王閔霞,白玉路,張 瓊,徐登武,張志勇,王 平

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所，四川 成都 610066)

【研究意義】白葉枯病是水稻主要病害之一，經(jīng)常在世界各秈稻區(qū)發(fā)生，通常會引起10%～30%的減產(chǎn)[1-3]。利用寄主自身對白葉枯病的抗性，不僅能提高水稻產(chǎn)量，還能減少因大量施用農(nóng)藥造成的環(huán)境污染。近年來，世界范圍內(nèi)開展了大量水稻抗白葉枯病基因的發(fā)掘和利用工作。截至2015年，經(jīng)國際注冊確認(rèn)或期刊報(bào)道的水稻抗白葉枯病基因達(dá)40個，被成功克隆的有9個[4-5]，其中包括Xa23。Xa23來源于長藥野生稻，對國內(nèi)外鑒別菌系均表現(xiàn)出高抗性，且完全顯性、全生育期抗病，在雜交稻的白葉枯病抗性育種中具有廣闊的應(yīng)用前景[2,6-8]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】從被發(fā)現(xiàn)和定位開始，Xa23逐漸應(yīng)用于水稻的白葉枯病抗性改良。趙開軍等[2]以CBB23為供體創(chuàng)造了3個抗白葉枯和抗褐飛虱且農(nóng)藝性狀優(yōu)良的恢復(fù)系C601、C627和C664。2008年廣西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院將Xa23導(dǎo)入不同遺傳背景的秈稻和粳稻，F(xiàn)1代達(dá)高抗水平；導(dǎo)入不育系后F1代達(dá)中抗水平。黎志康[9]利用Xa23改良水稻恢復(fù)系，得到改良材料明恢63-Xa23、YR293-Xa23和Y1671-Xa23三個恢復(fù)系材料及他們的組合全生育期高抗白葉枯病。周鵬、顧建強(qiáng)等[10-11]利用Xa23分別改良了水稻恢復(fù)系?；?328和蜀恢527的白葉枯病抗性。實(shí)踐證明Xa23在水稻白葉枯病抗性改良中基因效應(yīng)明顯[12]，具有較大的應(yīng)用前景。截至2018年全國有50多家單位或個人引用攜有Xa23基因的水稻抗病材料，并利用該基因培育出博優(yōu)1652、龍兩優(yōu)237及超優(yōu)千號等抗病水稻新品種15個以上[13]。Xa23位于水稻第11染色體長臂上。在Xa23的定位過程中，先后開發(fā)出不同的分子標(biāo)記并用于水稻分子標(biāo)記輔助育種中。2003年開發(fā)出的分子標(biāo)記RM187、RM206、RpdH5、RpdS1184與Xa23遺傳圖距分別為7.1、1.9、7.0和7.6 cM[7]，羅小芬等[14]驗(yàn)證了RM206在育種材料中的多態(tài)性；王春連等[2]開發(fā)出與Xa23距離為0.8 cM的C189并用于育種實(shí)踐；王春連等[15]通過對Xa23精細(xì)定位開發(fā)了與Xa23共分離的標(biāo)記Lj74。由于遺傳重組的發(fā)生，分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確率與分子標(biāo)記距離功能基因的遠(yuǎn)近呈負(fù)相關(guān)，同時利用位于功能基因兩側(cè)的標(biāo)記可以提高檢測的準(zhǔn)確性，如潘海軍[16]在利用Xa23改良育種材料抗病性時，利用RpdH5和RpdS1184輔助選擇的準(zhǔn)確率分別為91.0%和87.3%，同時使用2個標(biāo)記時，準(zhǔn)確率提高至99%?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】Xa23正越來越多地用于水稻抗白葉枯病育種中。由于用來鑒定Xa23基因的P6和P10引自國際水稻研究所(IRRI)，為強(qiáng)致病菌系，其接種鑒定受到嚴(yán)格的限制，因此在育種實(shí)踐中，Xa23基因的分子標(biāo)記輔助選擇顯得尤其重要。王春連等[17]清晰闡釋了Xa23的作用機(jī)制，并揭示Xa23在抗病性材料CBB23與感病材料金剛30(JG30)、日本晴、牡丹江8號 (MDJ8)在Xa23啟動子區(qū)的序列差異，這為開發(fā)位于Xa23基因內(nèi)部的分子標(biāo)記奠定了基礎(chǔ)?！緮M解決的關(guān)鍵問題】已有的Xa23基因分子標(biāo)記均位于基因外側(cè)，由于遺傳過程中會發(fā)生交換和重組，因此應(yīng)用單個分子標(biāo)記會產(chǎn)生選擇誤差，應(yīng)用兩側(cè)分子標(biāo)記使得選擇過程復(fù)雜，費(fèi)工費(fèi)力。為了提高Xa23基因分子標(biāo)記的準(zhǔn)確率和效率，本研究利用抗病水稻材料CBB23與感病材料金剛30(JG30)、日本晴、牡丹江8號 (MDJ8)及川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992等的啟動子區(qū)序列差異，開發(fā)出一個位于Xa23基因內(nèi)部的標(biāo)記，這不僅大大提高了分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性，還可通過簡化檢測步驟從而提升檢測效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

