孫 悅，廖若宇，劉新保，張春娥*，杜曉楠

（1.寧夏回族自治區(qū)糧油產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心，銀川 750001;2.寧夏回族自治區(qū)食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)二站，銀川 750001）

玉米作為全球第一大谷物，營養(yǎng)豐富，堪稱“五谷之首”。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球有三分之一的人口以玉米作為主食。玉米面是時下較為常見的粗糧食品，不僅可以完全保留玉米的營養(yǎng)成分和保健功能，還能有效地改善食品口感。但有些商販在玉米面食品的加工中，添加人工合成著色劑檸檬黃[1]，大量或長期食用會對人體有害[2－4]，引起過敏、腹瀉等癥狀，特別是對新陳代謝能力較弱的老人、孕婦、小孩等會造成身體損傷[5]。

檸檬黃作為我國允許使用的合成色素，國家標(biāo)準(zhǔn)GB 2760－2014（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)）規(guī)定其使用限量為0.08 g/kg[6]。常采用的檢測其含量的方法有分光光度法[7－8]、薄層色譜法[9]、拉曼光譜法[10－11]以及高效液相色譜法[12－13]等。提取方法主要有溶劑提取法[14]、聚酰胺吸附法[15]以及固相萃取法[16－17]等。本文參考國家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 5009.35－2016（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定）18]，采用在不破壞食品本身性質(zhì)的條件下以碳酸氫鈉[19]作為輔助提取試劑，結(jié)合去離子水為主要提取試劑，建立玉米面制品中檸檬黃色素的高效液相色譜分析方法。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

朝鮮族民俗玉米面條；產(chǎn)地：吉林省延邊朝鮮族自治區(qū)；生產(chǎn)許可證號：SC10122240130174；產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)：Q/YJSX 0001S；玉米面（超市內(nèi)購得）。

檸檬黃溶液（GBW（E）100001a） 0.500 mg/mL，中國計(jì)量科學(xué)研究院；甲醇（色譜級），賽默飛世爾科技（中國）有限公司；甘油，成都市科隆化學(xué)品有限公司；1，2－丙二醇，成都市新都區(qū)木蘭鎮(zhèn)工業(yè)開發(fā)區(qū)；無水乙醇，95%乙醇，安徽安特食品股份有限公司；乙酸銨，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；碳酸氫鈉，廣東省化學(xué)試劑工程技術(shù)研究開發(fā)中心，以上試劑為分析純；氯化鈉，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；無水碳酸鈉，山東西亞化學(xué)股份有限公司；乙酸鈉，天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司，以上試劑為優(yōu)級純，實(shí)驗(yàn)室用三級水。

1.2 儀器設(shè)備

Prominence UFLC高效液相色譜儀配二極管陣列檢測器：島津集團(tuán)；LABORATORY MILL3100（Perten）實(shí)驗(yàn)?zāi)ィ喝鸬洳ㄍ▋x器公司；PL602－L 電子天平（1/100）：梅特勒－托利多儀器（上海）有限公司；HY－5回旋式振蕩器：江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠；QT－1旋渦混合器：上海琪特分析儀器有限公司；QL－20G－C高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；COMFORT純水/超純水機(jī)：成都浩康科技有限公司；C300A真空泵：德國WGIENS；5 mL一次性注射器：江蘇長城醫(yī)療器械有限公司；13 mm 0.22 μm聚醚砜針式濾器：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

取檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.5 mg/mL）200 μL，加水定容至1 mL后得到濃度為100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備工作溶液，稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備工作溶液制備標(biāo)準(zhǔn)系列濃度為 0.625 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5.0 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)。

1.3.2 樣品的前處理

試樣經(jīng)錘式旋風(fēng)磨粉碎。稱取5.00 g試樣和1.00 g 碳酸氫鈉（精準(zhǔn)至 0.01 g）于 100 mL 離心管中，加入25 mL水振蕩提取10 min，離心5 min，轉(zhuǎn)速為6 000 r/min，收集上清液于100 mL比色管中，反復(fù)提取并收集上清液共計(jì)四次，混勻后取1 mL提取溶液過0.22 μm水相針式過濾器上機(jī)分析。

