李軼奕，劉順治，謝婷婷，范世明，丘鷹昆*

(1.廈門大學(xué)，福建 廈門 361105；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)，福建 福州 350122)

金線蓮(Anoectochilus roxburgii)為蘭科(Orchidaceae)開(kāi)唇蘭屬(Anoectochilus)植物，葉脈金黃色或紫紅色，具清熱解毒、消炎止痛等功效[1]。銀線蓮(Goodyera hachijoensis)屬于斑葉蘭屬(Goodyera)，它是一種呈現(xiàn)白網(wǎng)脈斑狀的植物，具有清熱解毒、活血化瘀及消腫止痛等功效[2]。近年來(lái)，金線蓮被大量開(kāi)發(fā)利用，野生資源稀缺，種群數(shù)量急劇減少[3—4]。金線蓮與銀線蓮?fù)瑢偬m科，外觀及藥用功效具有較高相似度，但是二者存在本質(zhì)的區(qū)別，市場(chǎng)上時(shí)有將銀線蓮混作金線蓮出售[5]。另外，金線蓮組織培養(yǎng)和人工栽培技術(shù)也取得一定進(jìn)展，但由于培養(yǎng)條件的差異，其形態(tài)學(xué)性狀及有效成分有所不同，降低藥材質(zhì)量。為鑒定金線蓮藥材，Long等[6]建立了興仁金線蓮的 HPLC指紋圖譜，標(biāo)定了20個(gè)共有指紋峰。Wu等[7]建立了不同產(chǎn)地金線蓮的HPLC指紋圖譜，并應(yīng)用該圖譜對(duì)銀線蓮進(jìn)行質(zhì)量判斷，驗(yàn)證了圖譜的可靠性。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)金線蓮的研究主要集中在生物學(xué)特性表征、組培、栽培模式優(yōu)化等方面[8—10]，對(duì)有效成分的提取分離純化鑒定、藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)建立等方面研究較少。本文建立金線蓮常見(jiàn)栽培品種及野生樣品的HPLC指紋圖譜，利用此圖譜對(duì)金線蓮質(zhì)量進(jìn)行評(píng)判，旨在為金線蓮藥材鑒別及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與試劑

儀器：超聲波清洗器(KQ5200V，昆山市超聲儀器有限公司)；純水儀(美國(guó) Millipore)；高效液相色譜儀(Agilent 1100，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-20AT，日本Shimadzu)。

試劑：甲醇(色譜純，F(xiàn)airfleld，CT，美國(guó))；乙腈(色譜純，F(xiàn)airfleld，CT，美國(guó))；甲酸(分析純，西隴化工股份有限公司)。

1.1.2 藥材

南靖產(chǎn)地金線蓮樣品和銀線蓮樣品購(gòu)自福建憶閩南金線蓮種植有限公司，廣西、廣東產(chǎn)地金線蓮購(gòu)自當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)(表1、表2)。

表1 不同類型金線蓮來(lái)源Table 1 Origin of different Anoectochilus roxburghii materials

表2 三種銀線蓮來(lái)源Table 2 Origin of Goodyera hachijoensis materials

1.2 方法

1.2.1 供試品溶液制備

藥材鮮品經(jīng)80℃烘箱干燥24 h后，粉碎。精密稱取干燥至恒重的藥材粉末1 g，置于15 mL離心管中，加入10 mL甲醇，稱重，超聲提取30 min，以甲醇補(bǔ)足重量，3000 r·min-1離心15 min，取上清液，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，用于HPLC指紋圖譜的測(cè)定。

以金線蓮7號(hào)樣品的供試品溶液作為條件優(yōu)化及方法學(xué)考察的樣本。

1.2.2 色譜條件

采用Kinetex XB-C18色譜柱(250 mm × 4.6 mm i.d., 5 μm)以0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)為流動(dòng)相，梯度洗脫(0→10→20→45→70→100→110 min，0%→3%→10%→20%→40%→100%→100%B)，流速為1.2 mL·min-1；柱溫為室溫；進(jìn)樣量為10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 指紋圖譜方法學(xué)考察

2.1.1 精密度試驗(yàn)

取供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，計(jì)算各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，結(jié)果表明：各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD值為0.02%～0.32%，相對(duì)峰面積的 RSD值為0.09%～4.06%，儀器精密度良好，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

2.1.2 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜方法，分別在0、6、12、18、24、36、48 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有色譜峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD值為0.01%～1.13%，相對(duì)峰面積的 RSD值為0.94%～4.26%。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

2.1.3 重復(fù)性試驗(yàn)

按1.2.2項(xiàng)下方法平行制備6份供試液，按1.2.1項(xiàng)下色譜方法進(jìn)樣檢測(cè)，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積。各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的 RSD值為 0.04%～1.28%，相對(duì)峰面積的 RSD值為2.01%～4.73%。表明該方法重復(fù)性良好，符合指紋圖譜研究的技術(shù)要求。

2.2 HPLC指紋圖譜的建立及相似度分析

2.2.1 指紋圖譜建立

取14批不同類型金線蓮樣品，按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，1.2.1項(xiàng)下方法進(jìn)行HPLC檢測(cè)。采取多點(diǎn)校正及自動(dòng)匹配方式，建立金線蓮的指紋圖譜及對(duì)照指紋圖譜，分別如圖1、圖2所示。

圖1 金線蓮HPLC指紋圖譜Fig. 1 HPLC fingerprint of Anoectochilus roxburghii

圖2 金線蓮HPLC對(duì)照指紋圖譜Fig. 2 HPLC reference fingerprint of Anoectochilus roxburghii

