沙 敏，欒正云

（泰州市人民醫(yī)院 中心實驗室，江蘇 泰州 225300）

近年來隨著生活方式和環(huán)境的變化，惡性腫瘤發(fā)病率不斷上升，已成為威脅生命健康的重要疾病。隨著對消化道惡性腫瘤的深入研究與分析，臨床資料指出消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫狀態(tài)、腫瘤血管形成等密切相關(guān)[1]。同時，研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤浸潤T 淋巴細胞可表達一種于腫瘤生長所需的血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF，表明T細胞介導(dǎo)的血管生成因子在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[2]。本研究通過聯(lián)合檢測消化道腫瘤患者外周血T淋巴細胞亞群及血清VEGF水平，探討兩者在消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等臨床價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象選取2019 年1 月至2020 年1 月期間至泰州市人民醫(yī)院就診、經(jīng)醫(yī)院病理學(xué)或細胞學(xué)診斷的消化道腫瘤患者共146例，其中男76例，女70 例；平均年齡（56.1±10.6） 歲；腫瘤類型:結(jié)直腸癌54 例，胃癌31 例，肝癌30 例，食管癌19 例，胰腺癌12 例；臨床TNM 分期:Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ期74 例，Ⅳ期38 例；病理分級：高分化（I 級） 28 例，中分化（II 級） 51 例，低分化（III級） 67 例。納入標(biāo)準：所有腫瘤患者均經(jīng)醫(yī)院病理學(xué)或細胞學(xué)確診。排除標(biāo)準：伴有其他消化道疾病患者；有糖尿病、心臟病等其他基礎(chǔ)疾病患者；伴有其他類型惡性腫瘤患者；有全身免疫系統(tǒng)疾病者。對照組為35名健康體檢者，平均年齡（47.95±8.23） 歲，對照組所有腫瘤指標(biāo)均正常。不同腫瘤類型患者與健康對照組在性別和年齡方面無統(tǒng)計學(xué)意義，P＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 外周血T淋巴細胞亞群的檢測 人CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PercP/CD4-APC 流式抗體（100TEST）購于北京同生時代有限公司。外周血T 淋巴細胞亞群檢測采用流式細胞術(shù)。所有腫瘤患者均于前一晚20 點后禁食禁水，次日清晨空腹抽取靜脈血，進行常規(guī)EDTA 抗凝處理，健康對照組收集當(dāng)天體檢血常規(guī)剩余標(biāo)本。實驗步驟：（1） 標(biāo)記流式管，編號對應(yīng)相應(yīng)患者號；（2） 加入人CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PercP/CD4-APC 的熒光抗體20ul 至流式管底部；（3） 上下顛倒血標(biāo)本，混勻后向流式管中加入全血100ul；（4） 渦旋震蕩5s，讓抗體和標(biāo)本充分混勻，28℃條件下避光染色20分鐘；（5） 加入紅細胞裂解液1ml，渦旋震蕩10s，進行充分裂解紅細胞， 28℃條件下避光放置10分鐘；（6） 離心，1500r/min 條件下，5 分鐘，棄上清；（7） 洗滌細胞，用1ml 生理鹽水重懸細胞，混勻后1500r/min 離心5 分鐘，棄上清；（8） 加入1ml 生理鹽水重懸細胞為單細胞懸液，BD FASCCalibur 流式細胞儀檢測CD4+、CD3+、CD8+T細胞亞群，并計算CD4+/ CD8+的值。

1.2.2 血清VEGF的檢測 人VEGF ELISA 試劑盒（96 人份/盒） 購于北京健平金星生物科技有限公司。所有血液標(biāo)本為肝素抗凝靜脈血3ml，4℃離心，3000 r/min，15分鐘后，吸取上清液分裝，置于-80℃冰箱冷凍備測。VEGF 的檢測原理為雙抗體夾心法，操作步驟嚴格按照試劑盒的說明進行。以VEGF ＞142pg/ml 為界限，判斷為VEGF陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量數(shù)據(jù)采用“xˉ±s” 表示，組間比較采用單因素方差分析；計數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 不同類型消化道腫瘤患者外周血T 細胞亞群的比較流式細胞檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，消化道惡性腫瘤（結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌和胰腺癌） 患者CD3+、CD4+T 細胞亞群比例以及CD4+/ CD8+比值明顯降低（P＜0.05），而CD8+T細胞亞群比例明顯高于對照組（P＜0.05，見表1）。

表1 不同類型消化道腫瘤患者外周血T細胞亞群的比較

2.2 不同類型消化道腫瘤患者外周血T 細胞亞群與腫瘤臨床生物學(xué)行為的關(guān)系臨床分期中，消化道惡性腫瘤患者CD3+和CD4+T 細胞亞群比例以及CD4+/ CD8+比值在I～II 期時較高，在III 期含量明顯降低（P＜0.05），在IV期達到最低（P＜0.05）；而CD8+T 細胞亞群比例在I～II 期時較低，在IIIIV期明顯升高（P＜0.05）。在病理分級中，消化道腫瘤患者CD4+和CD3+T 細胞亞群比例以及CD4+/CD8+比值在I 級較高，在II-III 級時含量低（P＜0.05）；而CD8+T 細胞亞群在I 級時較低，在II-III級含量明顯升高（P＜0.05，見表2）。

表2 消化道腫瘤患者外周血T細胞亞群與腫瘤臨床生物學(xué)行為的關(guān)系

2.3 不同類型消化道腫瘤患者血清VEGF 水平比較消化道惡性腫瘤患者血清VEGF 水平升高非常明顯，與對照組相比，結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌、胰腺癌患者血清VEGF 升高有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，見表3）。

