◎ 萬 欣，盧宗梅，周 勇，陳 影，劉利利，葉 震，何 珣，陳可泉

（1.南京工業(yè)大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，江蘇 南京 211816；2.中糧生物科技股份有限公司，安徽 蚌埠 233000）

在過去的幾十年里，益生菌在動物營養(yǎng)和人類健康領(lǐng)域的應(yīng)用已展現(xiàn)優(yōu)勢，如替代化學(xué)合成抗生素、降低血清膽固醇、增強(qiáng)生物機(jī)體免疫功能、治療腸道疾病等[1-3]。益生菌能夠發(fā)揮益生功能的前提是它們必須在環(huán)境條件下有效儲存和在胃腸道（GIT）條件存活下來。因此，為了使益生菌能有效保存和提高其在通過胃腸道過程時的生存能力，將益生菌封裝到不易消化的食材中已被證明是非常重要且有效的。封裝涉及將益生菌細(xì)胞固定在聚合物基質(zhì)中，該基質(zhì)能夠在環(huán)境條件和胃中保留其結(jié)構(gòu)，然后在腸道遠(yuǎn)端降解和溶解[4-5]。在目前被研究和使用的不同類型封裝材料中，β-葡聚糖是一種獨特的多糖，可以有效地被用作密封劑和熱保護(hù)劑。β-葡聚糖的獨特之處在于其固有的蜂窩狀結(jié)構(gòu)，這是其他多糖所沒有的，這也使益生菌細(xì)胞容易被包裹在網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中。

β-葡聚糖是一種無支鏈多糖，由β-D-吡喃葡萄糖單元通過1,3-、1,4-和1,6-糖苷鍵連接[6-8]。β-葡聚糖具有益生元性質(zhì)，能對動物和人類健康產(chǎn)生有益影響。β-葡聚糖作為益生元已被廣泛研究。但是，到目前為止，還沒有研究使用β-葡聚糖作為益生菌細(xì)胞的包封劑。考慮到這些因素，本研究旨在利用β-葡聚糖作為一種新型壁材料，用于封裝益生菌細(xì)胞和評估其耐受熱、低pH值和胃腸道壓力的能力以及封裝細(xì)胞在環(huán)境條件下的儲存穩(wěn)定性。

1 材料和方法

1.1 材料與設(shè)備

植物乳桿菌Lactobacillus plantarumCGMCC 15013，來源于中糧生物科技股份有限公司。研究中使用的所有化學(xué)品均為分析級。Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在無菌MRS培養(yǎng)基（上海吉至生化科技有限公司，中國）中生長12 h。胰酶（Sigma-Aldrich公司，美國）。

JSM-5900掃描電子顯微鏡（JEOL公司，日本）。

1.2 封裝

通過將3 g/100 mL β-葡聚糖和1 mLLactobacillus plantarumCGMCC 15013培養(yǎng)液充分混合來制備漿液；向該混合物中加入0.02 mL/100 mL吐溫80；之后將混合物劇烈攪拌10 min直至其乳化并呈現(xiàn)乳脂狀；然后向該混合物中加入33 mL PEG（聚乙二醇）并進(jìn)行分離（30 min）；用含有5 mL/100 mL甘油的0.9 g/100 mL鹽水洗滌，冷凍干燥并分別在4 ℃和25 ℃下儲存。

1.3 掃描電子顯微鏡

將樣品放置在附著于圓形鋁制樣品樁的膠帶上。用金-鈀垂直涂覆后，使用JSM-5900掃描電子顯微鏡在5 kV的加速器電位下對樣品拍照。

1.4 封裝率和儲存穩(wěn)定性

將1 g膠囊化微珠重新懸浮在9 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol·L-1，pH=7.0）中，然后均質(zhì)化 15 min。菌落形成單位（CFU·g-1）通過將培養(yǎng)物稀釋適當(dāng)倍數(shù)后涂布在瓊脂平板上，并在37 ℃條件下培養(yǎng)48 h來確定。使用方程（1）計算微囊化過程中的封裝率（EY）（%）：

式中：N是微膠囊中的活細(xì)胞數(shù)（logCFU·g-1），N0是制備過程中添加的活細(xì)胞的初始數(shù)量（logCFU·g-1）。

為了確定封裝益生菌細(xì)胞的儲存穩(wěn)定性，在4 ℃和和25 ℃下，每15天間隔計算活菌數(shù)，持續(xù)2個月。

1.5 在模擬胃液（SGJ）中存活

新鮮模擬胃液是通過將3 g·L-1胃蛋白酶懸浮在無菌生理鹽水（9 g·L-1）中制備，并用 1.0 mol·L-1HCl將pH調(diào)節(jié)至3.0。將0.2 g膠囊化微珠（4 ℃儲存）和游離細(xì)胞分別懸浮在10 mL模擬胃液中，并在37 ℃下以50 r·min-1的速度持續(xù)攪拌5 min、30 min、60 min和120 min。SGJ中的活菌計數(shù)確定為logCFU·g-1。

