黃徐駿，李海波，陳友吾，葉碧歡，宋其巖，胡傳久，沈建軍，廖榮俊

（1.遂昌縣妙高林業(yè)工作中心站，浙江 遂昌 323300；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023；3.衢州市林業(yè)科技推廣站，浙江 衢州 324002）

榧樹Torreya gr andis隸屬于紅豆杉科Taxaceae 榧樹屬Torreya，雌雄異株，為第三紀(jì)孑遺植物，分布于長江流域以南地區(qū)，包括江蘇、浙江、福建、安徽、江西、湖北、湖南、云南、四川和貴州等省[1-3]。香榧T.grandis‘Merrillii’是榧樹中的優(yōu)良變異株經(jīng)人工選育后嫁接繁殖栽培的珍貴經(jīng)濟(jì)樹種，具有食用、藥用、材用、綠化等多種用途[4-5]。香榧在實(shí)生嫁接繁殖中產(chǎn)生了豐富的變異類型，歷經(jīng)多年的優(yōu)株選育和大批量繁殖試驗(yàn)，浙江省林業(yè)育種工作者選育出了多個(gè)榧樹優(yōu)良品種。2011 年，良種‘細(xì)榧’T.grandis‘Xifei’通過國家林業(yè)局林木品種審定委員會(huì)審定。近年來，浙江省審（認(rèn)）定了‘珍珠榧’‘大長榧’‘象牙榧’‘東白珠’‘脆仁榧’‘朱巖榧’‘丁山榧’‘東榧1 號(hào)’‘東榧2 號(hào)’‘東榧3 號(hào)’‘大葉種細(xì)榧’‘磐安長榧’‘玉山魚榧’‘磐大榧’‘磐安長榧’‘玉山魚榧’等眾多新品種[6-9]。此外，在野生榧樹資源中，一些植株的種實(shí)性狀變異顯著，如磐東榧、窈川大榧、大圓榧的種實(shí)為特大型，中圓榧的種實(shí)較大，大丁香的種實(shí)形狀為卵圓形，磐米榧的種實(shí)形狀為倒卵形。這些已被用作榧樹新品種選育材料，但目前尚未認(rèn)定的品系在種實(shí)性狀以及成熟期、種核榧眼數(shù)等方面均與‘細(xì)榧’有明顯差別[10]。隨著榧樹新品種的不斷選育和香榧產(chǎn)業(yè)的發(fā)展壯大，這些新品種和品系的鑒定與知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)也急需相應(yīng)的分子技術(shù)手段跟進(jìn)。

榧樹品種的鑒別一直是基于傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)上的分類，即根據(jù)盛果期榧樹果實(shí)或種子的性狀分為圓籽型（大、中、小圓榧等）和長籽型（細(xì)榧、芝麻榧、米榧、茄榧、獠牙榧、旋紋榧等）。這一鑒別方法需要在一年中的果實(shí)成熟后才能鑒定選種，無法進(jìn)行早期鑒別。自2 000 年以來，一些基于PCR 的分子標(biāo)記技術(shù)如RAPD、ISSR和SRAP 技術(shù)相繼用于香榧的品種分類、遺傳變異和居群遺傳多樣分析[3,7,11-15]。然而，這些分子標(biāo)記所采用的均為通用型引物，其PCR 擴(kuò)增圖譜不僅復(fù)雜、重復(fù)性差，且特異性不高，需經(jīng)過大量的篩選工作，因此并不適合于品種鑒別。

SSR（簡單重復(fù)序列，或稱微衛(wèi)星序列）具有多態(tài)性豐富、操作簡單、結(jié)果可靠、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，在DNA指紋圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性分析、基因定位、分子標(biāo)記輔助育種等方面得到廣泛的應(yīng)用[16]。熒光SSR 標(biāo)記的開發(fā)是基于DNA 測序平臺(tái)的毛細(xì)管電泳檢測方法，克服了傳統(tǒng)銀染法聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測的不足，具有快速、高效、精確、靈敏等技術(shù)優(yōu)勢。熒光SSR 標(biāo)記技術(shù)成功用于了油茶Camellia o leifera、柑橘Citrussp.、高粱Sorghum bicolor、月季Rosesp.、楊樹Populussp.等種和品種鑒別[17-21]。近年來，有基于榧樹轉(zhuǎn)錄組測序開發(fā)SSR 標(biāo)記的研究報(bào)道[22-23]，但尚未進(jìn)行多態(tài)性篩選，或開發(fā)的SSR 標(biāo)記進(jìn)行了多態(tài)性篩選[24]，但并未用于榧樹品種（品系）鑒別。

