鄭文博，趙 瑛

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院兒童神經(jīng)內(nèi)分泌科，陜西 咸陽 712000；2.西安醫(yī)學(xué)院附屬寶雞醫(yī)院消化內(nèi)科，陜西 寶雞 721006)

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一種獲得性代謝性肝病，可導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌、肝移植和死亡，是兒科常見的慢性肝病之一[1-2]。研究[3-4]表明，肥胖是引起NAFLD 的主要原因之一，肥胖兒童和青少年NAFLD患病率約為36.1%。NAFLD主要的臨床特征為肝臟出現(xiàn)典型脂肪變性和炎癥反應(yīng)，肝臟單純出現(xiàn)肝脂肪變性即可轉(zhuǎn)換為NAFLD，最終導(dǎo)致肝硬化[5-6]。因此，治療兒童NAFLD的關(guān)鍵是有效調(diào)控肝臟脂肪代謝及合成平衡，控制肝臟炎癥反應(yīng)。冬凌草甲素是由名為冬凌草的唇形科香茶菜屬植物中分離得到一種二萜類化合物，研究[7-8]顯示其具有抗炎、抗癌、神經(jīng)保護(hù)等多種生物學(xué)功能。有研究[9]證實冬凌草甲素可以作為核因子E2相關(guān)因子2(Nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2)的激活劑和NOD樣受體蛋白3(NOD-like receptor protein 3，NLRP3)抑制劑。Nrf2作為一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，顯示出很強的抗氧化活性，已被廣泛用作抑制氧化應(yīng)激和由此產(chǎn)生的炎癥的啟動子[10]。隨著氧化應(yīng)激的發(fā)生，Nrf2進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，啟動抗氧化酶和抗氧化基因的轉(zhuǎn)錄，最終減輕氧化損傷[11]。但是關(guān)于冬凌草甲素對兒童NAFLD的作用及其機制尚未有相關(guān)報道，有待于進(jìn)一步深入探究。因此，本研究通過高脂飼料構(gòu)建幼齡大鼠NAFLD模型，明確冬凌草甲素對幼齡大鼠NAFLD的作用，并探究冬凌草甲素是否與Nrf2的激活及抑制肝臟氧化應(yīng)激相關(guān)，為冬凌草甲素用于兒童NAFLD的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 3周齡SD大鼠56只，雌雄各半，由西安醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK-2020-028。

1.2 主要試劑 冬凌草甲素(CAS：28957-04-2，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%)購自上海麥克林生化科技有限公司；HE染色試劑盒(批號：G1121)購自北京索萊寶科技有限公司；BCA試劑盒(批號：P0009-1)購自碧云天生物技術(shù)研究所；RIPA裂解液(批號：R0278-50ML)購自上海北諾生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：QN0463)購自北京百奧萊博科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒(批號：BC0685)購自北京索萊寶科技有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒(批號：FT-D23894)購自上海梵態(tài)生物科技有限公司；Nrf2(批號：K106685P)、核纖層蛋白B(Lamin B，批號：K200032M)、血紅素氧合酶1(HO-1，批號：K106637P)和 醌氧化還原酶-1(NQO-1，批號：K106519P)一抗和山羊抗兔二抗(批號：SPA101)均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 NAFLD模型構(gòu)建及分組：將56只3周齡SD大鼠隨機分為對照組(13只)和高脂組(43只)。對照組采用普通飼料飼養(yǎng)，高脂組采用高脂飼料(基礎(chǔ)飼料+10%豬油+2%膽固醇)飼養(yǎng)。6周后，分別在兩組中隨機抽取3只大鼠進(jìn)行病理檢查，用于評估NAFLD模型構(gòu)建是否成功。NAFLD模型被構(gòu)建成功后，將高脂組大鼠隨機分成模型組、冬凌草甲素低劑量組(L組)、冬凌草甲素中劑量組(M組)和冬凌草甲素高劑量組(H組)，每組10只。冬凌草甲素低、中、高劑量組分別腹腔注射5、10、20 mg/kg[12]，1次/d，連續(xù)4周。4周后檢測各組大鼠體重、空腹血糖、空腹血清胰島素情況。隨后處死大鼠，取血后迅速摘取肝臟，將肝臟組織均分為3份，放于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 血脂及肝功能指標(biāo)檢測：給藥4周后，取各組大鼠血2 ml，4 ℃條件下3000 r/min離心15 min，分離血清后使用全自動生化分析儀測定大鼠血清中谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平。

