李國棟, 田星, 趙小麗,2, 楊耀文*

基于SSR分子標(biāo)記的草果栽培起源分析

李國棟1, 田星1, 趙小麗1,2, 楊耀文1*

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南省傣醫(yī)藥與彝醫(yī)藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650500；2. 德宏州人民醫(yī)院，云南 潞西 678400)

為探索草果()的遺傳多樣性和栽培起源，對(duì)草果和擬草果()在8個(gè)SSR位點(diǎn)上的遺傳變異進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，8個(gè)SSR位點(diǎn)在20個(gè)草果居群和5個(gè)擬草果居群分別檢測(cè)到149和101個(gè)等位基因，特有等位基因分別為44和59個(gè)。方差分析(AMOVA)表明，僅10.43%的遺傳變異存在于2物種間，8.66%于種內(nèi)居群間，80.91%于居群內(nèi)(<0.01)。擬草果居群總的遺傳分化程度較大(0.15≤st≤0.25)，草果的為中度(0.05≤st≤0.15)。SMM模式下2物種的遺傳分化均加大(st

草果；擬草果；SSR分子標(biāo)記；遺傳多樣性；栽培起源

草果()主產(chǎn)云南，越南亦分布[1]。果實(shí)入藥，溫中健胃，消食順氣，祛寒濕[2]；也作食物辛香料。云南是草果主產(chǎn)區(qū)，栽培歷史悠久[3]。前期資源調(diào)查時(shí)在草果傳統(tǒng)產(chǎn)區(qū)未見姜味砂仁()，僅有野生的擬草果()，且分布鄰接區(qū)域未見雜交個(gè)體。草果、擬草果在生態(tài)適應(yīng)上已有分化：花的行為反應(yīng)有一定時(shí)間差；草果在海拔≥1 200 m林中結(jié)果較多，在海拔900 m林中開花多結(jié)果極少，而同海拔的擬草果則大量結(jié)果；同一海拔，干旱、光照過多或過少，草果生長不好或死亡，而擬草果生長較好，適應(yīng)性較強(qiáng); 草果果實(shí)不脫落，擬草果果實(shí)較草果小，中秋前后脫落、腐爛。這些分化可能是導(dǎo)致2物種無雜交個(gè)體的原因。傳統(tǒng)草果產(chǎn)區(qū)對(duì)二者的認(rèn)識(shí)、利用也不同，擬草果(野草果、白草果)僅食用，草果(家草果、紅草果)入藥, 且種子揮發(fā)油成分不同，不能當(dāng)作同一藥材使用[4]。擬草果是與草果親緣關(guān)系最近的同屬野生植物[5]。因此, 擬草果的分布、遺傳多樣性和居群遺傳結(jié)構(gòu)均能為草果栽培起源研究提供重要信息。

闡明物種的栽培起源不僅可認(rèn)識(shí)栽培馴化的遺傳結(jié)果，也利于瞄準(zhǔn)優(yōu)良種質(zhì)資源提高品質(zhì)[6]。草果栽培起源是一個(gè)迄今未解決的基礎(chǔ)問題，本文基于擬草果與草果的親緣關(guān)系，通過比較分析二者的遺傳多樣性、居群遺傳結(jié)構(gòu)，探索草果栽培起源，為其品質(zhì)提高奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料草果()和擬草果()采自中國云南、廣西，越南(表1)，憑證標(biāo)本存于云南中醫(yī)藥大學(xué)。共20個(gè)草果居群和5個(gè)擬草果居群，其中TBG居群的種源從越南經(jīng)緬甸引進(jìn)，LC、HS、SD、TBG、LJ、TY、ZH和JX居群當(dāng)?shù)毓╀N社在上世紀(jì)從云南文山州、紅河州引種栽培，這7居群附近無擬草果分布。每個(gè)草果居群隨機(jī)選取7～26株，株距≥5m；草果居群周邊的(直線距離≤200 m)全部擬草果植株作一個(gè)居群，悉數(shù)采樣。采集健康葉片放入含硅膠的密封袋中干燥，于–20℃的冰箱中保存。