多重PCR（Multiplex PCR）技術(shù)是在一個(gè)PCR 體系中包含多對(duì)引物組合，在一定的濃度配比和反應(yīng)條件下，可以實(shí)現(xiàn)出多個(gè)核酸片段同時(shí)擴(kuò)增的反應(yīng)[25]。利用多重?zé)晒釹SR 標(biāo)記技術(shù)可以同時(shí)檢測出多種基因型，從而解決了在進(jìn)行大批量、多批次檢測時(shí)的費(fèi)時(shí)、費(fèi)力以及成本高的不足。迄今為止，熒光多重SSR 標(biāo)記技術(shù)僅有用于楊梅Myrica rubra果實(shí)鑒定和玉蜀黍（玉米）Zea mays自交系檢測的報(bào)道[26-27]。因此，探索利用多重?zé)晒釹SR標(biāo)記技術(shù)開發(fā)榧樹新品種或優(yōu)良、特色品種的特征SSR 指紋（基因型），揭示品種間的基因型差異，對(duì)于優(yōu)良品種的高效鑒別與新品種的知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)具有重要意義。但迄今為止，國內(nèi)外尚無利用多重?zé)晒釹SR 標(biāo)記技術(shù)鑒別榧樹品種或品系的報(bào)道。本研究以9 個(gè)榧樹品種（品系）作為實(shí)驗(yàn)材料，旨在探究利用多重?zé)晒釹SR 標(biāo)記技術(shù)高效鑒別榧樹品種或品系的可行性，以期為該鑒別技術(shù)推廣應(yīng)用到榧樹產(chǎn)業(yè)界、為榧樹新品種DUS（特異性、一致性和穩(wěn)定性）測試和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

用于本研究的9 個(gè)榧樹品種（品系）材料于2020 年11 月均采自浙江省磐安縣。9 個(gè)榧樹的品種（品系）名、倍性、形態(tài)特征及產(chǎn)地情況見表1。其中，‘玉山魚榧’‘細(xì)榧’‘磐安長榧’‘大香榧’‘獠牙榧’和‘磐大榧’為已通過審定良種，大丁香、大圓榧、中圓榧為尚未認(rèn)定的品系，其名為暫定名。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)每個(gè)榧樹品種（品系）均采集3 株，取每株2 片幼嫩葉片，混合后放置于密封袋，硅膠干燥保存，至完全干燥后提取基因組DNA。

表1 9 個(gè)榧樹品種（品系）的基本信息Table 1 Nine Cultivars (Strains) of T.grandis for testing

1.2 主要試劑與儀器

主要試劑包括植物基因組DNA 提取試劑盒（BioTeke，北京）、2×T5 Super PCR Mix（PAGE）（TSINGKE，北京）等。在SSR 正向引物上加注的熒光染料是FAM（藍(lán)）和HEX（綠），SSR 引物由北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司（TSINGKE，北京）合成。用于毛細(xì)管電泳檢測的內(nèi)標(biāo)試劑是Hi-DiTM Formamide (Applied Biosystems)、GeneScanTM-500 LIZ Size Standard（Applied Biosystems）。

主要儀器包括PCR 儀（Life ECO，Bioer，杭州）、DNA 分析儀（96-well plate,ABI 3730 XL Genetic Analyzer,Applied Biosystems,USA）、NanoDrop 2000（Thermo Scientific,USA）等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA 提取 將每個(gè)榧樹品種（品系）的6 片經(jīng)硅膠干燥后的幼嫩葉片混合粉碎，用混合樣提取基因組DNA。DNA 提取方法參照植物基因組DNA 提取試劑盒的操作說明，提取后的DNA 測定濃度，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，于－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 SSR -PCR 分析 SSR 標(biāo)記來源于前期對(duì)‘細(xì)榧’的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選。

