張紀(jì)偉，沈雪梅，趙一帆，王 瑋，張 釬，周藝凡，李家華*

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)龍潤普洱茶學(xué)院，云南 昆明 650201；2.昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650201)

【研究意義】黃酮類化合物(Flavone，也稱花黃素)是廣泛存在于自然界的一類水溶性黃色色素，主要類型有黃酮、黃酮醇、雙黃酮等。茶葉中的黃酮醇及其苷類的含量約占茶葉干物質(zhì)的3%～4%，是茶湯的重要呈色和呈味物質(zhì)。黃酮類化合物具有改善血液循環(huán)、抑制炎性生物酶滲出、降低膽固醇、促進(jìn)傷口愈合和調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等生理功能[1]，黃酮類化合物也是一種很強的抗氧化劑，可以有效清除體內(nèi)的氧自由基和降低細(xì)胞氧化損傷程度[2-3]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】普洱茶是云南所特有的地理標(biāo)志產(chǎn)品，近10年來隨著普洱茶熱的興起，普洱茶“越陳越香”品質(zhì)特點的生物化學(xué)基礎(chǔ)及功效已被廣大研究者所關(guān)注，其中在黃酮類化合物的研究方面：羅龍新[4]等研究證明了云南普洱茶中黃酮類化合物含量與品質(zhì)有密切關(guān)系；李家華等[5]研究了普洱茶發(fā)酵過程中黃酮醇類物質(zhì)含量的變化，并對黃酮醇類物質(zhì)的含量與品質(zhì)的形成作了討論分析；Toyoda等[6]研究發(fā)現(xiàn)普洱熟茶中兒茶素等含量很少，但有楊梅素等黃酮物質(zhì)存在；關(guān)文玉等[7]對普洱熟茶中黃酮醇類物質(zhì)楊梅素、槲皮素、山奈酚開展了分離純化研究。郭剛軍等[8]認(rèn)為普洱茶中富含的黃酮類化合物是普洱茶藥理作用的主要活性成分之一，蘆丁、槲皮素及山奈酚等是普洱茶中具代表性的黃酮類物質(zhì)；王麗等[9]對2個不同貯存年份普洱熟茶和普洱生茶中黃酮類化合物含量進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其含量可以作為貯存年份的判別指標(biāo)?！颈狙芯壳腥朦c】迄今為止，從普洱茶貯存年份對黃酮醇類單體化合物含量變化、及其對品質(zhì)影響的研究尚未見報道?！緮M解決的關(guān)鍵問題】以同一地區(qū)，同一廠家不同貯存年份(2006—2015年)普洱生茶標(biāo)準(zhǔn)樣為供試樣，利用HPLC法測定了供試樣中蘆丁、楊梅素、槲皮素和山奈酚成分的含量，分析其含量變化的原因，并以其中的楊梅素、槲皮素、山奈酚及黃酮總量為指標(biāo)，進(jìn)行聚類分析。旨在探明不同貯存年份普洱生茶中黃酮醇類化合物含量變化的趨勢，為普洱生茶的年份鑒別和對普洱茶“越陳越香”理論的構(gòu)建提供一定的數(shù)據(jù)及理論支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料與儀器

供試茶樣：不同貯存年份(2006—2015年)普洱生茶(七子茶餅，生產(chǎn)企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)樣，規(guī)格：357 g)，由云南雙江勐庫茶業(yè)有限責(zé)任公司提供。黃酮醇類化合物標(biāo)品：楊梅素、槲皮素、山奈酚、蘆丁(純度≥98%)購于SIGMA 公司；高效液相色譜儀(HPLC)分析裝置：美國Agilent 1200型高效液相色譜系統(tǒng)；TSK gel ODS-80TM色譜柱 4.6 mm×250 mm，5 μm，日本Tosoh 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 楊梅素、槲皮素、山奈酚和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液的制備 分別精密稱取楊梅素、槲皮素、山奈酚和蘆丁標(biāo)品適量，加甲醇制成每1 mL含0.3 mg的溶液，作為對照品溶液。精密吸取4種對照品溶液1 mL置10 mL的量瓶中，加甲醇至刻度，作為混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(備用)。

