范清琪， 汪 婷， 陳沛冬， 汪月娥

機體感染乙型肝炎（乙肝）病毒（HBV）后，在HBV特異性抗原刺激下，CD4+T細胞在多種細胞因子的作用下分化為輔助性T細胞（Thl、Th2、Thl7）及調(diào)節(jié)性T細胞（Treg），影響細胞因子之間的網(wǎng)絡平衡。白細胞介素21（IL-21）是一個多功能、多效應的細胞因子，在細胞免疫應答中起至關重要的作用，其主要由活化的CD4+T細胞分泌。CD4+T細胞分泌的 IL-21 還可促進CD8+T細胞的分泌，增強 HBV 感染過程中CD8+T細胞應答和殺傷功能，在清除病毒和控制慢性感染中發(fā)揮重要作用。CD4+T細胞與細胞因子（如IL-21）間的表達調(diào)節(jié)失衡與HBV感染后慢性乙型病毒性肝炎（慢乙肝）的發(fā)生、發(fā)展密切相關[1-2]。本研究檢測復旦大學附屬華山醫(yī)院乙肝病毒e抗原（HBeAg）陽性慢乙肝患者外周血單個核細胞中CD4+T淋巴細胞分泌IL-21頻數(shù)，結合患者的臨床資料、乙肝表面抗原（HBsAg）定量及IL-21等指標，輔助判斷經(jīng)核苷（酸）類似物抗病毒治療的結局。

1 材料與方法

1.1 病例來源

收集自2010年1月—2019年1月在我院肝病門診就診的患者67例，所有患者診斷均符合中國《慢性乙型肝炎防治指南（2019年版）》，并排除合并有甲型、丙型、丁型、戊型病毒性肝炎，HIV，肝硬化，肝衰竭和肝癌等的患者。收集67例使用核苷（酸）類似物進行抗病毒治療的HBeAg陽性慢乙肝患者，抗病毒治療后，其中出現(xiàn)HBeAg陰轉或血清轉換慢乙肝患者39例，而治療至少3年以上仍為HBeAg陽性者28例。

1.2 方法

1.2.1 血清HBV DNA、HBsAg定量檢測 患者血清HBV DNA定量水平采用熒光定量聚合酶鏈反應法（PCR）檢測；HBsAg的檢測采用羅氏的Cobas e601全自動電化學發(fā)光分析儀，試劑盒由羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司提供，未稀釋樣本的線性范圍是0.05～130 U/mL，進行1∶400稀釋后，樣本線性范圍是20～52 000 U/mL。

1.2.2 IL-21的檢測 采用雙抗體夾心ELISA，檢測儀器為MK3酶標儀（Multiskan MK3，Thermo-Electron Corporation，USA），試劑盒由美國R&D公司提供。血清檢測孔中先加樣本稀釋液40 μL，再加待測血清10 μL，標準品濃度為1 600 ng/L，按 800、 400、200、 100、50 ng/L 濃度對倍稀釋，共5孔，每孔加標準品50 μL，同時做空白孔。封板后混勻，室溫孵育2 h后洗滌，洗滌5次，每次1 min。除空白孔外各反應孔加入1×Avidin-HRP抗體50 μL，室溫孵育45 min，同上洗滌。每孔加入顯色底物TMB 100 μL，避光10 min，每孔加入100 μL終止液，30 min內(nèi)酶標儀在450 nm波長測定光密度D值（參考波長630 nm），通過標準品濃度和其D值擬合線性回歸曲線，根據(jù)稀釋倍數(shù)計算血清中IL-21的水平。

1.2.3 流式細胞術檢測外周血中分泌IL-21的CD4+T細胞（CD4+IL-21+T細胞）的頻數(shù) 取患者肝素抗凝全血標本250 μL，用RPMI1640懸浮細胞培養(yǎng)基1∶1等體積稀釋到500 μL。再在標本中加入能刺激CD4+T細胞分化的250X PMA/Ionomycin 2 μL和能使細胞因子不能分泌到細胞外的細胞內(nèi)蛋白分泌抑制劑250XMonensin/BFA 2 μL，混勻后，在 37℃， 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 4～6 h。取兩支流式管，標記為對照組和實驗組，分別加入100 μL培養(yǎng)好的全血及流式抗體CD45-KO/CD3-ECD/CD8-PE 各 10 μL。4℃ 避 光 孵 育30 min，加入固定破膜劑A 100 μL，室溫避光孵育15 min，加入PBS，500×g離心5 min，棄上清液收集細胞，加入固定破膜劑B 100 μL，渦旋，室溫避光孵育15 min。分別在對照組管和實驗組管中加入 IgG1-Alexa Fluor?647 和 IL-21-Alexa Fluor?647抗體各20 μL，混勻，室溫孵育30 min，加入PBS，500×g離心5 min，棄上清液收集細胞，用0.5 mL PBS重懸后在美國貝克曼Navios流式細胞儀上檢測，并繪制出細胞頻數(shù)圖。

