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一種仿生材料用于腦卒中缺血半影的造影增強研究

2021-12-15 09:14程筱楊芳
關(guān)鍵詞:栓塞造影缺血性

程筱,楊芳

(江蘇省生物材料與器件重點實驗室 東南大學(xué)生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院,江蘇 南京 210009)

0 引言

在過去的20 年中,突發(fā)性腦卒中、由腦卒中引起的傷殘調(diào)整生命年(DALYs,disability-adjusted life-years)及腦卒中相關(guān)的死亡率在世界范圍內(nèi)仍體現(xiàn)為持續(xù)增長[1],這一形勢在發(fā)展中國家表現(xiàn)得更為嚴(yán)峻。數(shù)據(jù)顯示,截止2017 年,腦卒中已成為全球第三大致殘及致死原因,其中缺血性腦卒中占60%以上[1]。根據(jù)預(yù)期,在未來的相當(dāng)一段時間內(nèi),腦卒中對發(fā)展中國家公共醫(yī)療事業(yè)造成的壓力將持續(xù)增長[2]。而在有關(guān)急性缺血性腦卒中臨床治療的探究中,能否在治療時間窗內(nèi)有效搶救缺血半影,很大程度上決定了腦卒中發(fā)病后的臨床生存率,并因此長期占據(jù)著此類研究的焦點。

缺血半影(ischemic penumbra,IP),即局部缺血后受損但尚未死亡(又定義為生理電活動停止但能保持跨膜離子平衡和結(jié)構(gòu)完整或保持能量代謝而血供受限[3])的腦組織區(qū)域。自1977 年半影的概念提出后[4],缺血半影先后接受了在電生理、腦血流及代謝缺血調(diào)節(jié)層面、介導(dǎo)半影細(xì)胞死亡的分子機制層面與臨床神經(jīng)成像器材方面的廣泛研究[5],有關(guān)其治療性搶救的理論可能性,意味著急性缺血性腦卒中臨床診療更為光明的未來。簡而言之,急性缺血性腦卒中病灶的中心區(qū)域通常由于嚴(yán)重供血障礙(或完全缺血)而引起腦細(xì)胞非程序性死亡,而側(cè)支循環(huán)的存在使得缺血半影區(qū)仍能保持一定程度的血流供應(yīng)。半影區(qū)域內(nèi),神經(jīng)細(xì)胞功能受到抑制(部分伴有功能損傷),但在再灌注時間窗內(nèi)仍保持存活并處于生理可逆狀態(tài),即恢復(fù)供血可重新整合代謝、維持系統(tǒng)神經(jīng)功能正常運轉(zhuǎn)。目前,應(yīng)用于腦卒中臨床診斷的技術(shù)中,僅正電子斷層發(fā)射掃描(PET)可識別供血受限但仍存在一定代謝水平的腦組織、磁共振成像(MRI)可實現(xiàn)對缺血病灶區(qū)域受細(xì)胞毒性影響有限的區(qū)域的識別,即對缺血半影的診斷[6]。

PAMNs(Platelet membrane coated L-arginine and magnetic nanoparticles)是一種血小板膜仿生氣體前體藥物納米遞送系統(tǒng)[7],其主要機制為利用血小板膜包被一氧化氮(NO)前體材料L-精氨酸與磁性納米粒子,使其在血管環(huán)境中能夠被血小板膜上的特異性粘附蛋白靶向至卒中病灶,并藉由內(nèi)皮細(xì)胞中一氧化氮合成酶(eNOS)的作用產(chǎn)生信號分子NO,從而達到舒張血管與持續(xù)抑制卒中進一步形成的效果。磁性納米粒子則作為可選擇的外部磁場響應(yīng)劑與MRIT2加權(quán)成像的造影增強成分,適用于在體研究中不同的診斷治療需求?;谇笆鰧τ谌毖胗暗脑\斷需求,PAMNs 可作為一種理想的診療一體化材料應(yīng)用于AIS 半影的診斷輔助與一定程度的應(yīng)急治療。事實上,PAMNs 在本研究中的確表現(xiàn)出了不俗的對AIS 病灶邊緣的顯影增強效果。

本文基于PAMNs 材料在MRI 診斷缺血半影中的造影增強與治療時間窗內(nèi)的治療效果進行了在體表征與討論,期望可為后續(xù)針對急性缺血性腦卒中臨床診療的研究與試驗提供部分佐證與啟發(fā)。

1 實驗方法

1.1 PAMNs 材料的制備與形貌表征

PAMNs 主要通過擠壓過膜法(使得血小板膜、精氨酸與磁性Fe2O3 納米粒子的混合溶液受壓以通過一定孔徑的納米薄膜)制得。本實驗所用材料的制備流程簡述如下:

將采集的新鮮單采血小板置于4℃,4000 g 離心、棄上清液并使用生理鹽水重懸,重復(fù)3 次以去除細(xì)胞器,獲得純凈的血小板膜(nPLT)溶液;