1.2.2 樣品待測液的制備 用水浴回流裝置制備供試茶樣溶液[10]。精確稱取茶葉粉末1.00 g，加甲醇40 mL，鹽酸4 mL，置于圓底燒瓶中回流水解1.5 h (85 ℃)，過濾，濾液置50 mL容量瓶，用少許甲醇洗滌殘渣及容器，洗滌液并入容量瓶中，加甲醇定容至50 mL，搖勻，經(jīng)0.45 μm有機系微孔濾膜過濾后進(jìn)行色譜分析。

1.2.3 色譜條件 色譜柱。TSK gel ODS-80TM色譜柱。流動相。A 相：0.2%磷酸水溶液；B 相：80%甲醇水溶液，梯度從40%到90%，流速0.8 mL/min，40 min內(nèi)完成，檢測波長360 nm，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL，每次完成后系統(tǒng)平衡7 min 后再次進(jìn)樣。流動相 A、B均用0.45 μm的濾膜過濾，分析樣都經(jīng)孔徑0.45 μm的濾膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.2.4 結(jié)果計算 3種黃酮醇類化合物的含量的計算公式如(1)、(2)[11]：

(1)

式中，ωa.b.c為供試樣中楊梅素(a)、槲皮素(b)、山奈酚(c)的含量，單位為mg/g；C1.2.3為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查到的楊梅素、槲皮素、山奈酚的濃度，單位為mg/mL；V為樣品的定容體積，單位為mL；m為試樣的質(zhì)量，單位為g。

ω=(ωa+ωb+ωc)×2.51

(2)

式中，ω為供試樣中黃酮醇苷總量，單位為mg/g；2.51為苷元折算為黃酮醇苷元總量的系數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個處理重復(fù)3次，采用Excel2017對所測數(shù)據(jù)進(jìn)行整理、分析，采用SPSS 18.0進(jìn)行顯著性差異分析，用TBtools進(jìn)行年限聚類分析，采用R 3.6.2進(jìn)行Pearsons相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同貯存年份普洱生茶中3種黃酮醇類化合物含量的變化

從圖1-A中可以看出，應(yīng)用HPLC裝置和色譜分析條件，可以對楊梅素、槲皮素和山奈酚3種黃酮醇類化合物進(jìn)行有效分離，圖1-B顯示供試茶樣中可以明顯檢測到楊梅素、槲皮素和山奈酚。從表1可知，在2006—2015年的貯存期間，3種黃酮醇類化合物含量及黃酮總量變化明顯地有2個階段，即在貯存時間相對較短的初期(2011—2015年)其含量變化相對平穩(wěn)，但是到了貯存的后期其含量呈現(xiàn)出顯著性(P<0.05)遞增的趨勢。如：楊梅素在2009—2015年的茶樣中其含量沒有顯著性差異，但是從2007年(貯存年份為8年)的茶樣開始其含量出現(xiàn)了顯著性增加的趨勢，2006年(貯存年份為9年)的茶樣，其含量呈顯著性增加，且達(dá)到最高值，為(3.19±0.28)mg/g；在2008年的試樣中楊梅素含量最低，為(0.36±0.17)mg/g。槲皮素是3種黃酮醇類化合物中含量最高的，其含量的變化與貯存年份呈正相關(guān)，從2006—2010年期間隨貯存年份的延長，其含量呈顯著增加，2006年(貯存年份為9年)的茶樣中含量達(dá)到(10.17±0.96)mg/g，是2015年茶樣的4.48倍；從表1可知，所有茶樣中山奈酚的含量變化隨著貯存年份的延長，其含量的變化趨勢與其他2種黃酮醇類化合物一樣，開始幾年(2011—2015年)變化相對平穩(wěn)，但到了后期呈顯著性遞增的趨勢。上述黃酮醇類化合物含量增加的原因可能是貯存過程中黃酮苷類受糖苷水解酶、水分、氧氣、溫度等條件的影響，黃酮醇苷經(jīng)過水解反應(yīng)脫去糖苷形成黃酮醇苷元所致[12]。

表1 不同貯存年份普洱生茶黃酮醇類化合物的含量

2.2 不同貯存年份普洱生茶聚類分析及年份鑒別結(jié)果

聚類分析是一種以收集數(shù)據(jù)的相似性為基礎(chǔ)進(jìn)行分類的方法。從獲得的不同貯存年份普洱生茶中楊梅素、槲皮素和山奈酚3種黃酮醇類化合物和黃酮總量的數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過聚類分析進(jìn)行年份鑒別的可行性，研究結(jié)果如圖2所示，不同貯存年份10個茶樣可以聚為2大簇，其中第一個簇為2006—2008年的3份茶樣，第二簇為2009—2015年的7份茶樣。3種黃酮醇類化合物和黃酮總量的聚類結(jié)果為楊梅素、槲皮素和黃酮總量的貢獻(xiàn)度比山奈酚大。由此可推測，不同年份茶樣中黃酮醇類化合物含量作為普洱生茶年份鑒別的指標(biāo)是可行的。