表1 材料采集信息

1.2 總DNA的提取和PCR擴(kuò)增

采用改良的植物基因組DNA快速提取試劑盒提取草果和擬草果的總DNA。用本課題組[7]前期篩選的8對(duì)多態(tài)性位點(diǎn)高的引物進(jìn)行擴(kuò)增(表2)。擴(kuò)增體系總體積為25L，包含DNA聚合酶(1.0 U/L) 12.5L，正反向引物(10mol/L)各1.5L，DNA模板(30 ng/L) 1.0L，用ddH2O補(bǔ)足。擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性4 min，94℃變性40 s；然后64℃退火30～40 s，72℃延伸40 s，共循環(huán)33次；最后72℃延伸6 min。產(chǎn)物存于–4℃冰箱。使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，120 V電泳25～30 min，挑選具明亮條帶的PCR產(chǎn)物送上海生工(Sangon Biotech)進(jìn)行STR檢測(cè)。

表2 SSR引物信息

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用GENEMARER V 2.4軟件統(tǒng)計(jì)片段長度,按照GenALEx V 6.4軟件[8]格式要求對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理。用GenALEx V 6.4、Genepop、Fastat、PIC_CALC version軟件統(tǒng)計(jì)每個(gè)位點(diǎn)等位基因的數(shù)目(number ofallele,)和特有等位基因數(shù)(mumber of unique allele,p)、雜合度、-統(tǒng)計(jì)值、遺傳多樣性和遺傳分化系數(shù)等參數(shù)。遺傳分化參數(shù)is、st與it為-統(tǒng)計(jì)量計(jì)算所得，遺傳分化參數(shù)is、st與it為-統(tǒng)計(jì)量基于逐步突變(stepwise mutation model, SMM)模型計(jì)算所得。SMM模型下，大小相似的等位基因意味著有更近的親緣關(guān)系；考慮到居群間遺傳分化源于基因突變的積累，對(duì)于分化歷史足夠長的居群，基于SMM模型的居群遺傳分化檢測(cè)更為準(zhǔn)確[9]。

采用Arlequin軟件的分子方差分析(analysis of molecular variance, AMOVA)模塊對(duì)草果、擬草果居群進(jìn)行遺傳變異來源分布分析。采用STRUCTURE V 2.3進(jìn)行多位點(diǎn)的貝葉斯聚類分析[10]，推斷居群最可能的聚類情況()。用Flaush等推薦的混合模型(Admixture model)[11]，選擇居群間相關(guān)的等位基因頻率模型(correlated alleles frequencies model)；值定義為1～10，每個(gè)值設(shè)置運(yùn)行20次。采用Microsatellite Aanlyser V 4.05 (MSA)[12]計(jì)算居群間Nei’s遺傳距離矩陣，采用GenALEx V 6.4軟件進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal coordinates analysis, PCoA), 并計(jì)算每個(gè)居群8個(gè)位點(diǎn)的遺傳距離，將結(jié)果導(dǎo)入POPTREE V 2.0軟件[13]，根據(jù)鄰接法(NJ)構(gòu)建親緣關(guān)系樹(Bootstrap=1 000)。

2 結(jié)果和分析

2.1 遺傳多樣性

SSR位點(diǎn)的遺傳多樣性 在20個(gè)草果居群中，每個(gè)SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)為8～34個(gè)，平均18.63個(gè)，其中At30和At4位點(diǎn)的等位基因最豐富，分別為34和30個(gè)。每個(gè)位點(diǎn)擁有1～9個(gè)特有等位基因，平均5.5個(gè)。At4位點(diǎn)具有較高的等位基因豐富度(allelic richness,R)、平均等位基因數(shù)(average number of alleles,A)、有效等位基因數(shù)(number of effective alleles,E)和Shannon’s信息指數(shù)(Shannon’s information index,)值。觀測(cè)雜合度(observed hetero- zygosity,O)、期望雜合度(expected heterozygosity,E)和無偏差雜合度(unbiased expected heterozygosity,E)分別為0.21～0.73、0.29～0.81和0.30～0.84, 以位點(diǎn)At4和At46的較高。在5個(gè)擬草果居群中, 每個(gè)SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)為8～19個(gè)，平均13個(gè)，以At4和At5位點(diǎn)的最豐富，分別為19和15個(gè); 每個(gè)位點(diǎn)擁有4～11個(gè)特有等位基因，平均7.4個(gè); At4位點(diǎn)具有較高的R、A、E和值；O、E和E分別為0.17～0.65、0.35～0.79和0.36～0.83, 以At4位點(diǎn)的較高(表3)。

表3 SSR位點(diǎn)遺傳多樣性

:等位基因數(shù);P: 特有等位基因數(shù);R:等位基因豐富度;A: 平均等位基因數(shù);E: 有效等位基因數(shù);: Shannon’s信息指數(shù);O: 觀測(cè)雜合度;E:期望雜合度;E: 無偏期望雜合度。下表同。

:Number of allele;P:Number of unique allele;R: Allelic richness;A: Average number of alleles;E: Number of effective alleles;: Shannon’s information index;O:Observed heterozygosity;E:Expected heterozygosity;E:Unbiased expected heterozygosity. The same is following Table.