取1mg/mL nPLT 溶 液,以50mmol/L 加 入L- 精 氨 酸(Mw=174.2g/mol)、100μg/mL 加入Fe2O3 納米粒子,所得混合溶液置于水浴超聲10 min 充分混勻;

將混合溶液轉(zhuǎn)移至脂質(zhì)擠出器內(nèi),密封加壓使其通過800 nm 濾膜以形成囊泡結(jié)構(gòu),重復(fù)10 次,可制得本實驗所用PAMNs 材料。

材料的水動力尺寸、電位特性由Nanosight 納米顆粒跟蹤分析儀(NS300,英國Malvern 公司)采集,其內(nèi)部結(jié)構(gòu)通過透射電子顯微鏡(JEM 2100,日本JEOL 公司)與掃描電子顯微鏡(Ultra Plus,德國Carl Zeiss 公司)進行表征。

1.2 光化學(xué)栓塞致腦卒中小鼠模型的制備

所有動物實驗均根據(jù)東南大學(xué)機構(gòu)動物護理和使用委員會制定的動物護理和使用指南進行,該方案經(jīng)東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

本實驗利用在小鼠腦皮層區(qū)域形成光化學(xué)栓塞以模擬急性缺血性腦卒中模型[8]。其具體制備操作簡述如下:

選取6-8 周的SPF 級雄性C57BL/6 小鼠(上海西普爾-必凱實驗動物有限公司),控制體重在20g 左右,以10μL/g體重經(jīng)由腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉劑;

確認(rèn)小鼠進入深度麻醉狀態(tài)后,以10μL/g 體重經(jīng)由尾靜脈注射1%玫瑰紅溶液;

去除小鼠顱頂毛發(fā)并對該區(qū)域進行消毒,以俯臥位固定在手術(shù)臺上,剪開區(qū)域皮膚以充分暴露前鹵,使得直徑為4 mm 的冷光源束垂直照射在其前鹵右下方約2 mm 的頭骨上,調(diào)節(jié)光強至36,照射15 min 以形成光化學(xué)栓塞,制得急性缺血性腦卒中小鼠模型。

圖1 光化學(xué)栓塞腦卒中模型造模示意

1.3 PAMNs 動物模型體內(nèi)磁共振參數(shù)選擇

前述急性缺血性腦卒中模型用于后續(xù)研究時,藥物(PAMNs 與生理鹽水)均通過尾靜脈進行注射,其造影增強與治療效果則通過磁共振T2 加權(quán)成像與T2*加權(quán)成像進行評價。實驗操作簡述如下:

將模型小鼠以俯臥位固定于小動物磁共振成像系統(tǒng)(Biospec 7T/20 USR,德國Bruker 公司)的動物軌道中,通入體積分?jǐn)?shù)位1.5%的異氟烷氣體麻醉劑以麻醉小鼠,加熱軌道使得小鼠體溫維持在如上37℃,并通過心率監(jiān)測系統(tǒng)實時確認(rèn)模型的生命活動水平;

設(shè)置實驗所用TurboRARE-T2 序列的掃描參數(shù)為重復(fù)時間TR=3000.0 ms,回波時間TE=36 ms,平均數(shù)number of average=8,回波鏈長度echo train length=8,翻轉(zhuǎn)角flip angle=135.0°,掃 描 矩 陣尺寸為256×256,切 片 厚 度slice thickness=1mm,視場FOV=20mm×20mm;

設(shè)置實驗所用Flash-T2* 序列的掃描參數(shù)為重復(fù)時間TR=300.0 ms,回波時間TE=7.5 ms,回波鏈長度echo train length=1,翻 轉(zhuǎn) 角flip angle=70.0°,切 片 厚 度slice thickness=0.7 mm;

將急性缺血性腦卒中小鼠模型隨機分為實驗組與對照組(n=3)。通過尾靜脈分別向每只實驗組小鼠注射200μLPAMNs 材料,向每只對照組小鼠注射200μL 生理鹽水,以前述參數(shù)采集其注射前及注射后0.5、1、2、3、4、6 h 時的腦部區(qū)域圖像。

采集所得MRI 數(shù)據(jù)的灰度統(tǒng)計分析與T2 影像所表現(xiàn)的病灶面積統(tǒng)計均采用ImageJ v1.52a 進行測量。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 PAMNs 材料的制備與形貌表征

本實驗制備PAMNs 的水動力直徑為(111.33±9.24)nm,ζ 電位為(-12.93±1.20)mV。圖2 的SEM 和TEM 結(jié)構(gòu)表征可見,制備所得PAMNs 的表面較為光滑,結(jié)構(gòu)呈穩(wěn)定的微球形。

圖2 PAMNs 形貌照片。a) TEM 與b) SEM 下的PAMN

2.2 PAMNs 材料在磁共振成像中對缺血半影的造影增強

PAMNs 材料內(nèi)包含的γ-Fe2O3 納米粒子本身具有一定的磁共振T2 與T2*加權(quán)成像的造影增強性能,其表面包覆的血小板膜納米層又使得材料在腦卒中病灶區(qū)域產(chǎn)生了較強的靶向富集性,此兩方面的作用在圖3 所示的對比時間序列中都明顯可見(T2 影像初始病灶以黃色箭頭標(biāo)出,T2*影像初始病灶以紅色箭頭標(biāo)出)。

