蔡國林，周佳慧，樊 振，趙燕慧，周孝東，孫海彥，龍 杰

1.江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室(無錫 214122)2.新疆天康飼料有限公司 (五家渠 831300)3.江蘇艾生牧飼料有限公司 (鹽城 224343)4.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶生物技術(shù)研究所 (?？?571101)5.廣州譽(yù)衡生物科技有限公司 (廣州 510670)

乳酸菌(Lactic acid bacteria, LAB)是指一群可發(fā)酵碳水化合物、產(chǎn)生大量乳酸的革蘭氏陽性球菌或桿菌的統(tǒng)稱。乳酸菌不僅擁有獨(dú)特的氨基酸代謝系統(tǒng)，能夠特異性吸收某些氨基酸，而且其產(chǎn)生的乳酸、乙酸等有機(jī)酸以及各種小肽、游離氨基酸還能改善飼料風(fēng)味。乳酸菌成為國內(nèi)固態(tài)發(fā)酵飼料開發(fā)的重要益生菌資源[1]?；ㄉ勺鳛橐环N潛在的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料，精氨酸與賴氨酸比例失衡問題限制了其在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用，過量的精氨酸是造成其產(chǎn)生氨基酸拮抗作用的主要因素，降低精氨酸含量、提高賴氨酸含量成了解除花生粕應(yīng)用限制的關(guān)鍵因素。

目前，針對花生粕賴氨酸、蛋氨酸含量不足的問題，人們提出了相應(yīng)的解決辦法，向飼料中額外添加賴氨酸或蛋氨酸，以保證飼料中精氨酸與賴氨酸比例達(dá)到平衡。賴氨酸鹽酸鹽進(jìn)入動物體內(nèi)，多為游離的狀態(tài)，大量游離賴氨酸的攝入會使得動物對該物質(zhì)吸收過快，造成氨基酸之間新的不平衡，不僅引起其他氨基酸吸收率下降，而且產(chǎn)生負(fù)氮平衡，使動物出現(xiàn)營養(yǎng)不良、代謝功能衰退等癥狀[2]。因此，僅通過向花生粕飼料中添加賴氨酸鹽酸鹽或硫酸鹽并不能從根本解決氨基酸不平衡問題，甚至可能會對畜禽的生長產(chǎn)生嚴(yán)重的副作用[3]。此外，蔡國林采用卡式酵母JD-15和馬克斯克魯維酵母JD-16發(fā)酵花生粕，明顯提高了賴氨酸和蛋氨酸的產(chǎn)量，但精氨酸含量無顯著改變[4]；任曉靜利用LactobacilluscaseiR-07結(jié)合酶制劑固態(tài)發(fā)酵花生粕，發(fā)現(xiàn)賴氨酸含量由1.51%提高至1.76%，在一定程度上改善花生粕中氨基酸不平衡的問題，但精氨酸與賴氨酸比例仍超過3∶1[5]，這可能與所采用的乳酸菌不能高效利用精氨酸有關(guān)。 因此，通過篩選既能吸收利用精氨酸又不產(chǎn)生生物胺的乳酸菌來發(fā)酵精氨酸含量過多的花生粕，不僅可以解決精氨酸與賴氨酸等其他氨基酸比例不平衡的問題，而且避免大量瓜氨酸作為有機(jī)氮源流失、以及被作為前體物質(zhì)生成有毒的生物胺的問題，促進(jìn)微生物對于有機(jī)氮源的再利用，進(jìn)而提高花生粕的飼用品質(zhì)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1培養(yǎng)基的制備

(1)MRS培養(yǎng)基：參考禹偉論文中培養(yǎng)基配置方法[6]。

(2)MRS-CaCO3培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加2.0 g/L的CaCO3，115 ℃滅菌20 min[7]。

(3)改良生物胺培養(yǎng)基：參考文獻(xiàn)[8]。

(4)MRS-Arg培養(yǎng)基：在MRS培養(yǎng)基中添加5 g/L精氨酸，115 ℃滅菌20 min。

(5)改良MRS-Arg培養(yǎng)基：MRS-Arg培養(yǎng)基中胰蛋白胨和牛肉膏添加量減半。

(6)改良液體脫羧培養(yǎng)基：參考文獻(xiàn)[9]。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1能利用精氨酸的乳酸菌的初篩