表3 不同類型消化道腫瘤患者血清VEGF水平比較

2.4 消化道腫瘤患者血清VEGF與腫瘤臨床生物學(xué)行為的關(guān)系臨床分期中，消化道腫瘤患者血清VEGF在I～II期時含量較低，在III期含量明顯升高（P＜0.05），在IV期達到最高（P＜0.05）；在病理分級中，消化道腫瘤患者血清VEGF在I級和II級時含量較低（P＜0.05），在III級時達到最高（P＜0.05，見表4）。

表4 消化道腫瘤患者血清VEGF含量與腫瘤臨床生物學(xué)行為的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌、胃癌、肝癌、食管癌和胰腺癌是臨床上常見的惡性消化系統(tǒng)腫瘤，占我國惡性腫瘤一半左右，且發(fā)病率和病死率都很高。研究表明，消化道惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展與機體的免疫狀態(tài)密切相關(guān)。當(dāng)宿主的免疫功能低下或缺陷時，消化系統(tǒng)惡性腫瘤的發(fā)生率增高，而在惡性腫瘤進展時，患者的細胞免疫功能亦會受到抑制。消化道惡性腫瘤進展與機體免疫力低下之間互為因果[2]。

T淋巴細胞是人體關(guān)鍵性的免疫細胞，T細胞依據(jù)其細胞表面分子標(biāo)志物的不同分為不同的亞群，在抗腫瘤免疫中分別起不同的作用。CD3+T細胞是免疫細胞的功能基礎(chǔ)，CD4+T 細胞存在誘導(dǎo)以及輔助功能，CD8+T 細胞則存在抑制與毒殺作用。已知CD8+T 細胞與CD4+T 細胞作用相反，具有抑制B細胞生成抗體、阻止T細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾?yīng)細胞及抑制細胞、體液免疫的作用，因此CD4+/CD8+亦是反應(yīng)機體免疫狀態(tài)的指標(biāo)[3]。在正常狀態(tài)下，CD4+/ CD8+比值維持動態(tài)平衡，以保持機體免疫功能穩(wěn)定，腫瘤患者此比值明顯下降，且惡性度越高此比值越低[4]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，消化道惡性腫瘤患者CD4+和CD3+T 細胞亞群明顯降低而CD8+T細胞亞群明顯升高。CD4+/ CD8+比值在健康對照組為1.5左右，而消化道惡性腫瘤均小于0.5，尤其是惡性度高的胰腺癌患者此比值只有0.3 左右。這些研究結(jié)果說明消化道惡性腫瘤患者細胞免疫功能下降，這也是此類腫瘤易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠處轉(zhuǎn)移的可能機制之一。

消化道臨床分期及腫瘤的病理類型與預(yù)后有密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，消化道惡性腫瘤患者的CD4+和CD3+T細胞亞群以及CD4+/ CD8+比值在較低臨床分期（I～II 期） 和病理級別（I 級） 時較高，而在較高臨床分期（III 和IV 期） 和病理級別（II級和III 級） 時較低；而CD8+T 細胞亞群在較低臨床分期（I～II期） 和病理級別（I級） 時較低，而在較高臨床分期（III 和IV 期） 和病理級別（II 級和III級） 時較高。這些研究結(jié)果進一步說明，消化道惡性腫瘤患者惡性度越高細胞免疫功能越低，這與以前的報道相一致[5]。

腫瘤浸潤T 淋巴細胞可表達一種腫瘤生長所需的血管生成調(diào)節(jié)因子VEGF，表明T細胞介導(dǎo)的血管生成因子，如VEGF 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移中起著重要的作用[2]。在血管生成與腫瘤的研究中，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF） 也是目前了解最為深入的血管生成家族，該家族成員對消化道惡性腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移具有重要影響。VEGF與受體結(jié)合后可引起鈣離子內(nèi)流，通過激活細胞內(nèi)信息傳遞對內(nèi)皮細胞產(chǎn)生促分裂、增生和趨化的作用；同時增強血管通透性，有利于血漿、纖維蛋白外滲從而促進血管形成。消化道惡性腫瘤組織血管生成是腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)，腫瘤間質(zhì)血管數(shù)的增多不僅使腫瘤生長加速、侵襲性增強、而且增加了轉(zhuǎn)移的機會，導(dǎo)致患者預(yù)后差[6]。我們的研究發(fā)現(xiàn)，消化道惡性腫瘤患者的血清VEGF 明顯升高，其值是健康對照者3 倍左右，這與牛小平等的研究結(jié)果相一致[7]。本組結(jié)果亦顯示消化道惡性腫瘤患者血清中的VEGF 含量與臨床分期及病理分級密切相關(guān)，其含量分別在臨床分期IV期和病理分級III級時到達最高（P＜0.01），表明患者血清中VEGF 含量均隨著臨床分期及病理分級的升高而逐漸增加。因此檢測腫瘤患者血清中的VEGF 含量，可對消化道腫瘤患者的診斷起到一定的輔助作用。

綜上所述，檢測消化道惡性腫瘤患者外周血T 淋巴細胞亞群來監(jiān)測患者的免疫狀態(tài)，可為消化道惡性腫瘤患者的免疫輔助治療提供有效依據(jù)。同時，檢測血清VEGF 對消化道惡性腫瘤的早期診斷以及病情進展的判斷具有一定的參考價值。有研究證實，VEGF能夠促進T淋巴細胞分化，這是腫瘤免疫缺陷的可能機制之一[8]。因此本研究聯(lián)合檢測消化道腫瘤患者外周血T 淋巴細胞亞群和血清VEGF 水平，為判斷腫瘤生長狀態(tài)和免疫輔助治療提供可能的依據(jù)。