1.3.3 色譜條件

色 譜 柱 ：YWG C18 柱 （4.6 mm×250 mm，10 μm）；二極管陣列檢測器：波長范圍為190～800 nm，檸檬黃檢測波長選取429 nm；柱溫：35℃；流動相：甲醇：乙酸銨(13:87，V/V)，等度洗脫，流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為 10 μL。

1.3.4 色譜分析

準(zhǔn)確吸取檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入色譜儀，以保留時間定性，以峰面積標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖1。

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

（1）檢測波長的確定：選取 254nm、427nm、428nm、429nm、430nm和450nm六種檢測波長對色譜圖響應(yīng)值及峰型的影響。

（2）提取試劑：采用方法1.3.2處理樣品，考察不同比例的甘油－無水乙醇、1，2丙二醇－無水乙醇、45%乙醇－水、45%甲醇－水和去離子水五種提取試劑對樣品加標(biāo)回收率的影響。

（3）提取方式：采用方法1.3.2處理樣品，考察渦混5 min、振蕩10 min和振蕩20 min三種不同的提取方式對樣品加標(biāo)回收率的影響。

（4）提取次數(shù)：采用方法1.3.2處理樣品，考察分別提取一次、二次、三次、四次和五次對樣品加標(biāo)回收率的影響。

（5）輔助試劑的選擇：采用方法1.3.2處理樣品，考察碳酸氫鈉、氯化鈉、碳酸鈉和乙酸鈉這四種輔助的提取試劑對樣品加標(biāo)回收率的影響。

（6）碳酸氫鈉用量的選擇。采用方法1.3.2處理樣品，考察添加 0.0 g、0.4 g、0.8 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g和2.5 g的碳酸氫鈉對樣品的加標(biāo)回收率的影響。

1.3.6 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素實(shí)驗(yàn)選擇最優(yōu)的提取條件，對提取次數(shù)(A)、碳酸氫鈉的用量(B)以及提取方式(C)這三個因素進(jìn)行三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

1.3.7 樣品的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)及方法驗(yàn)證

通過添加不同梯度的檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液，對優(yōu)化后的提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。優(yōu)化后的提取工藝與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的提取工藝比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.1.1 檢測波長對加標(biāo)回收率的影響

實(shí)驗(yàn)考察了1.3.3色譜條件中對檢測波長的確定。查閱相關(guān)文獻(xiàn)，選取254 nm、427 nm、428 nm、429 nm、430 nm和450 nm六種檢測波長對樣品加標(biāo)回收率的影響。在柱溫35℃；流動相：甲醇：乙酸銨 13:87(V/V)，等度洗脫，流速為 1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL的條件下，得出結(jié)果。在檢測波長為429 nm時，有較強(qiáng)的吸收強(qiáng)度，出峰時間短，峰型較好，干擾少。

2.1.2 提取試劑對加標(biāo)回收率的影響

考察了不同比例的甘油－無水乙醇、不同比例的1，2丙二醇－無水乙醇、45%乙醇－水、45%甲醇－水以及水對樣品加標(biāo)回收率的影響，加標(biāo)濃度為1.25 μg/mL。由圖 2可知，不同比例的甘油－無水乙醇的加標(biāo)回收率在46.72%～66.32%之間；不同比例的1.2丙二醇－無水乙醇的加標(biāo)回收率在27.28%～63.52%之間；45%－乙醇－水的加標(biāo)回收率為67.92%；45%甲醇－水的加標(biāo)回收率為 93.28%；水的加標(biāo)回收率為96.32%。數(shù)據(jù)結(jié)果表明：不同比例的1，2丙二醇－無水乙醇＜不同比例的甘油－無水乙醇＜45%－乙醇－水溶液＜45%甲醇－水＜去離子水（如圖2所示）。目前糧食檢測行業(yè)以環(huán)保為主，因此，選擇用去離子水提取更符合綠色發(fā)展的理念。

2.1.3 提取方式對加標(biāo)回收率的影響

實(shí)驗(yàn)考察了渦混和振蕩兩種提取方式對樣品加標(biāo)回收率的影響，加標(biāo)濃度為 1.25 μg/mL。分別測定渦混5 min、振蕩10 min和振蕩20 min的樣品加標(biāo)回收率。測定結(jié)果如圖3，渦混5 min后的樣品加標(biāo)回收率為90.88%，振蕩10 min后的加標(biāo)回收率為91.04%，振蕩 20 min后的加標(biāo)回收率則減為90.72%。測試結(jié)果表明：振蕩20 min的加標(biāo)回收率最高，但缺點(diǎn)是提取耗時太長，渦混5 min和振蕩10 min的加標(biāo)回收率基本相同，兩種提取方式均可取。在實(shí)際檢測工作中，對于提取方式，可根據(jù)試驗(yàn)數(shù)量靈活選擇。最終，對于大批量風(fēng)險監(jiān)測任務(wù)，建議選擇振蕩10 min提取方式，可以提高工作效率。