居群的遺傳多樣性 從表4可見，草果和擬草果居群的等位基因分別有34～60和31～53個(gè), 平均為48.55和39.80個(gè)，F(xiàn)D2、MB和TCy居群的等位基因數(shù)最高，分別為60、60和53個(gè)，MB和TCy居群的NP、NA、NE、HO、HE、UHE值較其他居群高。擬草果居群的Np極顯著高于草果居群, 從Np來看，擬草果居群遺傳多樣性極顯著高于草果居群。綜合p和E、E來看，在擬草果居群中,TCy居群的遺傳多樣性最高，其次是YPy和Fdy, BSy最低，其基因多樣性(gene diversity,d)的變化趨勢(shì)相同。同樣地，在草果居群中，MB居群的遺傳多樣性最高, 其次是TC居群,接著依次是XH、GB、YP、LC和TBG居群，d的變化趨勢(shì)基本相同。

2.2 遺傳結(jié)構(gòu)

從表5可見，25個(gè)居群的群體內(nèi)近交系數(shù)(is、is)總體上均大于0，表明與隨機(jī)自由交配相比, 近交在群體中更加頻繁，導(dǎo)致雜合子不足?？傮w上草果的is小于擬草果，但is大于擬草果，提示草果居群內(nèi)積累了更多基因突變，遺傳分化大于擬草果。草果居群的總體遺傳分化指數(shù)st和st均為0.05～0.15，表明其遺傳分化為中度，擬草果居群的遺傳分化較大(0.150.25)。2物種總體的st

AMOVA分析表明(表6), 僅10.43%的遺傳變異存于2物種間，8.66%存在于種內(nèi)居群間，80.91%于居群內(nèi)(<0.01)。草果居群的遺傳變異有7.1%存在于居群間，92.9%存在于居群內(nèi)；擬草果居群分別為23.26%和76.74% (<0.01)。擬草果居群間的遺傳分化指數(shù)(st=0.23)高于草果居群(st=0.07)，草果居群的基因流(m=2.20)大于擬草果居群(m=0.85)。

表4 居群的遺傳多樣性

is: 近交系數(shù);d: 基因多樣性。

is: Inbreedingcoefficient;d: Genediversity.

表5 草果(A)、擬草果(B)居群內(nèi)和居群間的遺傳分化

對(duì)草果和擬草果所有居群進(jìn)行貝葉斯聚類分析表明，值的分布結(jié)果支持將所有居群分為兩組(圖1: B, C)。STRUCTURE分析結(jié)果表明,=2是比較適合的分組標(biāo)準(zhǔn)(圖1: A)。=2時(shí)，草果居群以綠色基因池為主，擬草果居群以紅色基因池為主。=3時(shí)，草果居群以黃色和橙色基因池為主, 擬草果居群以藍(lán)色基因池為主，2物種均無特有基因池(圖1: A)。當(dāng)=15時(shí)，草果和擬草果的基因池種類均相同。PCoA分析結(jié)果表明(圖2)，草果個(gè)體聚為一組，擬草果個(gè)體聚為另一組，兩組間是連續(xù)的。TC、XH、RH、YP、MB、FD1和FD2居群中部分個(gè)體更靠近擬草果，F(xiàn)Dy、TCy和BSy居群中部分個(gè)體更靠近草果。

表6 基于8個(gè)SSR位點(diǎn)的AMOVA分析

圖1 基于STRUCTURE的25個(gè)居群聚類分析

2.3 親緣關(guān)系

基于遺傳距離構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果表明，2物種沒有表現(xiàn)出完全的單系，呈現(xiàn)一定程度的離散，擬草果居群TCy、FDy、BSy與RHy、YPy聚在一起(圖3)，20個(gè)草果居群分為4組：組II包括GB與XH居群；組III包括LC、MB、TBG、GLJ、ZH、ML、RH、HS、FD2、TC居群；組V包括LJ居群，組IV包括剩余的7個(gè)居群，F(xiàn)D2與TC親緣關(guān)系較近；TY、FD1、SD與ADB1、ADB2、LJ親緣關(guān)系較近。