1.2.4 統(tǒng)計分析 統(tǒng)計學分析應用Stata13.1統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計處理，兩組間的計量資料通過均數(shù)±標準差（）的方式來表示，組間比較用t檢驗。計數(shù)資料比較用卡方檢驗。采用logistic回歸分析方法分析慢乙肝患者抗病毒治療結局可能的影響因素。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 總體情況及臨床資料比較

共67例HBeAg陽性慢乙肝患者入組，其中男42例，女25例。接受核苷（酸）類似物治療后出現(xiàn)HBeAg陰轉或血清轉換慢乙肝患者39例，仍為HBeAg陽性者28例。兩組患者基線資料見表1。67例患者中接受拉米夫定6例、阿德福韋酯7例、恩替卡韋34例、替諾福韋7例、替比夫定5例、拉米夫定聯(lián)合阿德福韋酯8例。兩組患者的臨床資料經(jīng)分析可見，HBeAg陰轉或血清轉換組和HBeAg持續(xù)陽性組的年齡（P=0. 963）、基線時的ALT（P=0.071）、HBV DNA（P=0.716）以及用藥療程（P=0.589）之間的差異無統(tǒng)計學意義。

2.2 外周血IL-21、HBsAg定量以及CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)的比較

HBeAg陰轉或血清轉換組的IL-21較HBeAg持續(xù)陽性組高而HBsAg定量則較低，且差異均有統(tǒng)計學意義，P值分別為0.004、0.028。見表1。HBeAg陰轉或血清轉換組中CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)為（1.22±0.36）%，HBeAg持續(xù)陽性組中為（0.89±0.25）%，兩組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.001）。圖1為HBeAg持續(xù)陽性組患者的CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)圖，圖2為HBeAg陰轉或血清轉換組慢乙肝患者的CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)圖。

圖1 HBeAg持續(xù)陽性組患者的CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)Figure 1 Frequency of CD4+IL-21+ T cells in patients with persistent positive HBeAg

圖2 HBeAg陰轉或血清轉換組慢乙肝患者的CD4+IL-21 +T細胞頻數(shù)Figure 2 Frequency of CD4+IL-21+ T cells in chronic hepatitis B patients with HBeAg negative or serum conversion

表1 67例HBeAg陽性慢乙肝患者的臨床資料比較Table 1 Clinical characteristics of chronic hepatitis B patients in terms of HBeAg status

2.3 HBeAg陽性慢乙肝患者抗病毒治療結局的相關因素分析

采用logistic回歸分析，探討療程、基線HBV-DNA水平、ALT水平、IL-21濃度、HBsAg水平、CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)與抗病毒治療后HBeAg陰轉或血清轉換的關系。單因素分析顯示， CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)（OR=28.656，95%CI2.929～280.394，P=0.004）、HBsAg水平（OR=0.999，95%CI0.998～0.999；P=0.023）和 IL-21（OR=1.002，95%CI1.001～1.004；P=0.007）與抗病毒治療后HBeAg陰轉或血清轉換有關。見表2。多因素分析則提示CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)（OR=36.118，95%CI4.744～274.982，P=0.001）、HBsAg 水 平（OR=0.999，95%CI0.998～0.999，P=0.026）與抗病毒治療后HBeAg陰轉或血清轉換有關。見表3。

表2 HBeAg陽性慢乙肝患者經(jīng)核苷類似物治療后出現(xiàn)應答的相關變量單因素分析Table 2 Univariate analysis of the variables associated with complete response to anti-HBV nucleosides analogs therapy among HBeAg-positive chronic hepatitis B patients