CBB23來自于中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，含有Xa23基因，高抗白葉枯病為Xa23的供體。

川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992，四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)核技術(shù)研究所自育恢復(fù)系，綜合性狀優(yōu)良，白葉枯病抗性差，為待改良白葉枯病抗性的水稻材料，即Xa23基因的受體。

1.2 引物設(shè)計(jì)

由長藥野生稻轉(zhuǎn)育的抗白葉枯病材料CBB23與感病材料JG30、日本晴、MDJ8在Xa23基因啟動子區(qū)存在一段約156 bp的序列差異，除堿基不同外，抗病基因較感病基因還存在67 bp的堿基缺失。針對該區(qū)域序列，設(shè)計(jì)引物對CBB23和待改良材料川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992進(jìn)行測序，確認(rèn)序列差異存在。利用Primer premier5設(shè)計(jì)引物，Xa23-F序列為CCCTGAGTCAAAGTCTTCCC，Xa23-R序列為CAGAGAGGAAGTGCTTGCAG。該標(biāo)記為顯性標(biāo)記，在含有Xa23的純合及雜合單株中均能擴(kuò)增到198 bp的片段，不含有Xa23的單株擴(kuò)增不到片段。

1.3 PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物檢測

用CTAB法提取或堿裂解法快速提取植物基因組DNA，調(diào)整DNA濃度至50～500 ng/μL。配制10 μL PCR體系如下進(jìn)行PCR擴(kuò)增：DNA模板1 μL，Xa23-F(10 μmol/L)0.5 μL，Xa23-R(10 μmol/L)0.5 μL，1.1×T3 Super PCR Mix(擎科生物)8 μL。PCR程序?yàn)?5 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 Xa23分子標(biāo)記的開發(fā)

據(jù)報(bào)道，白葉枯病抗性基因Xa23(來自CBB23)與感病基因xa23(來自日本晴、MDJ8)在啟動子區(qū)存在較大序列差異(圖1-A)[18]，起始密碼子上游100～250 bp區(qū)間內(nèi)，除序列不同外，Xa23還較xa23缺失67 bp。由于Xa23來自野生稻，栽培稻中不存在，因此本序列適宜作為Xa23的特征序列進(jìn)行分子標(biāo)記開發(fā)。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增該特異片段，含有Xa23的單株或群體能夠擴(kuò)增到長度為198 bp的片段，反之則不能。

