將細胞放置在多聚甲醛進行固定,時間30 min。然后再置于結晶紫染色液中進行染色,時間20 min。用PBS清洗細胞后,顯微鏡觀察,記數(shù)。

1.3.5 Transwell檢測細胞遷移和侵襲

遷移實驗:于Transwell小室上室加100 μL各組細胞懸液(每mL 5×104個),下室加500 μL完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)基。將細胞放置在多聚甲醛溶液中進行固定,時間30 min。然后再置于結晶紫染色液中進行染色,時間20 min。用PBS清洗細胞后,顯微鏡觀察,計數(shù)。侵襲實驗:預先于Transwell小室上室鋪Matrigel基質(zhì)膠鋪,自然晾干后,再加100 μL細胞懸液,剩余操作同遷移實驗。

1.3.6 雙熒光素酶報告基因?qū)嶒烌炞COSTN-AS1與miR-330及miR-330與MMP-2靶向關系

OSTN-AS1、MMP-2的野生型(WT)和突變型(MUT)由上海吉瑪制藥技術公司設計并制備,并克隆到pMIR-Report質(zhì)粒中,分別命名為WT-OSTNAS1、MUT-OSTN-AS1、WT-MMP-2、MUT-MMP-2。將PC-3M細胞接種于24孔板中(2.5×104個/孔),培養(yǎng)24 h后,棄培養(yǎng)基。將LipofectamineTM2000試劑分別與WT-OSTN-AS1(或MUT-OSTN-AS1)和miR-330 mimics(或miR-NC)、WT-MMP-2(或MUT-MMP-2)和miR-330 mimics(或miR-NC)混合均勻,加入6孔板中,孵育細胞6 h。更換培養(yǎng)基,再培養(yǎng)24 h,棄培養(yǎng)基,將細胞進行裂解處理。用離心機(半徑10 cm)將細胞裂解液離心(3500 r/min,10 min)后,20 μL取上清液,分別加100 μL 1×螢火蟲或海腎熒光素酶反應工作液,振蕩混勻,用GENios Pro多功能酶標儀檢測螢火蟲或海腎的熒光強度。細胞熒光素酶活性以螢火蟲熒光強度與海腎熒光強度的比值表示。

1.3.7 裸鼠移植瘤實驗

將si-NC組、si-OSTN-AS1組、anti-miR-NC組、anti-miR-330組、si-OSTN-AS1+anti-miR-NC組、si-OSTN-AS1+anti-miR-330組PC-3M細胞密度調(diào)整為每mL 2.0×107個,均以0.1 mL接種至裸鼠皮下,每組6只。自觀察到肉眼可見的腫瘤時,常規(guī)飼養(yǎng)4周。處死裸鼠后剝離腫瘤,稱重。

1.4 統(tǒng)計學分析

SPSS 22.0軟件分析實驗數(shù)據(jù)。計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)表示。前列腺癌組織和癌旁組織中OSTN-AS1與miR-330表達的比較及細胞熒光素活性的比較均采用獨立樣本t檢驗;si-NC組、si-OSTN-AS1組、anti-miR-NC組、anti-miR-330組、si-OSTN-AS1+anti-miR-NC組和si-OSTN-AS1+antimiR-33組各檢測指標均首先采用單因素方差分析,進一步組間兩兩比較用SNK-q檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OSTN-AS1和miR-330在前列腺癌組織中的表達

HE染色顯示前列腺癌旁組織由導管和腺泡組成,其上皮排列有兩層細胞,內(nèi)層為表面的分泌細胞,外層為位于基底膜和內(nèi)層上皮之間的底層細胞;各分區(qū)的導管、腺泡的結構和上皮形狀差別不大。前列腺癌組織分泌細胞具有明顯異型性,且形態(tài)多樣;基底部基底細胞局限性缺失,腺體局部細胞向間質(zhì)浸潤(圖1A);RT-qPCR法檢測前列腺癌組織及癌旁組織中OSTN-AS1和miR-330表達,結果顯示,前列腺癌組織中OSTN-AS1表達高于癌房組織(P＜0.05),而miR-330表達低于癌房組織(P＜0.05)。結果說明,OSTN-AS1在前列腺癌組織中呈高表達,而miR-330呈低表達(圖1B、1C)。