1.6 在模擬腸液（SIJ）中存活

取0.2 g膠囊化微珠和游離細(xì)胞，分別懸浮在模擬腸液中。腸液中含有1 mg·mL-1胰酶和7 mL新鮮雞膽，用0.1 mol·L-1NaOH溶液將pH值調(diào)節(jié)至8.0。懸浮液在37 ℃下孵育6 h，SIJ中的活菌計數(shù)確定為logCFU·g-1。

1.7 游離和微囊化細(xì)胞在冷凍和熱處理下的活菌數(shù)

將1 g微膠囊和1 mL游離細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到各含有10 mL無菌蒸餾水的試管中，并在不同溫度（-75 ℃、55 ℃、65 ℃和75 ℃）處理樣品1 min和10 min。

1.8 統(tǒng)計分析

使用商業(yè)統(tǒng)計軟件包STATISTICA（StatSoft）計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差、方差分析（ANOVA）。然后在5%的顯著性水平上使用Duncan的多重范圍檢驗對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行比較。

2 結(jié)果和分析

2.1 掃描電子顯微鏡觀察結(jié)果

掃描電子顯微鏡用于觀察和研究干燥微膠囊的表面形態(tài)。β-葡聚糖具有粗糙表面和較大孔徑的蜂窩。有文獻(xiàn)報道了β-葡聚糖的分子結(jié)構(gòu)為類似螺旋纏繞結(jié)構(gòu)[9]，其致密、無裂紋的表面特征與內(nèi)部蜂窩狀結(jié)構(gòu)一起，可使β-葡聚糖能夠更好地承受機(jī)械應(yīng)力并保護(hù)所含成分免受惡劣環(huán)境（例如氧化、光照、低或高pH值）的影響。含有Lactobacillus plantarumCGMCC 15013菌株的SEM照片顯示，細(xì)菌細(xì)胞可以被包裹在β-葡聚糖中（圖1b）。利用乳化法包囊在含有藻酸鹽的植物乳桿菌CM53微膠囊中也報道了類似的分布模式[10]。

圖1 β-葡聚糖封裝Lactobacillus plantarum CGMCC 15013的SEM圖

2.2 封裝率和儲存穩(wěn)定性

封裝的目的是保護(hù)封裝的益生菌細(xì)胞免受有害環(huán)境條件的影響，例如熱應(yīng)激、胃腸應(yīng)激和滲透應(yīng)激等，并提高細(xì)胞在儲存過程中的穩(wěn)定性[11]。Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的初始活菌計數(shù)（logCFU·g-1）和封裝率（%）分別為9.54和75.33%（p＞0.05）。乳化過程在室溫下進(jìn)行，有助于獲得良好的封裝率。使用乳化法進(jìn)行封裝時，與來自甜菜、菊苣和燕麥的β-葡聚糖的封裝率相似[12]。在4 ℃和25 ℃下，間隔15天、持續(xù)2個月的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的生存能力顯示在圖2在4 ℃貯存60天后，包裹在β-葡聚糖中的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活量降至3.23 logCFU·g-1；而在25 ℃貯存60天后Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活量降至1.11 logCFU·g-1（圖2）。

圖2 封裝Lactobacillus plantarum CGMCC 15013的儲存穩(wěn)定性圖

然而，游離Lactobacillus plantarumCGMCC在4 ℃和25 ℃下儲存60 天后的存活量都幾乎可以忽略不計。結(jié)果表明，與游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013相比，封裝Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活力損失最小。儲存后游離乳酸菌活力降低可能是由于環(huán)境壓力造成的。然而，封裝可以保護(hù)細(xì)胞免受這些不利環(huán)境條件的影響[13]。益生菌的特征之一是它作為配方產(chǎn)品應(yīng)具有耐受儲存期的能力。特殊類型的涂層材料用于增強(qiáng)微生物的這種特性，這是將益生菌封裝在β-葡聚糖基質(zhì)中的首次報告。β-葡聚糖已被報道為一種潛在的益生元，將益生菌摻入這樣的包衣材料中，既可作為益生元又可作為包封材料，通過促進(jìn)乳酸桿菌和雙歧桿菌等有益微生物群落的生長，證明對胃腸道有益并在產(chǎn)品制造過程中保護(hù)益生菌[14]。