分別以CBB23、川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992的DNA為模板，利用Xa23-F、Xa23-R引物對進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如預(yù)期，CBB23中擴(kuò)增到198 bp的特異條帶(圖2)，川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992則沒有擴(kuò)增產(chǎn)物。測序結(jié)果顯示，CBB23中擴(kuò)增到的產(chǎn)物為CBB23特征片段(圖1-B)。

該特征片段可用來辨別CBB23與川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992的雜交后代中是否含有白葉枯病抗性基因Xa23，適宜用作上述恢復(fù)系的白葉枯病抗性改良標(biāo)記。

2.2 Xa23分子標(biāo)記的驗(yàn)證

為了檢測分子標(biāo)記在不同基因型的表現(xiàn)，以CBB23為陽性對照，川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992為陰性對照，川恢907、川航恢908、川恢991、川恢992分別與CBB23的DNA等量混合后作為雜合體對照，PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(圖2)。本分子標(biāo)記為顯性標(biāo)記，以陽性或雜合體對照DNA為模板均擴(kuò)增到一條198 bp左右的亮帶，陰性對照中則無對應(yīng)的條帶。

2.3 水稻重要種質(zhì)材料Xa23基因型的鑒定

具有不同優(yōu)良性狀的親本是水稻育種重要的材料基礎(chǔ)和基因資源，了解其遺傳背景對親本的高效利用具有重要的指導(dǎo)意義。本研究對354個引自不同稻區(qū)的水稻親本進(jìn)行了Xa23基因背景鑒定，結(jié)果顯示，除華航G528、R418、R419、R433、R440 5個材料含有Xa23外，其他親本不含有Xa23抗性基因(表2)，與實(shí)驗(yàn)預(yù)期一致，因?yàn)閄a23來自于野生稻，并并非天然存在于栽培稻中。對從上述5個親本中擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，確認(rèn)為Xa23基因(圖3)。這些含有Xa23基因的親本材料均來自華南稻區(qū)，推測這是華南稻區(qū)較早開展Xa23基因利用研究的結(jié)果。

3 討 論

隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展，分子標(biāo)記輔助育種(MAS)正越來越廣泛地應(yīng)用于作物育種中，尤其在作物抗性改良、品質(zhì)提升的精準(zhǔn)化育種中表現(xiàn)出顯著優(yōu)勢。優(yōu)良的基因是實(shí)現(xiàn)MAS的前提，高效、準(zhǔn)確的分子標(biāo)記是進(jìn)行MAS的關(guān)鍵。

白葉枯病是影響水稻生產(chǎn)的最古老、最嚴(yán)重的細(xì)菌病害之一，通常會引起大幅度減產(chǎn)甚至造成顆粒無收。雖然報(bào)道的白葉枯病抗性基因至今有40個，但由于抗譜窄，或?yàn)殡[性基因不好利用等原因，這些基因被應(yīng)用于育種實(shí)踐的很少。Xa3、Xa4曾經(jīng)在水稻白葉枯病抗性育種中發(fā)揮了重要作用，但隨著時間的推移，它們漸漸對病害失去了抗性。Xa21是一個抗病譜較廣的基因，在水稻抗白葉枯病育種中有一定的應(yīng)用。章琦等[7]從野生稻中定位克隆了Xa23，這為水稻白葉枯病的防治提供了新的基因資源。Xa23與Xa21具有相似的抗譜，但它比Xa21表現(xiàn)出更大的優(yōu)勢，它對國內(nèi)外所有鑒別菌系均表現(xiàn)為高抗，而且全生育期抗性、完全顯性，導(dǎo)入效應(yīng)明顯。至今，Xa23在水稻白葉枯病抗性改良中應(yīng)用最廣泛且具有最廣闊的應(yīng)用前景。