表3 HBeAg陽性慢乙肝患者經(jīng)核苷類似物治療后出現(xiàn)應答的相關變量多因素分析Table 3 Multivariate analysis of the variables associated with complete response to anti-HBV nucleosides analogs therapy among HBeAg-positive chronic hepatitis B patients

3 討論

世界衛(wèi)生組織報道，全球慢性HBV感染者約有2.57億[3]。在我國，一般人群中HBsAg流行率為5%～6%，其中慢乙肝患者有2 000萬～3 000萬例[4]。慢乙肝患者中，在病毒的特異性抗原刺激下，淋巴細胞亞群功能產(chǎn)生失衡、紊亂，并造成特異性T細胞和B細胞的應答反應顯著降低、功能耗竭[5-7]。而高水平的HBeAg也會引起T細胞亞群失衡，與肝損傷及HBV并發(fā)癥的發(fā)生有關[8]。HBeAg血清學轉換對HBV介導的免疫調(diào)控起到一定的改善作用，并可能進一步阻止患者進展為終末期肝病，是目前臨床上的重要治療目標。因此，本研究的目的是確定HBeAg陽性慢乙肝患者抗病毒治療發(fā)生HBeAg陰轉或血清轉換的預測因素。

本研究結果顯示，在多因素分析中HBsAg水平（OR=0.999，95%CI0.998～0.999，P=0.023）與抗病毒治療后HBeAg陰轉或血清轉換有關，這與Shen等[9]研究結果相似。目前HBsAg的水平還用于預測慢乙肝患者停用核苷（酸）類似物治療后復發(fā)可能的研究[10]。

IL-21現(xiàn)已被廣泛應用于預測HBeAg陽性的慢乙肝患者發(fā)生HBeAg消失或者血清轉換[11]。IL-21及其下游效應細胞因子干擾素-γ（IFN-γ）能夠有效抑制HBV復制，促進HBV感染患者抗病毒治療的結局與轉歸[12]。Ma等[13]研究發(fā)現(xiàn)，IL-2l水平的升高與慢乙肝抗病毒的治療應答有關。治療12周時的IL-2l水平與HBeAg血清轉換相關，并可進一步預測治療1年后HBeAg陰轉或者血清轉換。本研究顯示，HBeAg陰轉或血清轉換組中IL-21水平雖高于HBeAg持續(xù)陽性組，P值為0.004，但在多因素分析中，兩組差異卻無統(tǒng)計學意義。雖然這種差異可能是由于目前研究的樣本量小造成，但是也有可能與IL-21的基線水平無法有效評估HBeAg陽性慢乙肝患者抗病毒的結局有關。隨著抗病毒治療療程的進展，IL-21水平的變化是否會與HBeAg的清除存在一定的相關性，我們將在后續(xù)的研究中進一步探究。

T細胞膜表面有100多種特異性抗原，1986 年，WHO將這100多種特異性抗原統(tǒng)稱為白細胞分化抗原（cluster differentiation，CD）。CD4+IL-21+T細胞是IL-21的主要來源。有研究顯示，HBeAg陽性慢乙肝患者的CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)相較于健康人群明顯升高[14]。而表達趨化因子受體5型的CD4+T細胞（CXCR5+CD4+T細胞）可誘導機體B細胞進一步產(chǎn)生HBeAb，有利于HBeAg的消失或血清學轉換，提示可能與HBeAg陽性慢乙肝患者的優(yōu)化治療相關。Cooksley等[15]研究顯示，HBeAg陽性慢乙肝患者經(jīng)過阿德福韋酯治療后，HBeAg消失或血清轉化可能與 CD4+T細胞對HBV免疫應答增強相關。本研究發(fā)現(xiàn)，HBeAg陰轉或血清轉換組CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)明顯高于HBeAg持續(xù)陽性組（P＜0.001）。多因素分析結果更提示，CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)可用于預測HBeAg陽性慢乙肝患者抗病毒治療結局。

本研究存在一定的局限性，收集的患者例數(shù)相對較少、隨訪時間短、選擇用于統(tǒng)計的可能影響因子有一定的片面性等問題，但從現(xiàn)有的研究結果來看，CD4+IL-21+T細胞頻數(shù)和HBsAg定量可用于慢乙肝患者抗病毒治療結局的預測，可在臨床實踐中進一步完善。