圖1 癌旁組織和癌組織的HE染色結果及OSTN-AS1和miR-330在前列腺癌組織中的表達(±s,n=25)Note.A,Localized loss of basal cells at the base of prostate cancer tissue,and local cells infiltrating into the interstitium of the glands.B,Expression of OSTN-AS1 in prostate cancer tissue increased.C,Expression of miR-330 in prostate cancer tissue decreased.Compared with the adjacent tissues,*P＜0.05.Figure 1 Results of HE staining of adjacent tissues and cancerous tissuesand the expression of OSTN-AS1 and miR-330 in prostate cancer tissue

2.2 PCR檢測PC-3M細胞中OSTN-AS1、miR-330和MMP-2 mRNA的表達水平

RT-qPCR法檢測si-OSTN-AS1或anti-miR-330轉(zhuǎn)染效率,結果顯示,si-OSTN-AS1組PC-3M細胞中OSTN-AS1表達明顯低于si-NC組(P＜0.05),antimiR-330組PC-3M細胞中miR-330表達明顯低于anti-miR-NC組(P＜0.05),說明下調(diào)OSTN-AS1或下調(diào)miR-330表達的PC-3M細胞構建成功。RTqPCR法檢測下調(diào)OSTN-AS1、下調(diào)miR-330或同時下調(diào)OSTN-AS1與miR-330后PC-3M細胞中miR-330或MMP-2 mRNA表達,結果顯示,下調(diào)OSTNAS1的PC-3M細胞中miR-330表達升高,而MMP-2 mRNA表達降低,說明下調(diào)OSTN-AS1可促進PC-3M細胞中miR-330表達,而抑制MMP-2 mRNA表達;而下調(diào)miR-330的PC-3M細胞中MMP-2 mRNA表達升高,說明下調(diào)miR-330可促進PC-3M細胞中MMP-2 mRNA表達;同時下調(diào)OSTN-AS1和miR-330的PC-3M細胞中MMP-2 mRNA表達與僅下調(diào)OSTN-AS1的細胞比較升高(P＜0.05),說明下調(diào)miR-330逆轉(zhuǎn)下調(diào)OSTN-AS1對PC-3M細胞中MMP-2 mRNA表達的抑制作用(圖2)。

2.3 克隆形成實驗檢測PC-3M細胞克隆形成數(shù)和流式細胞儀檢測PC-3M細胞周期

流式細胞儀、克隆形成實驗分別檢測下調(diào)OSTNAS1、下調(diào)miR-330或同時下調(diào)OSTN-AS1與miR-330對PC-3M細胞的細胞周期及克隆形成的影響,結果顯示,下調(diào)OSTN-AS1后,PC-3M細胞的細胞周期阻滯,克隆形成數(shù)降低,說明下調(diào)OSTN-AS1可阻礙PC-3M細胞的細胞周期進程,抑制細胞增殖;下調(diào)miR-330后,PC-3M細胞的細胞周期進程加快,克隆形成數(shù)升高,說明下調(diào)miR-330促進PC-3M細胞的細胞周期進程,并促進細胞增殖。與僅下調(diào)OSTN-AS1的PC-3M細胞比較,同時下調(diào)OSTN-AS1與miR-330的PC-3M細胞的細胞周期進程加快,克隆形成數(shù)升高,說明下調(diào)miR-330逆轉(zhuǎn)下調(diào)OSTN-AS1對PC-3M細胞周期及克隆形成的影響(圖3、表1)。

表1 各組PC-3M細胞的細胞周期及克隆形成數(shù)(±s,n=3)Table 1 Cell cycle changes and clone formation number of PC-3M cells in each group

表1 各組PC-3M細胞的細胞周期及克隆形成數(shù)(±s,n=3)Table 1 Cell cycle changes and clone formation number of PC-3M cells in each group

注:與si-NC組相比,*P＜0.05;與anti-miR-NC組相比,#P＜0.05;與si-OSTN-AS1+anti-miR-NC組相比,&P＜0.05。Note.Compared with the si-NC group,*P＜0.05.Compared with the anti-miR-NC group,#P＜0.05.Compared with the si-OSTN-AS1+anti-miR-NC group,&P＜0.05.