表1 Xa23基因在F2群體中的分離情況

表2 部分重要水稻種質(zhì)材料Xa23的鑒定結(jié)果

在Xa23的定位與克隆過程中，陸續(xù)開發(fā)了一些分子標(biāo)記并應(yīng)用于水稻抗白葉枯病育種中。這些標(biāo)記與Xa23基因具有一定的距離，利用這些標(biāo)記進(jìn)行基因型檢測時會產(chǎn)生一定的誤差，為了提高檢測的準(zhǔn)確性，有時候會利用位于基因兩側(cè)的兩個標(biāo)記同時檢測，這使得檢測步驟繁瑣，耗時、耗力。本文根據(jù)Xa23抗性基因啟動子區(qū)的特征序列開發(fā)的分子標(biāo)記擴(kuò)增效率高，與基因共分離，僅通過該標(biāo)記即可確定是否含有Xa23，這不僅提高了檢測的準(zhǔn)確率，還通過簡化檢測步驟提高了檢測效率。

由于遺傳重組的發(fā)生，利用分子標(biāo)記鑒定基因型的準(zhǔn)確率與該標(biāo)記與功能基因的距離呈負(fù)相關(guān)。鄭康樂等[18]認(rèn)為，用于MAS的分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離最好小于5.0 cM。通過比較和驗(yàn)證，王春連等[2]提出分子標(biāo)記與目標(biāo)基因的遺傳距離在1.0 cM以內(nèi)較為可靠。位于基因內(nèi)部的分子標(biāo)記與基因零距離、與基因共分離，因此準(zhǔn)確率最高。另外，分子標(biāo)記在基因供體與受體間存在多態(tài)性是實(shí)施MAS選擇的前提之一，無多態(tài)性的標(biāo)記則無法使用。理論上講，針對基因內(nèi)部特異序列開發(fā)的分子標(biāo)記無需進(jìn)行親本多態(tài)性分析即可應(yīng)用，且通用性更高。

本研究開發(fā)的是一個位于Xa23基因內(nèi)部的顯性分子標(biāo)記，僅利用本標(biāo)記即可對Xa23進(jìn)行基因型鑒定，快速篩選掉不含Xa23的單株，準(zhǔn)確率達(dá)100%。這充分體現(xiàn)了分子內(nèi)標(biāo)記的優(yōu)勢。在針對Xa23特征區(qū)域設(shè)計(jì)標(biāo)記時，筆者設(shè)計(jì)了不同的引物，預(yù)期擴(kuò)增片段為100～500 bp，可區(qū)分純合Xa23、xa23及Xa23/xa233種基因型，由于該區(qū)域編碼序列差異較大，設(shè)計(jì)的幾對引物均未能擴(kuò)增到xa23對應(yīng)的片段。由于不能區(qū)分Xa23的純合或雜合型，本文開發(fā)的標(biāo)記在應(yīng)用中有一定的局限。筆者后期將繼續(xù)針對該區(qū)域或其他位點(diǎn)開發(fā)新的共顯性分子標(biāo)記等，以便為Xa23進(jìn)一步的高效利用提供技術(shù)參考。

4 結(jié) 論

本研究針對抗白葉枯病材料CBB23與感病材料JG30、MDJ8、川恢907、川航恢908等在Xa23基因啟動子區(qū)存在序列差異和缺失，開發(fā)了一個位于Xa23基因啟動子區(qū)的分子內(nèi)標(biāo)記。該分子標(biāo)記為顯性標(biāo)記，在陽性或雜合體中能擴(kuò)增到198 bp的特異性PCR產(chǎn)物，陰性材料中則無特異性擴(kuò)增。利用該標(biāo)記對354個引自不同稻區(qū)的水稻親本進(jìn)行Xa23基因型鑒定，發(fā)現(xiàn)5個材料包括華航G528、R418、R419、R433、R440含有Xa23基因，其他親本不含有Xa23基因。該分子內(nèi)標(biāo)記不僅提高了分子標(biāo)記輔助育種的準(zhǔn)確性，還通過簡化檢測步驟提升了檢測效率。本標(biāo)記的開發(fā)可為Xa23的高效利用提供技術(shù)參考。