圖3 PAMNs 在MRIT2 與T2*加權(quán)成像中的造影增強

此外,相比于注射有同劑量生理鹽水的對照組,注射有PAMNs 材料的小鼠腦卒中區(qū)域的邊緣在兩種成像模式下都產(chǎn)生了顯著的灰度降低,表明PAMNs 材料在病灶邊緣區(qū)域的富集,這可能來源于腦卒中病灶壞死核心對PAMNs 遞送產(chǎn)生的阻礙。由于主要血管的栓塞,材料難以通過血流遞送作用抵達病灶深層區(qū)域,從而在保留有完整形態(tài)與一定微血流供給的缺血半影區(qū)域形成了低灰度、高對比度的環(huán)形PAMNs富集層,使得“存在急救價值的”缺血半影能夠在MRI T2 與T2*序列掃描中被特異性顯影增強。這一效應(yīng)在較為嚴(yán)重的梗死灶中體現(xiàn)得更為明顯。

實驗結(jié)果顯示,在相同的成像條件下,T2 加權(quán)影像表現(xiàn)出更為清晰的病灶形態(tài),而T2* 加權(quán)影像則表現(xiàn)出相對更高的對比度,即更為顯著的缺血半影造影增強效果。兩種成像模式下,缺血半影與其周邊組織的對比效果隨時間發(fā)展、PAMNs 在病灶周邊的富集進一步增強;與此同時,PAMNs 對AIS 病灶的治療效果則引起了一部分輕微栓塞血管的再灌注,隨著材料伴隨再灌注血流的遷移,半影環(huán)形區(qū)域直徑不斷縮小并逐漸被遞送至病灶的更深層區(qū)域。在這種情況下,本實驗認(rèn)為PAMNs 對AIS 缺血半影的造影增強效果是確實有效的,且這種特異性增強行為隨著時間與病灶的發(fā)展仍能夠得到保證,即是說:

PAMNs 可基于MRI 手段實現(xiàn)對AIS 半影發(fā)展的實時監(jiān)控,有利于AIS 的臨床特異性診斷與其后治療策略的制定,并體現(xiàn)出一定的治療效果(在隨后2.3 部分表征)。

2.3 PAMNs 對AIS 的預(yù)應(yīng)急治療評價

由MRIT2 影像體現(xiàn)、以PAMNs 富集環(huán)狀區(qū)域為邊緣的急性缺血性腦卒中的病灶面積發(fā)展統(tǒng)計如圖4 所示。為最大限度減小模型個體差異所造成的誤差,此處采用病灶面積發(fā)展比例來衡量病灶的相對增長趨勢,定義為:Lesion area development=lesion area (t)/lesion area (t=t0)。

圖4 病灶面積發(fā)展統(tǒng)計

由統(tǒng)計圖可見,相對于對照組,注射有PAMNs 材料的模型鼠AIS 病灶發(fā)展無論在栓塞剛發(fā)生的0.5 h 內(nèi)還是在后續(xù)的完整治療時間窗6 h 中都表現(xiàn)出了顯著的發(fā)展抑制效應(yīng)。在病灶形成的0.5 h 內(nèi),可能由于輕微栓塞集中在外部缺血半影區(qū)域,保存有相對較大的治療余地,對照組的病灶發(fā)展十分迅猛,而PAMNs 抑制作用的集中大量特性在此期間得以體現(xiàn);在病灶形成的1-6 h 內(nèi),可能由于遞送通路、生理電活動與功能受限,PAMNs 無法發(fā)揮理想條件下的治療作用,病灶核心區(qū)域的再灌注表現(xiàn)相對受到了制約。此外,對照模型的自愈水平也是需要考慮的因素之一。

綜上所述,PAMNs 可經(jīng)由缺血半影區(qū)域的血流再灌注實現(xiàn)治療時間窗內(nèi)對AIS 病灶發(fā)展的動態(tài)性有效抑制,這進一步體現(xiàn)了PAMNs 材料在AIS 缺血半影造影輔助方面的優(yōu)勢,其應(yīng)用于MRI 的診療一體化作用也得到了保障。

3 結(jié)論

本論文通過建立光化學(xué)栓塞致急性缺血性腦卒中小鼠模型,通過PAMNs 材料應(yīng)用于該動物模型,進行MRI 診療一體化的在體表征,本實驗證實了一種血小板仿生氣體前體藥物納米遞送系統(tǒng):PAMNs 對缺血半影的造影增強效果與結(jié)合于病灶實時承療水平(血流再灌注)的AIS 發(fā)展動態(tài)抑制作用。在此基礎(chǔ)上,本結(jié)論對廣泛的缺血半影研究而言,將可能作為參考或引起更多有關(guān)納米藥物遞送系統(tǒng)、缺血半影造影增強、MRI 及其他成像技術(shù)用于缺血半影診斷等方面的思考,由此,未來有關(guān)腦卒中臨床診療策略將可能存在更多選擇。

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