2.3 在模擬胃液（SGJ）中存活

將游離和封裝的益生菌暴露于模擬胃液中，然后進(jìn)行比較。如表1所示，與游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013相比，β-葡聚糖封裝的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在高酸性胃條件下能夠顯著保持活力（p＜0.05）。游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013 活 菌 數(shù) 為 9.54 logCFU·g-1， 但 在 暴 露于模擬胃液60 min后，游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013 的 存 活 量 降 低 至 1.01 logCFU·g-1；在暴露于模擬胃液120 min后沒有觀察到活菌。將包裹的細(xì)胞暴露于模擬胃液120 min后，發(fā)現(xiàn)Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的活細(xì)胞數(shù)為 1.23 logCFU·g-1。這些結(jié)果表明，β-葡聚糖在模擬胃液消化過程中為乳桿菌提供了有效保護(hù)，這可能是由于β-葡聚糖在低pH值范圍內(nèi)的穩(wěn)定性以及人體胃腸道區(qū)域中不存在β-葡聚糖水解酶。

表1 β-葡聚糖包裹細(xì)胞在模擬胃液中的存活能力表

2.4 在模擬腸液（SIJ）中存活

模擬腸液對游離和微囊化Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活力的影響見表2。結(jié)果顯示，β-葡聚糖包裹的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013在模擬腸道條件下的存活數(shù)量明顯高于游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013（p＜ 0.05）。暴露于模擬腸液6 h后，封裝的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活 菌 數(shù) 從9.54 logCFU·g-1降 低 至5.28 logCFU·g-1。暴露于膽鹽溶液6 h后，游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013未觀察到活菌。游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活數(shù)減少可能是由于細(xì)胞壁被破壞[15]。β-葡聚糖通過阻止被包裹的細(xì)胞與膽汁鹽相互作用來提供對細(xì)胞壁破壞的抵抗力[7]。以低聚果糖（FOS）作為壁材的微囊化植物乳桿菌也觀察到了類似的結(jié)果[4]。

表2 β-葡聚糖包裹細(xì)胞在模擬腸液中的存活能力表

2.5 冷凍和熱處理下的存活

分別暴露于-75 ℃、55 ℃和75 ℃下10 min后，游離和微囊化Lactobacillus plantarumCGMCC 15013的存活情況如表3所示。游離活細(xì)胞數(shù)和微囊化后活細(xì)胞數(shù)之間差異顯著（p＜0.05）。游離Lactobacillus plantarumCGMCC 15013細(xì)胞對冷凍和熱處理都非常敏感。在-75 ℃冷凍條件下，游離活細(xì)胞數(shù)量從9.54 logCFU·g-1減少到 5.11 logCFU·g-1；在 55 ℃下加熱10 min后，游離活細(xì)胞數(shù)量減少至3.57 logCFU·g-1；75 ℃下加熱10 min后，游離細(xì)胞無存活，這可能是因為細(xì)菌細(xì)胞的核酸和蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)因加熱變性，而最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[8]。

表3 β-葡聚糖包裹細(xì)胞在冷凍和高溫處理下的存活能力表（活菌計數(shù)單位：logCFU·g-1）

封裝的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013細(xì)胞在55 ℃下存活良好。與游離細(xì)胞相比，被包裹的細(xì)胞對熱的敏感性較低。封裝的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌數(shù)僅從 9.54 logCFU·g-1減少至7.15 logCFU·g-1。

當(dāng)溫度從55 ℃增加到75 ℃，并在此溫度條件下暴露10 min后，Lactobacillus plantarumCGMCC 15013活菌數(shù)為1.22 logCFU·g-1。β-葡聚糖可以作為微生物細(xì)胞抵御嚴(yán)酷外部條件的物理屏障，一定程度上增加被封裝細(xì)胞的活力[6-8]。同為多糖材料的金合歡樹膠已被證明可以在熱應(yīng)激期間為副干酪乳桿菌Lactobacillus paracaseiNFBC 338提供良好的保護(hù)作用。

3 結(jié)論

目前的工作已經(jīng)證明了β-葡聚糖可以作為封裝益生菌的潛在壁材，以提高的益生菌的生存能力。包裹在β-葡聚糖基質(zhì)中的Lactobacillus plantarumCGMCC 15013對冷凍、熱處理、模擬胃腸道條件和儲存的耐受性有所提高。通過SEM圖片可以清楚地看出β-葡聚糖能夠?qū)actobacillus plantarumCGMCC 15013進(jìn)行有效包裹。因此，β-葡聚糖封裝益生菌可以提供一種功能性微生物菌劑長期保存的方法。