張 昆孫 洋翟所鍇楊 光

(淄博市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科,山東 淄博 255200)

肺癌是臨床常見的一種惡性腫瘤,我國肺癌發(fā)病率逐年上升,其主要類型包括小細(xì)胞肺癌與非小細(xì)胞肺癌,其中小細(xì)胞肺癌具有高度侵襲性及轉(zhuǎn)移能力,進(jìn)而導(dǎo)致治療效果降低,針對小細(xì)胞肺癌晚期患者,臨床主要采用化療方式進(jìn)行治療,但化療耐藥性是降低治療效果的重要原因,然而目前關(guān)于化療耐藥性發(fā)生機(jī)制尚未闡明[1-4]。長鏈非編碼RNA HOXA-AS3(lncRNA HOXA-AS3)在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高,并可調(diào)控HOXA3表達(dá)從而增強(qiáng)細(xì)胞順鉑耐藥性[5]。生物信息學(xué)分析顯示微小RNA-340-5p(miR-340-5p)在結(jié)腸癌細(xì)胞中表達(dá)水平降低,lncRNA LINC00662通過競爭性結(jié)合miR-340-5p而降低其表達(dá)水平從而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移[6]。因此,本研究采用順鉑濃度遞增法建立小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥細(xì)胞株,探究HOXAAS3對DMS114/DDP細(xì)胞增殖、凋亡的影響及其對miR-340-5p的調(diào)控作用。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞

人小細(xì)胞肺癌細(xì)胞DMS114購自南京科佰生物科技有限公司。

1.1.2 組織材料

肺癌組織及癌旁組織:選取2017年1月至2019年1月本院收治的30例肺癌患者為研究對象,所有患者均經(jīng)手術(shù)、穿刺活檢或支氣管鏡活檢證實(shí)為小細(xì)胞肺癌,術(shù)前均未接受放化療,其中男16例,女14例,年齡40～70歲,平均年齡(55.63±6.35)歲,術(shù)中切除肺癌組織及癌旁組織,置于-80℃超低溫冰箱內(nèi)保存。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)(院字(2016)12號),所有患者知情且簽署同意書。

1.2 主要試劑與儀器

順鉑購自上海華聯(lián)制藥公司;DMEM培養(yǎng)基與胎牛血清購自美國Gibco公司;Lipofectamine2000、TRIzol試劑、qRT-PCR檢測試劑盒與cDNA合成試劑盒購自美國Thermo Fisher公司;si-NC、si-HOXAAS3、miR-NC、miR-340-5p mimcs、anti-miR-NC、antimiR-340-5p購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司;CCK-8檢測試劑盒購自北京智杰方遠(yuǎn)科技有限公司;凋亡試劑盒購自美國Sigma公司;兔抗人CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax抗體購自美國Santa Cruz公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組

建立DMS114/DDP細(xì)胞:采用順鉑濃度遞增的方法建立耐藥細(xì)胞系,從低濃度的順鉑開始處理DMS114細(xì)胞,培養(yǎng)48 h,棄培養(yǎng)液,更換不含藥物的培養(yǎng)液,每隔2 d更換1次培養(yǎng)液,待細(xì)胞恢復(fù)生長后增加順鉑劑量,繼續(xù)處理DMS114細(xì)胞,直至順鉑濃度為0.5 mg/L,細(xì)胞可穩(wěn)定生長,成功構(gòu)建耐藥細(xì)胞DMS114/DDP細(xì)胞[7]。DMS114細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),每隔2 d更換1次培養(yǎng)液。取對數(shù)生長期DMS114/DDP細(xì)胞,分別將si-NC、si-HOXA-AS3、si-HOXA-AS3與anti-miR-NC、si-HOXA-AS3與antimiR-340-5p轉(zhuǎn)染至DMS114/DDP細(xì)胞,分別記作si-NC組、si-HOXA-AS3組、si-HOXA-AS3+anti-miRNC組、si-HOXA-AS3+anti-miR-340-5p組。

1.3.2 qRT-PCR檢測HOXA-AS3、miR-340-5p的表達(dá)水平

采用TRIzol法提取癌旁組織、肺癌組織、DMS114細(xì)胞、DMS114/DDP細(xì)胞及各組轉(zhuǎn)染后的DMS114/DDP細(xì)胞總RNA,將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng),應(yīng)用美國ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀檢測HOXA-AS3、miR-340-5p相對表達(dá)量。

1.3.3 CCK-8法檢測細(xì)胞存活率及IC50值

取DMS114細(xì)胞、DMS114/DDP細(xì)胞接種于96孔板(1×104個/孔),采用不同濃度(5、15、30、45、60 μmol/L)的順鉑處理細(xì)胞24 h[8],加入CCK-8溶液10 μL后培養(yǎng)2 h,檢測光密度值(OD值)。應(yīng)用Msvbvm50軟件計(jì)算細(xì)胞抑制率為50%時(shí)的順鉑濃度即順鉑IC50值。各組DMS114/DDP細(xì)胞于轉(zhuǎn)染24、48、72 h時(shí)加入CCK-8溶液10 μL后繼續(xù)培養(yǎng)2 h,檢測OD值。