2.1.4 提取次數(shù)對加標(biāo)回收率的影響

實(shí)驗(yàn)考察了分別提取一次、二次、三次、四次及五次對樣品加標(biāo)回收率的影響。對應(yīng)的加標(biāo)濃度分別為：5 μg/mL、2.5 μg/mL、1.67 μg/mL、1.25 μg/mL和1.00 μg/mL。觀察每次提取完畢后樣品基質(zhì)顏色，測定相應(yīng)的加標(biāo)回收率。測定結(jié)果如圖4，提取后加標(biāo)回收率分別為：41.60%、68.64%、95.66%、96.48%、95.88%。結(jié)果表明：提取次數(shù)少，不足以將樣品中檸檬黃提取完全，樣品經(jīng)第4次提取，觀察樣品基質(zhì)顏色，樣品提取干凈，樣品經(jīng)第5次提取，測定結(jié)果與第4次相比，加標(biāo)回收率變化不大，綜合工作效率，選擇反復(fù)4次提取效果最好，加標(biāo)回收率也最高。

2.1.5 不同的輔助提取試劑對加標(biāo)回收率的影響

實(shí)驗(yàn)考察了不同的輔助提取試劑對加標(biāo)回收率的影響，加標(biāo)濃度為1.25 μg/mL。從圖 5中可以看出，不同的輔助提取試劑對樣品加標(biāo)回收率的影響為：碳酸氫鈉＞氯化鈉＞碳酸鈉＞乙酸鈉。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，經(jīng)過對提取后的試樣觀察，碳酸氫鈉提取完畢后，樣品中殘留的顏色較淺，最終選取碳酸氫鈉作為本次實(shí)驗(yàn)的輔助提取試劑。

圖5 不同輔助提取試劑對加標(biāo)回收率的影響

2.1.6 碳酸氫鈉添加量對加標(biāo)回收率的影響

實(shí)驗(yàn)考察了添加 0.0 g、0.4 g、0.8 g、1.0 g、1.5 g、2.0 g、2.5g的碳酸氫鈉對加標(biāo)回收率的影響，加標(biāo)濃度為1.25 μg/mL。從圖 6中可以得出，不添加碳酸氫鈉，樣品提取效果不佳，加標(biāo)回收率小于50%。添加碳酸氫鈉的用量在0.4～0.8 g之間時，對應(yīng)的加標(biāo)回收率處在88.16%～89.12%之間，碳酸氫鈉用量增至1 g時，加標(biāo)回收率升為90.16%，碳酸氫鈉用量繼續(xù) 增長到 1.5～2.5 g 之間時，加標(biāo)回收率 在86.24%～89.12%之間。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：添加的碳酸氫鈉量較少時，提取效果不佳；碳酸氫鈉的量超過1 g之后，加標(biāo)回收率降低；而碳酸氫鈉添加量適中時，加標(biāo)回收率最高，提取效果最好。經(jīng)查閱資料得知，碳酸氫鈉遇水顯堿性，使用過多會影響樣品本身的性質(zhì)以及食用口感等，因此，碳酸氫鈉的用量為1 g時最為合適。

圖6 碳酸氫鈉用量對加標(biāo)回收率的影響

2.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，以提取次數(shù)、碳酸氫鈉的用量以及提取方式為考察因素，以檸檬黃的加標(biāo)回收率為響應(yīng)指標(biāo)，選擇L9（34）正交試驗(yàn)，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗(yàn)，（每組設(shè)置3個平行因素），正交試驗(yàn)因素水平見表1。正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表1 因素水平表

表2 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

由正交試驗(yàn)可以看出各因素對檸檬黃的加標(biāo)回收率的影響順序?yàn)锳＞B＞C，即提取次數(shù)＞碳酸氫鈉的用量＞提取方式，提取檸檬黃的最優(yōu)組合為A3B2C2，即提取次數(shù)為5次，碳酸氫鈉用量為1.0g，提取方式為振蕩10 min。因此最終確定的最優(yōu)組合為A2B2C2，即提取次數(shù)為4次，碳酸氫鈉用量為1.0 g，提取方式為振蕩10 min。因素主次順序?yàn)锳→B→C。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性方程與檢出限

檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液0.5 mg/mL，配制濃度點(diǎn)分別為 0.625 μg/mL、1.25 μg/mL、2.5 μg/mL、5 μg/mL、7.5 μg/mL、10 μg/mL 和 15 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.3.3色譜條件測定，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得到檸檬黃的線性方程為：f（x）=29 890.8x－1 575.08，R2=0.9999，RSD=1.88。按3倍信噪比計(jì)算檢出限，得到儀器的檢出限為0.08 mg/kg，按10倍信噪比計(jì)算方法定量限，得出方法定量限為：0.24 mg/kg。

2.3.2 方法的精密度及穩(wěn)定性

確定檢測條件后，在 1.25 μg/mL、3.75 μg/mL 和7.5 μg/mL的三個加標(biāo)水平上，考察方法的精密度和穩(wěn)定性。重復(fù)2 d測定，每天測定6次，測得的結(jié)果如表3所示。本方法的加標(biāo)回收率在89.55%～93.76%，RSD 值在 0.08%～0.36%之間。結(jié)果顯示，采用該色譜條件對樣品測試時，穩(wěn)定性良好，該條件下的方法具有良好的重復(fù)性，較高的精密度。

表3 方法的精密度和穩(wěn)定性（n=6）

2.4 樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)及方法驗(yàn)證

2.4.1 樣品的加標(biāo)回收試驗(yàn)及樣品方法驗(yàn)證

由表4可知，針對兩種不同的玉米面樣品，樣品本身不含檸檬黃色素，結(jié)果顯示該方法下不同濃度的加標(biāo)回收率在 89.49%～94.32%之間，RSD 值在0.02%～0.32%之間。驗(yàn)證了檢測前處理方法準(zhǔn)確性高，符合檢測要求。

表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)（n=6）

2.4.2 實(shí)際樣品的驗(yàn)證方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法的比對

根據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)方法GB 5009.35－2016（食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中合成著色劑的測定）與該實(shí)驗(yàn)優(yōu)化后的檢測方法比對。首先，從色譜條件來看，國家標(biāo)準(zhǔn)同時測7種著色劑，雖然檢測色素種類多，但出峰時間過長。本次實(shí)驗(yàn)檢測檸檬黃出峰時間短，采用等度洗脫，簡便且高效。其次，從前處理過程看，國家標(biāo)準(zhǔn)方法需要調(diào)節(jié)樣品pH值，用聚酰胺吸附法對樣品進(jìn)行復(fù)雜的凈化過程。而優(yōu)化后的方法只需以去離子水作為提取液，添加碳酸氫鈉為輔助對樣品進(jìn)行前處理，該過程沒有有機(jī)試劑的加入，操作簡便又環(huán)保。最后，從方法學(xué)考察看，國家標(biāo)準(zhǔn)方法中檸檬黃的方法檢出限為0.5 mg/kg，而本次實(shí)驗(yàn)的方法檢出限為 0.08 mg/kg，定量限為 0.24 mg/kg，加標(biāo)回收率符合標(biāo)準(zhǔn)范圍。該方法更靈敏，精密性、重現(xiàn)性要優(yōu)于國家標(biāo)準(zhǔn)方法。

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)采用無污染且環(huán)保的超純?nèi)ルx子水作為提取液，碳酸氫鈉為輔助提取試劑，樣品與碳酸氫鈉以5:1的比例稱取，振蕩10 min，離心5 min，轉(zhuǎn)速6 000 r/min，反復(fù)四次提取上清液，混勻后取1 mL過0.22 μm親水性濾膜，采用方法1.3.3的色譜條件上機(jī)分析。結(jié)果顯示本研究玉米面中未檢測出檸檬黃色素，前處理方法有較好的線性關(guān)系，加標(biāo)回收率在89%～94.3%之間，而且過程簡便，高效率，適合大批量試驗(yàn)檢測，樣品的穩(wěn)定性較好，方法準(zhǔn)確度高，儀器精密性好，可為檢測面制品中的檸檬黃提供技術(shù)指南。