為篩選多態(tài)性SSR 標(biāo)記的20 L SSR-PCR 擴(kuò)增體系為：2×T5 Super PCR Mix（PAGE）10 μL，F(xiàn)AM 熒光標(biāo)記的SSR 正向和反向引物（10 mol·L-1）各1.5 μL，DNA 模板（20 ng·μL-1）3 μL，加ddH2O 補(bǔ)齊到20 μL；PCR反應(yīng)條件為：98℃/2 min、98℃/10 s、退火10 s、72℃/10 s，反應(yīng)持續(xù)30 個(gè)循環(huán)；最后72℃/2 min，4℃下終止反應(yīng)。不同SSR 標(biāo)記的退火溫度從50℃至60℃進(jìn)行篩選優(yōu)化。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物先用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測條帶，對(duì)于可用的SSR 標(biāo)記再進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，分析其在9 個(gè)榧樹品種（品系）間的多態(tài)性。

為建立Tg_U7 和Tg_U734 標(biāo)記的多重PCR 擴(kuò)增體系，對(duì)4 條SSR 引物的體積配比進(jìn)行優(yōu)化，最后確定了25 μL 多重SSR-PCR 擴(kuò)增體系為：2×T5 Super PCR Mix（PAGE）12.5 μL，F(xiàn)AM 熒光標(biāo)記的正向引物Tg_U7F和反向引物Tg_U7R（10 mol·L-1）分別為0.45 μL 和0.5 μL，HEX 熒光標(biāo)記的正向引物Tg_U734F 和反向引物Tg_U734R（10 mol·L-1）分別為0.5 μL 和0.55 μL，DNA 模板（30 ng·μL-1）3 μL，加ddH2O 補(bǔ)齊到25 μL。PCR反應(yīng)條件為：98℃/2 min、98℃/10 s、57.8℃/15 s、72℃/15 s，反應(yīng)持續(xù)35 個(gè)循環(huán)；最后72℃/2 min，4℃下終止反應(yīng)。

1.3.3 毛細(xì)管電泳檢測 內(nèi)標(biāo)配制方法采用項(xiàng)目組之前對(duì)普通油茶SSR 標(biāo)記鑒別報(bào)道的方法[17,28]和多花黃精Polygonatum c yrtonema轉(zhuǎn)錄組SSR 標(biāo)記開發(fā)報(bào)道的方法[29]。具體實(shí)驗(yàn)步驟為：取10 m l H i-Di 和80 μL GeneScanTM-500 LIZ Size Standard 混勻，離心，以每孔10 μL 分裝于96 孔內(nèi)標(biāo)板，離心。將SSR-PCR 產(chǎn)物電泳，根據(jù)電泳膠圖做一定稀釋（最低可檢測標(biāo)準(zhǔn)為0.1 ng·μL-1），離心。取稀釋產(chǎn)物0.5 μL 加入到分配好的內(nèi)標(biāo)板中，混勻，離心，放入PCR 儀，于96℃變性5 min。20℃下迅速冷凍2 min，離心。置入DNA 分析儀進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測。用Data Collection 3.0 軟件收集數(shù)據(jù)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析 用GeneMapper 4.1 軟件對(duì)Data Collection 3.0 軟件收集的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。軟件系統(tǒng)將根據(jù)目標(biāo)峰的位置與同一泳道中的內(nèi)標(biāo)GeneScanTM-500 LIZ S ize Standard 進(jìn)行比較，直接給出目標(biāo)SSR 片段的準(zhǔn)確數(shù)值（bp）。純合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/X，其中X 為該等位變異的數(shù)值大??；雜合位點(diǎn)的等位變異數(shù)據(jù)記錄為X/Y，其中X、Y 為該位點(diǎn)2 個(gè)不同等位變異的數(shù)值大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 多態(tài)性SSR 標(biāo)記的篩選

基于對(duì)細(xì)榧品種轉(zhuǎn)錄組測序得到的Unigenes 序列識(shí)別SSR 位點(diǎn)。從2 536 條Unigenes 中共找到2 742 個(gè)符合條件的SSR 位點(diǎn)。對(duì)含3～5 個(gè)核苷酸重復(fù)類型的SSR 位點(diǎn)的Unigenes 序列設(shè)計(jì)SSR 引物，以篩選可用于香榧材料鑒別的多態(tài)性SSR 標(biāo)記。對(duì)40 對(duì)SSR 熒光引物合成后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示其中的15 對(duì)沒有擴(kuò)增出任何產(chǎn)物。進(jìn)一步對(duì)25 對(duì)SSR 熒光引物的重復(fù)擴(kuò)增顯示，其中的16 對(duì)引物可穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰明亮的單一SSR條帶。對(duì)這16 個(gè)SSR 標(biāo)記的毛細(xì)管電泳檢測表明Tg_U7 和Tg_U734 是具有穩(wěn)定多態(tài)性的SSR 標(biāo)記（表2）。