取1.0 g花生粕原料置于3 mL MRS液體培養(yǎng)基37 ℃靜置培養(yǎng)3 d，轉(zhuǎn)移至30 mL MRS液體培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2 d，吸取培養(yǎng)液1 mL，用無菌生理鹽水依次稀釋10-3、10-4、10-5、10-6倍，每個(gè)稀釋度取100 μL與MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基混合倒平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基菌落生長，挑取有明顯溶鈣圈的單菌落，于MRS固體培養(yǎng)基劃線純化，再挑取單菌種于MRS液體培養(yǎng)基靜置培養(yǎng)24 h，甘油管保藏。取浸米水、黃酒發(fā)酵液、泡菜發(fā)酵液、東北酸菜發(fā)酵液，按照上述相同步驟處理，甘油管保藏菌株[7]。

取甘油保藏菌株按2%的接種量接入1 mL MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后轉(zhuǎn)接于3 mL MRS培養(yǎng)基，待其OD600達(dá)到0.8～1.0時(shí)，按2%接種量接種到1 mL的改良MRS-Arg液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)18 h，渦旋震蕩，取200 μL菌液于96空板，測定OD600的值，比較菌體生長濃度，篩選生長能力強(qiáng)的菌株。

1.2.2能利用精氨酸且不產(chǎn)生物胺的乳酸菌的初篩

選擇生長能力強(qiáng)的菌株，按照2%的接種量接種于1 mL的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)，待其OD600達(dá)到0.8～1.0時(shí)，按1%接種量接種于改良生物胺培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)3 d，10 000 × g、4 ℃離心5 min，取上清200 μL于96孔板，在每個(gè)孔中加入50 μL 1.0 g/L的溴甲酚紫指示劑反應(yīng)10 min，原始培養(yǎng)基作對照。根據(jù)菌株利用精氨酸經(jīng)ADI途徑代謝產(chǎn)生氨以及微生物通過氨基酸脫羧酶作用于氨基酸脫羧而生成生物胺引起培養(yǎng)基pH變化導(dǎo)致培養(yǎng)基顏色變紫的原理，初步篩選出既能吸收利用精氨酸又不產(chǎn)生氨和生物胺的乳酸菌[8]。

1.2.3能利用花生粕精氨酸的乳酸菌的確定

取初步篩選的保藏菌，按照2%的接種量接種于1 mL的MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃靜置培養(yǎng)，待其OD600達(dá)到0.8～1.0時(shí)，按1%接種量接種于MRS-Arg培養(yǎng)基，30 ℃靜置培養(yǎng)3 d，取1 mL菌液，10 000 × g、4 ℃離心5 min，取上清500 μL與5%(w/v)TCA按照等體積混合，4 ℃過夜沉淀蛋白，10 000 × g、4 ℃離心10 min，取上清10 μL與100 μL OPA混合衍生，于HPLC測定精氨酸含量，每個(gè)菌株作兩個(gè)平行，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差[10]。

對篩選出的高精氨酸利用菌株進(jìn)行生物胺產(chǎn)生能力測定。樣品衍生化處理及色譜條件的選擇參照王然然的論文[9]。

1.2.4能利用花生粕精氨酸的乳酸菌的鑒定

利用細(xì)菌DNA抽提試劑盒對所選乳酸菌的DNA進(jìn)行提取，提取的細(xì)菌 DNA進(jìn)行PCR，PCR擴(kuò)增后的序列，由蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測序，測得的基因序列在NCBI上進(jìn)行Blast 比對分析，并建立系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.5短乳桿菌Z-73在花生粕發(fā)酵上的初步應(yīng)用