3 結(jié)論和討論

除GB居群外，2物種的E大于O，is均> 0 (表4)，說明24個(gè)居群均雜合子不足而偏離哈迪-溫伯格(HWE)平衡。5個(gè)擬草果居群雜合子不足(is=0.15～0.33)的程度低于草果居群(is=0.1～0.46) (表5)。無效等位基因(null allele)可將雜合子標(biāo)記為純合子[9]，本研究中8個(gè)SSR位點(diǎn)均發(fā)生雜合子缺乏，無效等位基因不可能在8個(gè)位點(diǎn)同時(shí)發(fā)生；此外，早期研究中，At1、At4、At29、At46和At56位點(diǎn)均未發(fā)現(xiàn)無效等位基因[14]。所以，本研究中草果、擬草果居群雜合子不足，不可能是無效等位基因引發(fā)的。雜合子不足意味著居群內(nèi)可能非隨機(jī)交配[9]。草果、擬草果均有促進(jìn)雜交的柱頭卷曲機(jī)制[15–16]，但是，溫濕度變化對(duì)草果柱頭卷曲的影響在居群水平上沒有完全形成功能上的雌雄異株，影響草果繁育和降低適合度[17]。2物種均缺乏自交不親和機(jī)制[18]，自交親和機(jī)制能強(qiáng)化營養(yǎng)繁殖[19]；草果繁殖也有老株分化發(fā)展新株的方式[15]。這都可能是草果居群雜合子減少的原因。擬草果果實(shí)成熟后脫落，不及時(shí)采摘即腐爛，這不利于種子遠(yuǎn)距離擴(kuò)散，可能是雜合子缺乏的原因，此外，生境受到破壞、樣本量少(5個(gè)居群63個(gè)個(gè)體)也可能是原因之一。特有等位基因數(shù)(P)、期望雜合度(E)可評(píng)價(jià)居群遺傳多樣性的豐富程度[20–21]。據(jù)此，我們推測(cè)云南馬關(guān)、麻栗坡、屏邊、廣西那坡以及越南管箔是草果的遺傳多樣性中心，而云南麻栗坡、屏邊、西疇和馬關(guān)可能是擬草果的遺傳多樣性中心，并且提示云南馬關(guān)、麻栗坡、屏邊可能是草果栽培起源地理中心。

圖2 草果和擬草果25個(gè)居群375個(gè)體的PCoA主成分分析

圖3 基于遺傳距離的草果、擬草果居群NJ系統(tǒng)發(fā)育樹

在大量野外調(diào)查和材料采集中并未發(fā)現(xiàn)推定的雜交個(gè)體。草果、擬草果共享等位基因占40.45%，這意味著種質(zhì)滲透，或者是共享祖先的遺傳多樣性[9]。AMOVA分析結(jié)果既支持2物種共享等位基因較多，又與豆蔻屬分子系統(tǒng)研究結(jié)果一致[5]，這表明2物種共享祖先的遺傳多樣性。

豆蔻屬起源于喜馬拉雅[22–23]，其起源、分化歷史較短。草果、擬草果的形態(tài)類似、分子系統(tǒng)上親緣關(guān)系較近[1,5]。目前草果和擬草果間無雜交證據(jù), PCoA結(jié)果也說明其分化歷史短。因?yàn)閷?duì)于共享較多等位基因、在親緣關(guān)系樹上混雜分布的物種之間可能發(fā)生了種質(zhì)滲透，也可解釋2物種分化歷史不久遠(yuǎn)，無論物種間有無雜交[9]。2物種親緣關(guān)系樹也支持草果、擬草果分化歷史較短。非SMM和SMM模式皆表明居群分化是由較高的基因流引起的，而對(duì)分化歷史短的居群，分化主要由隨機(jī)遺傳漂變導(dǎo)致[9]。非SMM和SMM模式下擬草果居群間的遺傳分化均大于草果；考慮等位基因長度的SMM分析，遺傳分化在種間、同種居群間均加大(表5)。因此，草果、擬草果的分化可能是經(jīng)隨機(jī)遺傳漂變完成譜系分選后基因突變積累的結(jié)果。