1.3.4 檢測細(xì)胞凋亡率

取各組DMS114/DDP細(xì)胞,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率,將預(yù)冷PBS加入各組DMS114/DDP細(xì)胞后棄上清,細(xì)胞沉淀中加入500 μL Binding Buffer懸浮細(xì)胞,按照試劑盒說明書檢測細(xì)胞凋亡率。

1.3.5 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測HOXA-AS3與miR-340-5p的靶向關(guān)系

LncBase Predicted v.2預(yù)測顯示HOXA-AS3與miR-340-5p存在結(jié)合位點(diǎn),分別構(gòu)建野生型載體WT-HOXA-AS3與突變型載體MUT-HOXA-AS3,分別將miR-NC、miR-340-5p mimics與WT-HOXAAS3、MUT-HOXA-AS3共轉(zhuǎn)染至DMS114/DDP細(xì)胞后檢測細(xì)胞熒光素酶活性。

1.3.6 Western blot檢測CyclinD1、Bcl-2、p21、Bax蛋白表達(dá)

DMS114/DDP細(xì)胞加入RIPA蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白,SDS-PAGE分離蛋白,轉(zhuǎn)膜、封閉,分別加入一抗稀釋液(1∶1000)與二抗稀釋液(1∶5000),室溫孵育1 h,ECL顯影,應(yīng)用Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù),計(jì)量資料以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示且均符合正態(tài)分布,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 lncRNA HOXA-AS3和miR-340-5p在肺癌組織中的表達(dá)

與癌旁組織比較,肺癌組織中HOXA-AS3的表達(dá)水平升高(P＜0.05),miR-340-5p的表達(dá)水平降低(P＜0.05),見圖1。

圖1 lncRNA HOXA-AS3和miR-340-5p在肺癌組織中的表達(dá)(±s,n=30)Note.Compared with para-carcinoma tissue,*P＜0.05.Figure 1 Expression of lncRNA HOXA-AS3 and miR-340-5p in lung cancer tissues

2.2 順鉑對小細(xì)胞肺癌DMS114和DMS114/DDP細(xì)胞活性的影響

與對照組比較,不同濃度的順鉑處理后DMS114細(xì)胞、DMS114/DDP細(xì)胞存活率逐漸降低(P＜0.05),且DMS114/DDP細(xì)胞存活率高于DMS114細(xì)胞;與DMS114細(xì)胞比較,DMS114/DDP細(xì)胞IC50值升高(P＜0.05),見圖2。

圖2 順鉑對小細(xì)胞肺癌DMS114和DMS114/DDP細(xì)胞存活率的影響(±s,n=9)Note.Compared with the Control group,*P＜0.05.Compared with DMS114,#P＜0.05.Figure 2 Effect of cisplatin on the survival rate of small cell lung cancer DMS114 and DMS114/DDP cells

2.3 lncRNA HOXA-AS3在DMS114和DMS114/DDP細(xì)胞中的表達(dá)

與DMS114細(xì)胞比較,DMS114/DDP細(xì)胞中HOXA-AS3的表達(dá)水平升高(P＜0.05),見圖3。

圖3 lncRNAHOXA-AS3在DMS114和DMS114/DDP細(xì)胞中的表達(dá)(±s,n=9)Note.Compared with DMS114,*P＜0.05.Figure 3 Expression of lncRNAHOXA-AS3 in DMS114 and DMS114/DDP cells

2.4 干擾lncRNA HOXA-AS3對DMS114/DDP細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與si-NC組比較,轉(zhuǎn)染si-HOXA-AS3后細(xì)胞活力降低(P＜0.05),并可提高凋亡率及p21、Bax蛋白水平(P＜0.05),降低CyclinD1、Bcl-2蛋白水平(P＜0.05),見圖4。

2.5 lncRNA HOXA-AS3靶向調(diào)控miR-340-5p的表達(dá)

LncBase Predicted v.2預(yù)測顯示HOXA-AS3與miR-340-5p存在結(jié)合位點(diǎn),見圖5A。miR-340-5p過表達(dá)可降低WT-HOXA-AS3的熒光素酶活性(P＜0.05),而對MUT-HOXA-AS3熒光素酶活 性 無 明 顯 影 響(P＞0.05),見圖5B。與pcDNA組比較,pcDNA-HOXA-AS3組miR-340-5p的表達(dá)水平降低(P＜0.05);與si-NC組比較,si-HOXA-AS3組miR-340-5p的 表 達(dá) 水 平 升 高(P＜0.05),見圖5C。