1.3.3 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測：取大鼠肝組織經(jīng)研磨處理后制作組織勻漿，采用ELISA試劑盒檢測各組大鼠肝臟組織中SOD、LDH、GSH-Px含量。

1.3.4 Western blot檢測蛋白表達(dá)：各組大鼠肝臟組織利用RIPA裂解液裂解后，提取肝臟組織總蛋白，利用BCA試劑盒測定蛋白含量。采用SDS-PAGE電泳分離蛋白后，將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF膜。利用5%脫脂牛奶室溫封閉蛋白2 h后，孵育一抗：適宜濃度的Nrf2(1∶500)、HO-1(1∶500)和NQO-1(1∶1000)，并置于4 ℃下孵育過夜。第2天采用洗膜緩沖液(TBST)洗膜后孵育二抗：于室溫下孵育1 h，繼續(xù)采用TBST洗膜后即可顯影觀察蛋白情況。采用Image J軟件，以GAPDH為內(nèi)參，定量分析蛋白質(zhì)條帶灰度值。

1.3.5 肝組織HE染色：利用4%多聚甲醛于室溫固定大鼠肝臟組織2 h，隨后利用不同濃度的酒精進(jìn)行脫水處理，利用二甲苯透明切片，將其浸入石蠟中包埋組織塊，制作石蠟切片。隨后進(jìn)行HE染色，具體操作方法參照HE染色試劑盒說明書進(jìn)行。最后用甘油明膠封片，鏡下觀察大鼠肝臟組織病理學(xué)變化。

1.3.6 肝組織油紅O染色：首先利用4%多聚甲醛將肝組織固定，隨后利用30%蔗糖溶液脫水，之后進(jìn)行OCT包埋后切片，最后進(jìn)行油紅O染色，觀察呈紅色區(qū)域，用于評價肝細(xì)胞脂肪量。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠體重、空腹血糖和血清胰島素水平比較 見表1。模型組大鼠體重、空腹血糖和空腹血清胰島素水平高于對照組(均P<0.05)。冬凌草甲素低劑量組大鼠各指標(biāo)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。冬凌草甲素中劑量組和高劑量組大鼠體重、空腹血糖以及空腹血清胰島素水平低于模型組(均P<0.05)。

表1 各組大鼠體重、空腹血糖和血清胰島素水平比較

2.2 各組大鼠血脂及肝功能指標(biāo)比較 見表2。模型組大鼠TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平高于對照組，HDL-C水平低于對照組(均P<0.05)。冬凌草甲素低劑量組大鼠各指標(biāo)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。冬凌草甲素中劑量組和高劑量組大鼠TC、TG、LDL-C、ALT、AST水平低于模型組，HDL-C水平高于模型組(均P<0.05)。

2.3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 見表3。模型組大鼠SOD水平低于對照組，LDH和GSH-Px水平高于對照組(均P<0.05)。冬凌草甲素低劑量組大鼠各指標(biāo)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。冬凌草甲素中劑量組和高劑量組大鼠SOD水平低于模型組，LDH和GSH-Px水平高于模型組(均P<0.05)。

2.4 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)水平比較 見表4。模型組大鼠肝組織Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)水平低于對照組(均P<0.05)。冬凌草甲素低劑量組大鼠各指標(biāo)水平與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)。冬凌草甲素中劑量組和高劑量組大鼠各指標(biāo)水平高于模型組(均P<0.05)。