(1)在未預(yù)消化處理花生粕上的應(yīng)用

取40.0 g花生粕和200 mL蒸餾水，混合均勻，調(diào)節(jié)pH 5.5，轉(zhuǎn)移至500 mL錐形瓶，121 ℃滅菌20 min，冷卻后接種二級活化的乳酸菌(1.0 × 109CFU/mL)，接種量5%，發(fā)酵48 h，發(fā)酵結(jié)束后冷凍干燥并粉碎得到發(fā)酵花生粕。

(2)在預(yù)消化處理花生粕上的應(yīng)用

取40.0 g花生粕和200 mL蒸餾水，混合均勻，95 ℃預(yù)處理20 min后，降溫至50 ℃，分別加入纖維素酶100 U/g和10 U/g(以花生粕重量計(jì))，50 ℃酶解1 h，接著添加酸性蛋白酶1 500 U/g酶解4 h，再添加風(fēng)味蛋白酶5 000 U/g酶解1 h，最后添加胰蛋白酶250 U/g，40 ℃酶解1 h，酶解結(jié)束后接種二級活化的乳酸菌(1.0 × 109CFU/mL)，接種量5%，發(fā)酵48 h，發(fā)酵結(jié)束后冷凍干燥并粉碎得到酶解發(fā)酵花生粕。

以花生粕作為對照，對發(fā)酵花生粕和酶解發(fā)酵花生粕進(jìn)行游離精氨酸和水解精氨酸含量的測定，考察短乳桿菌Z-73在花生粕氨基酸平衡上的初步應(yīng)用。

2 結(jié)果與討論

2.1 能利用精氨酸的乳酸菌的初篩

從花生粕、浸米水、黃酒發(fā)酵液、泡菜發(fā)酵液、東北酸菜中共篩選出151株具有較大溶鈣圈的菌株，初步判定為乳酸菌。將這151株乳酸菌接入MRS-Arg培養(yǎng)基，對這些菌株進(jìn)行精氨酸耐受性實(shí)驗(yàn)，考察它們在高精氨酸環(huán)境下的生長能力，這些菌株的生長能力頻數(shù)分布如圖1所示。由圖1可知，OD600值超過0.9的菌株有79株，初步判定這些菌株具有較好的精氨酸利用能力。

圖1 MRS-Arg培養(yǎng)基中菌株的生長能力頻數(shù)分布圖

2.2 能利用精氨酸且不產(chǎn)生物胺乳酸菌的初篩

根據(jù)添加溴甲酚紫對改良生物胺培養(yǎng)基會產(chǎn)生顏色變化的原理，對上述79株乳酸菌進(jìn)一步篩選，以原始培養(yǎng)基作為對照，添加有溴甲酚紫的原始培養(yǎng)基顏色呈現(xiàn)淡綠色，可能是因?yàn)樵寂囵B(yǎng)基pH處于5.2～6.8之間，因而呈現(xiàn)出中間過渡階段的綠色。從圖2可以看出，有13株乳酸菌呈現(xiàn)淡紫色，可能是因?yàn)榫晡樟伺囵B(yǎng)液中的堿性物質(zhì)精氨酸，且產(chǎn)生少量生物胺或NH3[11]，溶液呈現(xiàn)弱堿性，溴甲酚紫變淡紫色。剩余的66株乳酸菌呈現(xiàn)深紫色，可能是因?yàn)檫@些菌株雖然能吸收精氨酸，但會產(chǎn)生的大量生物胺或NH3，使溶液pH偏向于6.8，故溴甲酚紫完全變色。根據(jù)上述分析原理，選擇指示劑顏色為淡紫色的13株菌株，初步判定為既能利用精氨酸又不產(chǎn)生生物胺的目標(biāo)菌株，分別為菌株Z-2，Z-3，Z-5，Z-11，Z-49，Z-50，Z-59，Z-67、Z-69、Z-71、Z-73、Z-77、Z-79。