2.3 不同貯存年份普洱生茶黃酮醇類化合物與貯存年份之間的相關(guān)性分析

為進(jìn)一步探究黃酮醇類化合物含量隨著貯存年份的變化和各個貯存年份茶樣之間的相關(guān)性，分別進(jìn)行了Pearsons相關(guān)性分析，結(jié)果如圖3、圖4所示。黃酮總量、槲皮素和山奈酚三者之間存在的相關(guān)性最強；黃酮總量與楊梅素以及楊梅素與槲皮素之間的相關(guān)性次之；楊梅素與山奈酚之間相關(guān)性最弱。貯存年份越接近的茶樣之間相關(guān)性越強，與聚類分析的結(jié)果相一致。

3 討 論

研究表明，黃酮醇及其苷類是茶多酚的重要組分含量僅次于黃烷醇類，對茶葉感官品質(zhì)、生理功能等起重要作用[13]。黃酮醇及其苷類物質(zhì)多為亮黃色結(jié)晶，對綠茶湯色有較大影響。有關(guān)茶葉滋味品質(zhì)，Susanne S等[14]研究黃酮苷類呈柔和感澀味(干燥的口感)，且閾值極低，是紅茶中主要的澀味物質(zhì)。宛曉春等[15]認(rèn)為黃酮醇苷類脫去糖苷配基變成黃酮或黃酮醇，可以降低黃酮醇苷類物質(zhì)的苦味，利于改善茶葉滋味品質(zhì)。諶瀅等[16]研究普洱生茶湯色隨著陳化年份的延長，逐漸變深，整體呈現(xiàn)橙黃—黃橙—橙紅—棕紅的變化趨勢。通過研究發(fā)現(xiàn)，隨著貯存年份的延長，茶樣中楊梅素、槲皮素和山奈酚的含量整體呈增加的趨勢，后期呈顯著遞增的趨勢，究其原因是在貯存過程中黃酮苷類與糖苷水解酶、水分、氧氣、溫度等條件有關(guān)，是黃酮醇苷經(jīng)過水解反應(yīng)脫去糖苷形成黃酮醇苷元所致[12]，在2008年供試樣中楊梅素含量出現(xiàn)顯著性變化與發(fā)生異構(gòu)化有關(guān)。脫去的糖苷可以降解黃酮醇苷類物質(zhì)的苦味，黃酮醇苷類物質(zhì)的降解和黃酮醇類物質(zhì)的增加，在感官品質(zhì)上隨著貯存年份的延長收斂性和粗澀感逐步減弱，而醇、厚、甘、滑的普洱生茶的陳茶特點會更加突顯。

目前，不管普洱生茶或是熟茶的年份鑒別主要依據(jù)感官審評方法進(jìn)行判別，但是受品評者的經(jīng)驗和主觀性所限、以及樣品的不同沖泡程度都會對感官審評的結(jié)果造成影響。為了克服經(jīng)驗性和主觀性對年份鑒定帶來的影響，Yang等[17]和羅美玲等[18]利用電子鼻技術(shù)分別對普洱生茶和熟茶進(jìn)行香氣判別和年份鑒定的研究，基于主成分分析(PCA)和聚類分析，能很好的區(qū)分不同年份的普洱茶(生、熟茶)，而基于黃酮醇類化合物含量的聚類分析對普洱生茶的年份鑒定也是可行的。

4 結(jié) 論

隨著儲存年份的延長，3種黃酮醇類化合物楊梅素、槲皮素和山奈酚含量及黃酮總量的變化可分成2個階段，儲存時間較短的初期其含量變化相對平穩(wěn)，在儲存的后期其含量呈現(xiàn)出顯著性遞增的趨勢。聚類分析表明，不同年份普洱生茶茶樣中黃酮醇類化合物含量及黃酮總量可以作為普洱生茶年份鑒別的指標(biāo)。相關(guān)性分析結(jié)果表明，黃酮總量、槲皮素和山奈酚三者之間含量的變化相關(guān)性顯著，貯存年份越接近的茶樣之間相關(guān)性越強。