表2 各組大鼠血脂及肝功能指標(biāo)比較

表3 各組大鼠氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

表4 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1、

2.5 各組大鼠肝組織HE染色結(jié)果 見圖1。正常組可觀察到肝細(xì)胞排列整齊，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，且無脂肪變性和炎細(xì)胞浸潤。模型組大鼠肝細(xì)胞可觀察到明顯腫脹，細(xì)胞內(nèi)可觀察到大小不一的脂滴空泡，并且細(xì)胞核出現(xiàn)邊緣化，同時組織中發(fā)生炎性細(xì)胞浸潤，表明高脂飲食可誘導(dǎo)大鼠NAFLD。冬凌草甲素低劑量組與模型組相比略有改變，冬凌草甲素中劑量組和高劑量組可以觀察到隨著劑量增加脂肪變顯著減輕，炎癥細(xì)胞顯著減少，提示冬凌草甲素可能會減輕高脂飲食誘導(dǎo)的NAFLD。

2.6 各組大鼠肝組織油紅O染色結(jié)果 見圖2。與對照組大鼠相比，模型組大鼠肝臟細(xì)胞中出現(xiàn)大量脂滴積聚現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)脂滴多為多囊泡型大泡，脂肪滴多呈片狀分布。冬凌草甲素低劑量組并未顯著緩解脂滴積聚現(xiàn)象。但在冬凌草甲素中劑量組和高劑量組，肝臟細(xì)胞中脂滴堆積情況有所減輕，證明冬凌草甲素干預(yù)后能夠進(jìn)一步減輕NAFLD大鼠肝細(xì)胞中脂滴堆積現(xiàn)象。

A：對照組；B：模型組；C：冬凌草甲素低劑量組；D：冬凌草甲素中劑量組；E：冬凌草甲素高劑量組

A：對照組；B：模型組；C：冬凌草甲素低劑量組；D：冬凌草甲素中劑量組；E：冬凌草甲素高劑量組

3 討 論

NAFLD又稱代謝性脂肪性肝炎，可進(jìn)一步導(dǎo)致肝硬化甚至死亡[13]。NAFLD發(fā)病機制較為復(fù)雜，研究[14]顯示其發(fā)生、發(fā)展是與脂質(zhì)代謝紊亂和肝組織炎癥反應(yīng)顯著相關(guān)的。因此，調(diào)控患者肝臟脂質(zhì)代謝以及抑制肝組織炎癥反應(yīng)是緩解或治療NAFLD的關(guān)鍵步驟。研究[15]顯示，中藥在治療NAFLD方面具有一定療效。冬凌草甲素是東亞地區(qū)常用中草藥冬凌草的天然活性成分，具有多種藥理和生物學(xué)特性，如抗炎、抗病毒和抗菌活性。