當(dāng)=3時(shí)，基因池占比表明XH、TC、MB和YP居群與擬草果的親緣關(guān)系較近(圖1: A)，可能提示這4個(gè)草果居群所處的那坡、麻栗坡、馬關(guān)、屏邊可能是草果栽培起源地理中心?？紤]基因流，基于遺傳距離構(gòu)建的NJ樹(圖3)作為草果居群間親緣關(guān)系的主要依據(jù)。5個(gè)擬草果居群，馬關(guān)居群和其西邊的屏邊居群聚在一起，西疇居群和其東南邊的麻栗坡居群、那坡居群聚在一起。西疇、麻栗坡的擬草果居群和草果居群聚在一起，說明與草果的親緣關(guān)系較近，可能提示西疇、麻栗坡是草果栽培起源的1個(gè)地理中心。與擬草果居群的親緣關(guān)系較近的6個(gè)草果居群(XH、MB、GLJ、ML、FD2和TC)，以及與草果親緣關(guān)系較近的3個(gè)擬草果居群(FDy、TCy和BSy)所處區(qū)域，即麻栗坡、馬關(guān)、屏邊、西疇、那坡可能是草果栽培起源地理中心。20個(gè)草果居群分為4組：組II (GB與XH)與擬草果親緣關(guān)系較近，可能代表了草果祖先居群的某些特征；也可能提示云南馬關(guān)和越南管箔是草果栽培起源地理中心。組III的TBG與GLJ親緣關(guān)系較近，ZH可能是從馬關(guān)引種的，越南居群可能是馬關(guān)居群南遷的結(jié)果，可能提示馬關(guān)是草果栽培起源的1個(gè)地理中心。私有等位基因可以為作物栽培起源中心的研究提供證據(jù)[24]。本研究中MB居群的p最高，其次是YP、GB和TBG居群(表4)，提示云南馬關(guān)、屏邊以及越南河江省可能是草果栽培起源地理中心。

綜上所述，草果栽培起源的地理中心可能是以云南馬關(guān)、屏邊為中心，向其周邊鄰近地區(qū)擴(kuò)散而形成的。馬關(guān)向麻栗坡(鐵廠)、那坡(百省)、西疇(法斗)、越南(河江省等)擴(kuò)散，屏邊向金平(阿德博)擴(kuò)散。YP、MB居群均在大圍山范疇，因此，圍繞大圍山的馬關(guān)、屏邊地區(qū)可能是草果栽培起源地理中心。依據(jù)《開化府志》, 此區(qū)域?qū)儆谠_化府，麻栗坡、馬關(guān)等地已有300多年的草果種植歷史[25]。擬草果遺傳多樣性高于草果，特別在居群間遺傳分化、遺傳多樣性方面，可能緣于草果是栽培植物, 經(jīng)歷人工選擇后，居群丟失了某些特有的等位基因, 且多數(shù)等位基因的分布頻率下降，僅存于少數(shù)居群中。

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Analysis of Cultivation Origin ofBased on SSR Marker

LI Guodong1, TIAN Xing1, ZHAO Xiaoli1,2, YANG Yaowen1*

(1. Yunnan Key Laboratory of Dai and Yi Medicines, Yunnan University of Chinese Medicine,Kunming 650500, China; 2. Dehong People’s Hospital,Luxi 678400, Yunnan, China)

In order to explore the genetic diversity and geographical origin of, the genetic variation ofandin 8 SSR loci was studied. The results showed that there was 149 and 101 alleles were detected at 8 SSR loci from 20 populationsofand 5 populations ofrespectively, among which 44, 59 were unique alleles. Variance analysis (AMOVA) showed that only 10.43% of genetic variation existed between two species, 8.66% between populations, and 80.91% within populations (<0.01). The total genetic differentiation ofwas moderate (0.05≤st≤0.15), andwas high (0.15≤st≤0.25). The genetic differentiation of the two species increased under SMM model (st

;; SSR marker; Genetic diversity; Origin of cultivation

10.11926/jtsb.4377

2021-01-12

2021-04-30

云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究-中醫(yī)聯(lián)合項(xiàng)目(2018FF001-010, 2017FF116-004); 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81660631); 重大科技專項(xiàng)(2018ZF010-1)資助

This work was supported by the Cooperation Project of Traditional Chinese Medicine and Application Fundamental Research in Yunnan (Grant No. 2018FF001-010, 2017FF116-004), the National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81660631), and the Special Project for Major Science and Technology (Grant No. 2018ZF010-1).

李國棟(1984～ )，男，博士，副教授，主要從事中藥資源學(xué)與分子生藥學(xué)的教學(xué)與研究。E-mail: gammar116@163.com

通信作者 Corresponding author. E-mail: yangyaowen@ynutcm.edu.cn