圖5 lncRNA HOXA-AS3靶向調(diào)控miR-340-5p的表達(dá)(ˉx±s,n=9)Note.A,Sequence of lncRNA HOXA-AS3 contains a nucleotide sequence complementary to miR-340-5p.B,Double luciferase report experiment.C,lncRNA HOXA-AS3 regulated the expression of miR-340-5p.Compared with miR-NC group,*P＜0.05.Compared with pcDNA group,#P＜0.05.Compared with si-NC group,&P＜0.05.Figure 5 lncRNA HOXA-AS3 targeted the expression of miR-340-5p

2.6 抑制miR-340-5p可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA HOXAAS3對DMS114/DDP增殖和凋亡的影響

與si-HOXA-AS3+anti-miR-NC組比較,共轉(zhuǎn)染si-HOXA-AS3+anti-miR-340-5p后細(xì)胞活力升高(P＜0.05),并可降低凋亡率及p21、Bax蛋白水平(P＜0.05),提高CyclinD1、Bcl-2蛋白水平(P＜0.05),見圖6。

圖6 抑制miR-340-5p可逆轉(zhuǎn)干擾lncRNA HOXA-AS3對DMS114/DDP增殖和凋亡的影響(±s,n=9)Note.A,Expression level of miR-340-5p.B,Cell proliferation.C,D,Cell apoptosis.E,F,Expression of proliferation and apoptosis-related proteins.Compared with si-HOXA-AS3+anti-miR-NC group,*P＜0.05.Figure 6 Inhibition of miR-340-5p could reverse the effect of interference lncRNA HOXA-AS3 on DMS114/DDP cell proliferation and apoptosis

3 討論

小細(xì)胞肺癌具有惡性程度高、生存期短特點(diǎn),主要治療方式為化療,治療早期患者放化療敏感性較高,但隨著治療時(shí)間的延長,患者出現(xiàn)放化療抵抗而導(dǎo)致治療失敗,因而逆轉(zhuǎn)小細(xì)胞肺癌耐藥性已成為亟待解決的問題。研究表明LncRNA可通過競爭性結(jié)合miRNA,進(jìn)而在肺癌順鉑耐藥性中發(fā)揮重要調(diào)控作用[9-11]。提示LncRNA可能作為逆轉(zhuǎn)小細(xì)胞肺癌耐藥性的潛在靶點(diǎn)。

HOXA-AS3在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平升高,并可充當(dāng)miR-29c的海綿分子,進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移[12]。HOXA-AS3在肺癌細(xì)胞中表達(dá)水平升高,并可促進(jìn)細(xì)胞增殖[13]。但HOXA-AS3在肺癌發(fā)生及發(fā)展中的分子機(jī)制尚未闡明。本研究結(jié)果顯示肺癌組織及細(xì)胞中HOXA-AS3的表達(dá)水平明顯升高,順鉑耐藥性細(xì)胞中HOXA-AS3的表達(dá)水平明顯高于正常肺癌細(xì)胞,提示HOXA-AS3在DMS114/DDP細(xì)胞中可能發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究結(jié)果顯示干擾HOXA-AS3表達(dá)后順鉑耐藥細(xì)胞增殖能力減弱,凋亡率升高,并可降低CyclinD1、Bcl-2的表達(dá)及促進(jìn)p21、Bax的表達(dá)。既往研究表明CyclinD1、p21表達(dá)異常與細(xì)胞增殖密切相關(guān),CyclinD1在腫瘤中表達(dá)水平升高,并可調(diào)控細(xì)胞周期,促進(jìn)細(xì)胞增殖,而p21的作用與之相反[14]。Bcl-2/Bax比值失衡可促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡,其中Bcl-2屬于抗凋亡蛋白,Bax屬于促細(xì)胞凋亡蛋白[15]。本研究結(jié)果顯示干擾HOXA-AS3表達(dá)可抑制DMS114/DDP細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)而提高細(xì)胞順鉑敏感性。

miR-340-5p表達(dá)異常可通過抑制BMP4而促進(jìn)甲狀腺癌的進(jìn)展[16]。miR-340-5p在肺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào),上調(diào)其表達(dá)可抑制肺癌細(xì)胞增殖及侵襲[17]。本研究結(jié)果顯示,miR-340-5p在肺癌中呈低表達(dá),HOXA-AS3可靶向結(jié)合miR-340-5p,抑制miR-340-5p表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)干擾HOXA-AS3對細(xì)胞增殖、凋亡的作用。

綜上所述,干擾HOXA-AS3表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而提高DMS114/DDP細(xì)胞順鉑敏感性,其作用機(jī)制可能與上調(diào)miR-340-5p的表達(dá)有關(guān),其可能作為逆轉(zhuǎn)小細(xì)胞肺癌順鉑耐藥性的潛在靶點(diǎn),但關(guān)于其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。