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圖3 各組PC-3M細胞克隆形成數(shù)Figure 3 Colony formation number of PC-3M cells in each group

2.4 Transwell實驗檢測PC-3M細胞遷移和侵襲

Transwell分別檢測下調(diào)OSTN-AS1、下調(diào)miR-330或同時下調(diào)OSTN-AS1與miR-330對PC-3M細胞遷移和侵襲的影響,結果顯示,下調(diào)OSTN-AS1后,PC-3M細胞的遷移和侵襲數(shù)均降低,說明下調(diào)OSTN-AS1可抑制PC-3M細胞遷移和侵襲;下調(diào)miR-330后,PC-3M細胞的遷移和侵襲數(shù)均升高,說明下調(diào)miR-330促進PC-3M細胞遷移和侵襲。與僅下調(diào)OSTN-AS1的PC-3M細胞比較,同時下調(diào)OSTN-AS1與miR-330的PC-3M細胞遷移和侵襲數(shù)升高,說明下調(diào)miR-330逆轉(zhuǎn)下調(diào)OSTN-AS1對PC-3M細胞遷移和侵襲的抑制作用(圖4、表2)。

表2 各組PC-3M細胞遷移和侵襲數(shù)比較(±s,n=3)Table 2 Comparison of migration and invasion numbers of PC-3M cells in each group

表2 各組PC-3M細胞遷移和侵襲數(shù)比較(±s,n=3)Table 2 Comparison of migration and invasion numbers of PC-3M cells in each group

注:與si-NC組相比,*P＜0.05;與anti-miR-NC組相比,#P＜0.05;與si-OSTN-AS1+anti-miR-NC組相比,&P＜0.05。Note.Compared with the si-NC group,*P＜0.05.Compared with the anti-miR-NC group,#P＜0.05.Compared with the si-OSTN-AS1+anti-miR-NC group,&P＜0.05.

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圖4 Transwell檢測各組PC-3M細胞遷移和侵襲(結晶紫染色)Figure 4 Transwell detects the migration and invasion of PC-3M cells in each group(crystal violet staining)

2.5 雙熒光素酶報告實驗驗證OSTN-AS1、miR-330、MMP-2的靶向關系

生物信息學軟件預測顯示,OSTN-AS1與miR-330、MMP-2 3’UTR與miR-330的核苷酸序列具有連續(xù)結合位點(圖5)。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測OSTN-AS1與miR-330及miR-330與MMP-2的靶向關系,結果顯示,共轉(zhuǎn)染miR-330 mimics與WTOSTN-AS1或WT-MMP-2的PC-3M細胞熒光素酶活性明顯降低(P＜0.05),而共轉(zhuǎn)染miR-330 mimics與MUT-OSTN-AS1或MUT-MMP-2的PC-3M細胞熒光素酶活性無顯著變化(P＞0.05),說明OSTNAS1可靶向結合miR-330,MMP-2是miR-330的靶基因(表3)。

表3 熒光素酶活性檢測結果(±s,n=3)Table 3 Test results of luciferase activity

表3 熒光素酶活性檢測結果(±s,n=3)Table 3 Test results of luciferase activity

注:與miR-NC組相比,*P＜0.05。Note.Compared with the miR-NC group,*P＜0.05.

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圖5 OSTN-AS1與miR-330及miR-330與MMP-2的互補序列Note.A,Complementary sequence of OSTN-AS1 and miR-330.B,Complementary sequence of miR-330 and MMP-2.Figure 5 Complementary sequence of OSTN-AS1 and miR-330 or miR-330 and MMP-2

2.6 裸鼠移植瘤實驗檢測不同處理對裸鼠成瘤的影響

各組裸鼠飼養(yǎng)21 d后,剝離腫瘤,并對其稱重。結果顯示,下調(diào)OSTN-AS1后,裸鼠腫瘤重量降低,說明下調(diào)OSTN-AS1可抑制體內(nèi)腫瘤生長;下調(diào)miR-330后,裸鼠腫瘤重量增加,說明下調(diào)miR-330促進體內(nèi)腫瘤生長;而同時下調(diào)OSTN-AS1與miR-330后,裸鼠腫瘤重量增加,說明下調(diào)miR-330逆轉(zhuǎn)下調(diào)OSTN-AS1對裸鼠腫瘤生長的抑制作用(圖6、表4)。

表4 各個處理組小鼠中瘤重的檢測(±s,n=6)Table 4 Detection of tumor weight in each treatment group

表4 各個處理組小鼠中瘤重的檢測(±s,n=6)Table 4 Detection of tumor weight in each treatment group

注:與si-NC組相比,*P＜0.05;與anti-miR-NC組相比,#P＜0.05;與si-OSTN-AS1+anti-miR-NC組相比,&P＜0.05。Note.Compared with the si-NC group,*P＜0.05.Compared with the antimiR-NC group,#P＜0.05.Compared with the si-OSTN-AS1+anti-miR-NC group,&P＜0.05.