表2 用于榧樹品種（品系）鑒別的SSR 標(biāo)記Table 2 SSR markers used for identification of cultivars of T. grandis

對(duì)9 個(gè)榧樹品種（品系）的Tg_U7 和Tg_U734 標(biāo)記的基因型進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表3。由表3 可知，在9 個(gè)榧樹品種（品系）中，Tg_U7 可檢測出289/295、277/295 和277/289/295 三種基因型，Tg_U734 可檢測出192/222、192/216 和192/216/222 三種基因型。單一用Tg_U7 標(biāo)記，只能鑒別出‘玉山魚榧’和大丁香，其基因型分別為289/295 和277/289/295；單一用Tg_U734 標(biāo)記，只能鑒別出大丁香和‘磐大榧’，其基因型分別為192/216/222 和192/216，這表明盡管使用了多態(tài)性SSR 標(biāo)記，但其對(duì)一定范圍內(nèi)榧樹材料的鑒別能力不高，且需要進(jìn)行二次PCR 反應(yīng)。

2.2 基于多重?zé)晒釹SR 標(biāo)記鑒別榧樹材料

為提高SSR 熒光標(biāo)記對(duì)榧樹品種（品系）的鑒別效率，建立了Tg_U7 和Tg_U734 標(biāo)記的多重SSR-PCR 擴(kuò)增體系，通過對(duì)反應(yīng)體系和退火溫度的優(yōu)化，確定了在25 μL 的多重PCR反應(yīng)體系中，Tg_U7F/Tg_U7R（10 mol·L-1）的體積配比為0.45 μL/0.5 μL，Tg_U734F/Tg_U734R（10 mol·L-1）的體積配比為0.5 μL/0.55 μL；最適退火溫度為57.8℃。擴(kuò)增結(jié)果顯示，9 個(gè)榧樹品種（品系）在SSR 位點(diǎn)Tg_U7和Tg_U734 標(biāo)記分別可擴(kuò)增出4 種不同的基因型組合，根據(jù)特定的基因型組合可一次性鑒別3 個(gè)榧樹品種（品系），即‘玉山魚榧’‘磐大榧’和大丁香，其他6 個(gè)品種（品系）具有共同的基因型組合，不能鑒別到單一的品種（品系）（圖1、表3）。這表明基于多重?zé)晒釹SR 標(biāo)記技術(shù)的基因型組合差異可作為榧樹品種或品系特異性的SSR 指紋，為榧樹材料的鑒別提供了高效便捷的分子技術(shù)手段。

圖1 Tg_U7 和Tg_U734 引物組合擴(kuò)增的9 個(gè)榧樹品種（品系）的基因型Figure 1 Genotypes of 9 cultivars of T.grandis amplified with combinations of Tg_U7 and Tg_U734 primers

表3 9 個(gè)榧樹品種（品系）的基因型Table 3 Genotypes of 9 cultivars (Strains) of T.grandis

3 討論

本研究的基本技術(shù)思路是多態(tài)性SSR 標(biāo)記的獲得和利用SSR 標(biāo)記高效鑒別榧樹品種（品系）。要獲得多態(tài)性SSR 標(biāo)記，需要對(duì)前期轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的SSR 標(biāo)記進(jìn)行大量的篩選工作，要高效鑒別榧樹品種（品系），需要建立多重?zé)晒釹SR-PCR 反應(yīng)體系。利用上述技術(shù)，本研究實(shí)現(xiàn)了對(duì)3 個(gè)榧樹品種（品系）‘玉山魚榧’‘磐大榧’和大丁香的高效鑒別。這一鑒別技術(shù)的重要價(jià)值在于可以應(yīng)用到更多的榧樹品種（品系）鑒別，以及新品種（品系）的選育工作上。但在實(shí)際應(yīng)用中，大樣本量的榧樹品種（品系）僅憑有限數(shù)量的多態(tài)性SSR 標(biāo)記可能難以鑒別。因此，大量多態(tài)性SSR 標(biāo)記的獲得是這一鑒別技術(shù)的核心。為此，在后續(xù)工作中，擴(kuò)大浙江省榧樹品種（品系）的收集數(shù)量，在更大的轉(zhuǎn)錄組或基因組數(shù)據(jù)范圍內(nèi)篩選出在榧樹品種（品系）間具有高度多態(tài)性的SSR 核心標(biāo)記（SSR 核心引物），是這一鑒別技術(shù)推廣應(yīng)用到榧樹產(chǎn)業(yè)界的前提條件，也可為榧樹新品種DUS（特異性、一致性和穩(wěn)定性）測試和知識(shí)產(chǎn)權(quán)保護(hù)等方面提供技術(shù)支持。