2.2.2 共有峰的確定

參照峰的選擇：根據(jù)《中藥注射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求》[11]，以內(nèi)標(biāo)物作為參照物的指紋圖譜，可以將共有峰中其中一個(gè)峰(要求峰面積相對(duì)較大、較穩(wěn)定的共有峰)的峰面積作為 1，計(jì)算其他各共有峰面積的比值。在金線蓮指紋圖譜中，保留時(shí)間為46.70 min的峰面積相對(duì)較大，保留時(shí)間穩(wěn)定，所以選擇為內(nèi)標(biāo)參照峰。

共有峰的確定：色譜法采用相對(duì)保留時(shí)間標(biāo)定指紋峰。在圖1所示不同品種金線蓮的HPLC 指紋圖譜中，通過(guò)對(duì)比相對(duì)保留時(shí)間，確定了24個(gè)峰為共有指紋峰(圖2)。

對(duì)比分離得到的化合物保留時(shí)間，確認(rèn)其中 6個(gè)共有峰的成分。其中1號(hào)共有峰含有金線蓮苷和葫蘆巴堿，18號(hào)共有峰為異鼠李素-3-O-蕓香糖苷，20號(hào)共有峰為槲皮素，21號(hào)共有峰為山柰酚，22號(hào)共有峰為異鼠李素，23號(hào)共有峰為Batatasin-Ⅲ。

2.2.3 相似度評(píng)價(jià)

將HPLC色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)出AIA格式文件，導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)提供的“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”，對(duì)14批金線蓮藥材的特征指紋圖譜進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，以生成的對(duì)照?qǐng)D譜為對(duì)照，在相似度計(jì)算時(shí)采用多點(diǎn)校正方式及自動(dòng)匹配方式，其結(jié)果見(jiàn)附錄表5。除S4，S5，S12之外，相似度均在0.91以上，各批樣品相似度良好。S4和S5、S12的相似度稍差，分別為0.842、0.822和0.778。

2.2.4 指紋圖譜應(yīng)用

采用人工栽培的銀線蓮樣品，檢驗(yàn)所建立的指紋圖譜的區(qū)分能力。三種銀線蓮藥材粉末按1.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按1.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，所得的圖譜與金線蓮對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行比較，采取多點(diǎn)校正及自動(dòng)匹配方式計(jì)算相似度，見(jiàn)圖3。銀線蓮大棚種植(Y1)、組織培養(yǎng)(陽(yáng)光照射)(Y2)、組織培養(yǎng)(Y3)與金線蓮對(duì)照指紋圖譜(S4)的相似度分別為 0.529、0.721、0.698，均低于各金線蓮樣品種內(nèi)的相似度，根據(jù)指紋圖譜可以將金線蓮樣品與相近品種銀線蓮很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)。

圖3 指紋圖譜的應(yīng)用Fig. 3 Application of HPLC fingerprint

3 討論

本研究采用HPLC建立金線蓮指紋圖譜，結(jié)果顯示，該方法操作簡(jiǎn)單，重復(fù)性好。我們分別考察了不同流動(dòng)相(甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液)、不同類型色譜柱(Cosmosil 5C18-MS-II、Cosmosil 5C18-PAQ、Kinetex XB-C18、Ulitimate XB-C18)、不同檢測(cè)波長(zhǎng)(210 nm、230 nm、260 nm、280 nm、310 nm、360 nm)、不同流速(0.8、1.0、1.2 mL·min-1)對(duì)金線蓮指紋圖譜色譜峰的影響。結(jié)果顯示，采用Kinetex XB-C18色譜柱，以乙腈-0.1%甲酸水為流動(dòng)相，在260 nm檢測(cè)波長(zhǎng)、流速 1.2 mL·min-1色譜條件下色譜峰的分離度較好且色譜峰數(shù)目較多。我們對(duì)提取溶劑(水、20%、40%、60%、80%甲醇、乙醇)、提取方式(超聲、回流)、提取時(shí)間(30 min、45 min、60 min)也進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示，甲醇超聲提取得到的色譜峰較其他溶劑數(shù)量多，且各色譜峰分布比較均勻，基線平穩(wěn)。超聲和回流提取所測(cè)得的圖譜無(wú)明顯差異，但超聲提取所需時(shí)間短，操作簡(jiǎn)便。提取時(shí)間在30 min時(shí)樣品已提取完全，45、60 min所得色譜峰數(shù)量和面積并無(wú)明顯增加。因此，我們提取溶劑選用甲醇，提取方式選取超聲提取，提取時(shí)間選擇30 min。

14批藥材的 HPLC指紋圖譜中，通過(guò)計(jì)算相對(duì)保留時(shí)間，標(biāo)定了 24個(gè)共有峰，相對(duì)保留時(shí)間的RSD在0.034%～1.377%之間，峰面積的 RSD值在27.33%～129.59%。通過(guò)與分離得到的化合物保留時(shí)間對(duì)比，指認(rèn)了其中6個(gè)共有峰。14批樣品共有峰的保留時(shí)間基本一致，表明該研究所建立的指紋圖譜相似度及穩(wěn)定性都比較高，可為金線蓮栽培品種的質(zhì)量和品種鑒定提供一定的依據(jù)；但共有峰的相對(duì)面積差異較大，可能與栽培品種、培養(yǎng)模式的不同相關(guān)，其規(guī)律有待進(jìn)一步研究。用該指紋圖譜對(duì)易混淆品種銀線蓮進(jìn)行鑒定，三類銀線蓮樣品與金線蓮的對(duì)照指紋圖譜相似度為0.529、0.721、0.698，均低于14批金線蓮樣品種內(nèi)的相似度，證實(shí)了銀線蓮和金線蓮是有實(shí)質(zhì)性差別的，從而證明了該指紋圖譜的可靠性。