本研究利用高脂飲食誘導(dǎo)3周齡SD大鼠構(gòu)建NAFLD大鼠模型，探究冬凌草甲素對幼齡NAFLD大鼠肝臟損傷的緩解作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組大鼠體重、空腹血糖和血清胰島素、TC、TG、LDL-C、ALT、AST均明顯增加，并發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。此外，利用HE染色觀察大鼠肝組織，發(fā)現(xiàn)組織中肝細(xì)胞腫脹，并且細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的脂滴空泡，同時可見組織受到炎細(xì)胞浸潤；同時，油紅O染色觀察到模型組大鼠肝細(xì)胞中出現(xiàn)大量脂滴積聚現(xiàn)象，細(xì)胞內(nèi)脂滴多為多囊泡型大泡，脂肪滴多呈片狀分布。以上結(jié)果表明，在本研究中利用高脂飲食可以成功誘導(dǎo)幼齡大鼠構(gòu)建NAFLD模型。在此基礎(chǔ)上我們展開研究，利用不同濃度冬凌草甲素干預(yù)NAFLD模型大鼠，并觀察其對NAFLD大鼠體重、空腹血糖、空腹血清胰島素、血脂水平、氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)、肝組織病理損傷、肝臟脂滴積聚以及肝組織中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達(dá)水平的影響。結(jié)果顯示，低劑量冬凌草甲素對NAFLD的改善并不顯著，但是中高劑量冬凌草甲素可以顯著降低NAFLD大鼠體重、空腹血糖和空腹血清胰島素水平，且呈劑量依賴性。研究[16]報道，脂代謝紊亂是NAFLD患者的病理現(xiàn)象之一，主要表現(xiàn)為血脂異常升高。因此，本研究檢測了大鼠血脂含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中高劑量冬凌草甲素可以顯著降低NAFLD大鼠血脂水平，說明冬凌草甲素可以明顯緩解NAFLD的臨床癥狀。此外，HE染色和油紅O染色觀察到模型組大鼠肝細(xì)胞經(jīng)過中高劑量冬凌草甲素干預(yù)后脂肪含量降低和炎癥細(xì)胞減少，進(jìn)一步證實了冬凌草甲素對NAFLD的改善功能。

氧化應(yīng)激損傷是NAFLD發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一[17]。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn)，NAFLD模型大鼠肝組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，為明確冬凌草甲素是否會對NAFLD大鼠肝組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)起到抑制作用，本研究分別利用不同劑量冬凌草甲素對NAFLD模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，冬凌草甲素中高劑量組均能夠顯著升高SOD水平，降低LDH和GSH-Px水平，證實冬凌草甲素可以緩解NAFLD大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

Nrf2是一種作用于人類抗氧化反應(yīng)元件上的轉(zhuǎn)錄因子，已有大量研究顯示Nrf2對于肝臟具有保護(hù)作用，尤其是NAFLD發(fā)生后，會對肝臟損傷具有一定的改善作用。本研究發(fā)現(xiàn)模型組大鼠肝組織發(fā)生氧化應(yīng)激后，Nrf2表達(dá)被顯著下調(diào)，表明肝臟的抗氧化作用下降，肝損傷加重[18-19]。Nrf2發(fā)揮對肝臟的保護(hù)作用是通過調(diào)控相關(guān)抗氧化靶基因來實現(xiàn)的。HO-1是一種重要的抗氧化酶基因，可以維持細(xì)胞氧化和抗氧化的動態(tài)平衡。當(dāng)細(xì)胞或組織發(fā)生氧化應(yīng)激后，HO-1可以清除組織內(nèi)過多的氧自由基，誘導(dǎo)抗氧化基因如SOD表達(dá)，后者可以促進(jìn)氧自由基與氫離子結(jié)合生成過氧化氫，進(jìn)而達(dá)到清除氧自由基的目的。NQO-1是一種具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)作用的黃素酶，當(dāng)機體發(fā)生氧化應(yīng)激時，Nrf2可以進(jìn)入細(xì)胞核促進(jìn)NQO-1的表達(dá)，進(jìn)而起到抗氧化作用[20-21]。因此，為進(jìn)一步明確冬凌草甲素對NAFLD的緩解作用是否通過激活Nrf2及下游抗氧化基因HO-1和NQO-1來實現(xiàn)的，本研究分別檢測了經(jīng)過不同劑量冬凌草甲素干預(yù)的NAFLD大鼠肝組織中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，冬凌草甲素中劑量組和高劑量組大鼠肝細(xì)胞中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白的表達(dá)水平被顯著上調(diào)，證實冬凌草甲素對NAFLD肝損傷的改善作用是通過激活Nrf2、降低肝內(nèi)氧化應(yīng)激來實現(xiàn)的。

綜上所述，冬凌草甲素通過激活Nrf2降低氧化應(yīng)激水平，緩解高脂飲食誘導(dǎo)的幼齡大鼠NAFLD，為臨證防治NAFLD提供了依據(jù)。