圖2 利用精氨酸且不產(chǎn)生生物胺菌株的初篩

2.3 能利用花生粕精氨酸的乳酸菌的確定

微生物普遍具有氨基酸脫羧酶基因，能夠使氨基酸脫羧后轉(zhuǎn)變?yōu)樯锇?，多?shù)乳酸菌具有ADI途徑，但是降解精氨酸的能力有所差異，其產(chǎn)生瓜氨酸和鳥氨酸的能力也有所不同，因而最終合成的生物胺的類型和含量就各不相同[6]，利用添加了溴甲酚紫的氨基酸培養(yǎng)基來檢測生物胺的形成僅能初步篩選出具有精氨酸降解能力且不產(chǎn)生生物胺的菌株[12]。因此，需要通過高效液相色譜進(jìn)一步測定13株菌吸收利用精氨酸及產(chǎn)生生物胺的能力，如表1所示，除了乳酸菌Z-59，其他12株乳酸菌的精氨酸利用率均超過95%，其中Z-3、Z-5、Z-73的利用率最高達(dá)到100%，而與菌株Z-3、Z-5相比，Z-73的生物胺生成量最低為未檢出，因此，選擇菌株Z-73作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)發(fā)酵菌株。

表1 不同菌株的精氨酸利用率及生物胺生成量

2.4 乳酸菌Z-73的鑒定

利用細(xì)菌通用引物27F和1492R對目標(biāo)菌株Z-73進(jìn)行擴(kuò)增得到1.8 kb左右片段，測序后片段經(jīng)過NCBI的Blast比對，發(fā)現(xiàn)菌株Z-73與短乳桿菌2633序列一致性最高，為100%，將其命名為：LactobacillusbrevisZ-73。通過MEGA6.0構(gòu)建菌株Z-73的系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。菌株Z-73與Lactobacillusbrevis2633(MT611655.1)的同源性最高，Lactobacillusbrevis2633(MT611655.1)未見降解精氨酸的詳細(xì)報(bào)道。

圖3 菌株Z-73的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.5 短乳桿菌Z-73在花生粕發(fā)酵上的初步應(yīng)用

利用短乳桿菌Z-73對花生粕和酶解預(yù)消化的花生粕直接進(jìn)行發(fā)酵，對發(fā)酵后的產(chǎn)物進(jìn)行精氨酸含量測定，其結(jié)果如圖4所示。與原始花生粕相比，經(jīng)乳酸菌發(fā)酵后的花生粕總精氨酸含量有所減少，由原來的5.29%分別降低至4.99%和3.21%，而游離在發(fā)酵液中的精氨酸由原來的0.34%分別降低為0.02%和0.03%，游離精氨酸近100%被轉(zhuǎn)化，但是原始花生粕和發(fā)酵花生粕的非游離精氨酸含量(非游離精氨酸含量=總精氨酸含量-游離精氨酸含量)幾乎一樣，這說明短乳桿菌Z-73具有高效利用游離精氨酸的能力，但對于非游離狀態(tài)的精氨酸，基本不能利用，轉(zhuǎn)化率極低，而通過蛋白酶酶解的方法，對花生粕進(jìn)行預(yù)消化，形成足量的游離精氨酸，可以促進(jìn)短乳桿菌Z-73對精氨酸的吸收和轉(zhuǎn)化。

圖4 乳酸菌直接發(fā)酵對花生粕精氨酸含量的影響

3 結(jié)論

有較大溶從花生粕、浸米水、黃酒發(fā)酵液、泡菜發(fā)酵液、東北酸菜中篩選出151株具鈣圈的菌株，通過改良MRS-Arg液體培養(yǎng)基初步篩選出79株能夠有效利用精氨酸的菌株，再利用添加有溴甲酚紫指示劑的改良生物胺培養(yǎng)基，篩選獲得13株能夠利用精氨酸且低產(chǎn)生物胺的乳酸菌。通過高效液相色譜定量分析13株乳酸菌吸收精氨酸和產(chǎn)生物胺的能力，發(fā)現(xiàn)乳酸菌Z-73的精氨酸降解率最高達(dá)到100%，生物胺產(chǎn)生量最低(未檢出)，通過16S rDNA序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建對該菌行鑒定，發(fā)現(xiàn)其與短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)的相似度達(dá)到100%，將其命名為短乳桿菌Z-73(LactobacillusbrevisZ-73)。將短乳桿菌Z-73應(yīng)用于花生粕發(fā)酵中，可以將游離精氨酸全部利用。