在品種鑒別工作中，最理想的結(jié)果是獲得某個(gè)品種不同于其它品種的唯一性的DNA 指紋。事實(shí)上，僅僅一個(gè)多態(tài)性的SSR 標(biāo)記往往達(dá)不到唯一性這個(gè)要求，尤其是品種數(shù)量擴(kuò)大或出現(xiàn)新品種時(shí)。利用多態(tài)性SSR 標(biāo)記的組合可有效提高鑒別能力，正如本研究利用Tg_U7 和Tg_U734 組合標(biāo)記可一次性檢測出3 種不同的基因型組合，從而鑒別3 個(gè)榧樹品種（品系）。通過不同SSR 引物的組合提高引物的鑒別能力在棗Ziziphus j ujuba品種[30]、陸地棉（棉花）Gossypium hirsutum主栽品種[31]和多花黑麥草Lolium multiflorum品種[32]的鑒別中都成功應(yīng)用。因此，通過多個(gè)多態(tài)性SSR 標(biāo)記的組合有效提高鑒別能力，可保證本技術(shù)在實(shí)際應(yīng)用中鑒別大樣本量的榧樹品種（品系）材料。

針對(duì)多個(gè)多態(tài)性SSR 標(biāo)記的應(yīng)用，本技術(shù)引入了多重?zé)晒釶CR 技術(shù)。多重?zé)晒釶CR 技術(shù)體系的建立旨在一個(gè)PCR 反應(yīng)體系中一次性完成鑒別，不僅提高了工作效率，也減少了各種試劑和模板DNA 的用量。在多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)體系中的引物可以用不同顏色的基團(tuán)（FAM、HEX、NED、PET 等）進(jìn)行修飾，只要擴(kuò)增片段的大小不重疊，在同一毛細(xì)管電泳的泳道中可檢測多達(dá)20 對(duì)以上的擴(kuò)增片段，從而大幅度提高檢測效率[27]。因此，在獲得多個(gè)SSR 核心標(biāo)記的基礎(chǔ)上，可進(jìn)一步優(yōu)化建立多個(gè)核心標(biāo)記組合的多重?zé)晒釶CR 反應(yīng)體系，避免了多個(gè)標(biāo)記需要進(jìn)行多次PCR 實(shí)驗(yàn)，從而實(shí)現(xiàn)榧樹品種（品系）的高效鑒別。

此外，為獲得多個(gè)SSR 核心標(biāo)記，后續(xù)對(duì)轉(zhuǎn)錄組SSR 標(biāo)記的篩選工作量較大，勢必會(huì)增加熒光SSR 引物的合成成本，為此可嘗試?yán)肨P-M13（Tailed Primer-M13）自動(dòng)熒光檢測法，即將M13 序列作為通用的接頭，引入SSR 的熒光測序鑒定中，從而可以大幅度降低SSR 引物的篩選成本[33-34]。

4 結(jié)論

基于轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)篩選出了多態(tài)性SSR 標(biāo)記Tg_U7 和Tg_U734，利用多重?zé)晒釶CR 技術(shù)將SSR 標(biāo)記Tg_U7 和Tg_U734 整合，9 個(gè)榧樹品種（品系）在2 個(gè)SSR 位點(diǎn)Tg_U7 和Tg_U734 標(biāo)記可擴(kuò)增出4 種不同的基因型組合，分別為289/295 和192/222、277/295 和192/222、277/289/295 和192/216/222 以及277/295 和192/216，可一次性將3 個(gè)榧樹品種（品系）‘玉山魚榧’‘磐大榧’和大丁香鑒別出來。本研究表明基于多重?zé)晒釹SR標(biāo)記技術(shù)的基因型組合差異可作為品種（品系）特異性的SSR 指紋，為榧樹品種（品系）的鑒別提供了高效便捷的分子技術(shù)手段。