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圖6 各個處理組瘤重Figure 6 Tumor weight of each treatment group

3 討論

lncRNA是一類長度超過200 bp的小分子非編碼RNA,其競爭性吸附miRNA,調(diào)控miRNA靶基因的表達,進而發(fā)揮生物學作用。研究已表明,多種lncRNA參與調(diào)控前列腺癌細胞的惡性表型,與該腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。lncRNA PROX1-AS1[3]、lncRNA HCP5[4]等lncRNA在前列腺癌中表達升高,可分別通過競爭性吸附miR-647、miR-4656促進前列腺癌的發(fā)展進程。此外,lncRNA Erbb4-IR[5]、lncRNA MIR22HG等[6]lncRNA在前列腺癌中表達下調(diào),對前列腺癌的發(fā)展起抑制作用。OSTN-AS1是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA,目前對其在腫瘤中的研究較為少見。

Jiang等[1]報道稱,OSTN-AS1在前列腺癌組織中呈高表達,這與本研究結果一致,但Jiang并未探究OSTN-AS1對前列腺癌細胞惡性表型的影響。本研究通過轉(zhuǎn)染OSTN-AS1小干擾RNA下調(diào)前列腺癌細胞中表達,首次探究了OSTN-AS1對前列腺癌細胞惡性表型的影響,結果顯示,下調(diào)OSTN-AS1可明顯削弱體外前列腺癌細胞的克隆形成、遷移和侵襲能力,并使細胞周期阻滯,且下調(diào)OSTN-AS1抑制了裸鼠體內(nèi)腫瘤生長,這提示下調(diào)OSTN-AS1可抑制前列腺癌的發(fā)展進程,OSTN-AS1有可能是前列腺癌治療的分子靶點。

此外,本研究證實了OSTN-AS1可競爭性吸附并負調(diào)控miR-330表達,這在其他文獻中也尚未見報道。研究顯示,結直腸癌[7]、黑色素瘤[8]、非小細胞肺癌[9]等腫瘤中miR-330的表達降低,上調(diào)miR-330對這些腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲具有明顯抑制作用,miR-330作為抑癌基因參與這些腫瘤的發(fā)展進程。然而,Zhang等[10]研究顯示,miR-330在乳腺癌患者癌組織和血清中表達升高,可促進腋窩淋巴結轉(zhuǎn)移,是影響乳腺癌患者預后的重要因素,其在乳腺癌中發(fā)揮促癌基因作用。這說明miR-330可能在不同的腫瘤中發(fā)揮的作用不同。本研究結果顯示,下調(diào)miR-330促進體外前列腺癌細胞增殖、遷移和侵襲,與相關報道結果一致[11],且下調(diào)miR-330促進體內(nèi)腫瘤生長,說明miR-330作為抑癌基因參與前列腺癌的發(fā)展進程。本研究結果還顯示,下調(diào)miR-330逆轉(zhuǎn)了下調(diào)OSTN-AS1對體外PC-3M細胞增殖、遷移和侵襲的抑制作用及體內(nèi)腫瘤生長的抑制作用,提示OSTN-AS1可能通過負調(diào)控miR-330來促進前列腺癌的發(fā)展進程。

MMP-2是一種基質(zhì)金屬蛋白酶,可降解細胞外基質(zhì),促進細胞遷移和侵襲[12]。Yang等[13]研究顯示,miR-200a在人乳腺癌組織中明顯過表達,miR-200a的過表達通過促進MMP-2的轉(zhuǎn)錄促進了乳腺癌細胞侵襲。邱承俊等[14]研究顯示,MMP-2在前列腺癌PC3細胞表達升高,下調(diào)其表達可能通過下調(diào)血管內(nèi)皮生長因子和上調(diào)活化的半胱天冬酶-8的蛋白表達降低了PC3細胞的增殖、侵襲和遷移。本研究首先利用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了MMP-2是miR-330的靶基因,且下調(diào)OSTN-AS1抑制前列腺癌細胞中MMP-2的表達,且下調(diào)miR-330降低可下調(diào)OSTN-AS1對前列腺癌細胞中MMP-2表達的抑制作用,進一步提示提示OSTN-AS1通過調(diào)控miR-330/MMP-2軸來抑制PC-3M細胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述,前列腺癌組織中OSTN-AS1呈高表達,而miR-330呈低表達;下調(diào)OSTN-AS1顯著降低體外前列腺癌PC-3M細胞的增殖、遷移和侵襲性及體內(nèi)腫瘤生長,其作用機制可能與調(diào)控miR-330/MMP-2軸有關,有可能成為前列腺癌治療的分子靶點。