唐悅恒 趙莉 鄒欣 徐麗君 陸付耳 董慧

摘要 目的：研究交泰丸中主要活性成分小檗堿（BBR）、肉桂酸（CA）及其配伍（BBR/CA）對軟脂酸（PA）誘導的NIT-1胰島B細胞內脂質沉積的影響。方法：將細胞在PA的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，建立高脂誘導的細胞內脂肪沉積模型。分為模型組、BBR組、CA組、BBR/CA組、二甲雙胍（Met）組，分別給予相應藥物干預，另設對照組。油紅O染色法評估細胞內脂肪沉積情況;酶法檢測細胞內三酰甘油（TG）含量;使用Western Blotting和實時熒光定量PCR（RT-PCR）法檢測細胞腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及其下游脂肪生成和脂肪酸氧化基因的表達水平，包括脂肪酸合成酶（FAS）、乙酰輔酶A羧化酶（ACC）、磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC）、肉堿酰轉移酶-1（CPT-1）、固醇調節(jié)元件結合蛋白（SREBP-1c）。結果：PA誘導使NIT-1胰島B細胞中脂肪沉積明顯增加，TG含量顯著升高，AMPK蛋白及其下游靶標（如p-ACC、CPT-1等）表達顯著降低。同時，AMPK下游脂肪生成基因包括SREBP-1c mRNA、FAS和ACC蛋白表達顯著增加。BBR單藥和BBR/CA配伍處理優(yōu)于CA單藥，可顯著逆轉NIT-1胰島B細胞中上述基因表達水平的變化。結論：在體外，交泰丸活性組分配伍可減少高脂誘導的NIT-1胰島B細胞內脂肪沉積，其機制可能與減少脂肪合成和增加脂肪氧化有關。

關鍵詞 交泰丸;小檗堿;肉桂酸;NIT-1胰島B細胞;脂肪

Abstract Objective：To investigate the effects of berberine（BBR） and cinnamic acid（CA），the main active compounds of Jiaotai pills，and the combination of berberine and cinnamic acid（BBR/CA） on palmitic acid（PA）-induced lipid accumulation in NIT-1 pancreatic B cells.Methods：Cells were incubated in culture medium containing PA for 24 hours to establish a model of lipid accumulation induced by high fat.Then treatments with BBR，CA，the combination of BBR and CA（BBR/CA） and Metformin（Met） were performed respectively，and a control group was set up.Intracellular lipid accumulation was assessed by Oil Red O staining and TG content was measured by enzymatic assay.The expression of adenosine monophosphate-activated protein kinase（AMPK） protein and its downstream lipogenic and fatty acid oxidation genes，including fatty acid synthase（FAS），acetyl-CoA carboxylase（ACC），phosphorylation acetyl-CoA carboxylase（p-ACC），carnitine acyl transferase 1（CPT-1） and sterol regulatory element binding protein 1c（SREBP-1c） were determined by Western blot or real time polymerase chain reaction（RT-PCR）.Results：PA induced an obvious lipid accumulation and a significant increase in intracellular TG content in NIT-1 pancreatic B cells.PA also induced a remarkable decrease in AMPK protein expression and its downstream targets such as p-ACC and CPT-1.Meanwhile，AMPK downstream lipogenic genes，including SREBP-1c mRNA，F(xiàn)AS and ACC protein expressions，were increased significantly.Treatments with BBR and BBR/CA，superior to CA，significantly reversed the above genes changes in NIT-1 pancreatic B cells.Conclusion：It can be concluded that in vitro，the active compounds of Jiaotai pills inhibits PA-induced lipid accumulation by decreasing lipogenesis and increasing lipid oxidation in NIT-1 pancreatic B cells.

Keywords Jiaotai pills; Berberine; Cinnamic Acid; NIT-1 pancreatic B cells; Lipid

中圖分類號：R587.1文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.002

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一種由胰島素分泌缺陷和（或）胰島素功能缺陷引起的以慢性高血糖為特征的代謝性疾病[1]。根據國際糖尿病聯(lián)盟（International Diabetes Federation，IDF）報告，2019年全球約有4.63億成年人患有DM，預計到2045年這一數字將達到7億[2]。而中國是世界上DM患者數量最多的國家，發(fā)病率高達11.2%[3]。DM嚴重威脅人類健康，其并發(fā)癥同樣給家庭和社會帶來沉重負擔，相關醫(yī)療支出巨大，防控形勢嚴峻，因此，必須加強對其進行綜合管理和治療。

高脂血癥是一組以血液中脂質過多為特征的代謝性疾病，隨著肥胖癥的全球流行，其患病率也在不斷增加[4]。游離脂肪酸（Free Fatty Acid，F(xiàn)FA）在生理狀況下可以轉化成三酰甘油（Triglyceride，TG）和膽固醇酯，以脂滴的形式儲存于脂肪細胞中[5]。已有大量研究結果證實，增加的FFA水平的升高會誘導胰島素抵抗和胰腺B細胞功能障礙，并最終導致2型糖尿病（Type 2 Diabetes Mellitus，T2DM）的發(fā)生發(fā)展[6-8]。先前的研究結果還證實，可以通過減少胰島中的脂肪生成和增加脂質氧化來減少脂質沉積，從而達到減少胰島B細胞凋亡的目的[9]。因此，減少胰島B細胞中的脂肪沉積可能成為治療T2DM的新的研究方向。

交泰丸，起源于明代韓懋的《韓氏醫(yī)通》一書，由黃連和肉桂兩味藥組成。方中黃連大苦大寒，清降心火以下交腎水;肉桂辛甘大熱，溫腎陽蒸腎水上濟于心，兩藥配伍，一寒一熱，一陰一陽，相反相成，可使腎水與心火升降協(xié)調，彼此交通，是主治心腎不交之不寐證的經典方劑。本課題組經過多年臨床實踐已經發(fā)現(xiàn)其顯著的降糖效果。進一步的動物實驗表明，交泰丸可減輕DM大鼠的高血糖、高脂血癥，減少胰島脂肪沉積[10-11]，其可能作用機制包括：1）減少肝臟、骨骼肌、心肌的脂肪沉積，改善胰島素磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）通路信號轉導障礙[12];2）減少胰腺脂肪沉積，胰島細胞凋亡[13]。然而，關于交泰丸減少脂肪沉積的體外藥理學研究尚未有報道。

體外的藥理研究有條件易控、敏感性和特異性強、快捷迅速等諸多優(yōu)點[14]。因此，在對藥物進行各方面深入評價時，需要進行體外藥理實驗。為了提高配伍組方的科技含量，有人提出了有效組分配伍的新模式。小檗堿（Berberine，BBR），是一種從黃連中分離得到的生物堿，已被證實可以起到保護胰島B細胞的作用，包括調節(jié)胰島素分泌和抑制脂肪細胞凋亡，從而改善胰島素抵抗，調節(jié)血糖血脂[15-17]。然而BBR對胰島B細胞內脂質沉積的影響尚不明確。肉桂酸（Cinnamic Acid，CA），是肉桂代謝后的主要成分，其胰島素釋放特性已通過體內外實驗得到證實[18]，但尚未有關于CA對胰島B細胞脂質沉積的影響的研究。此外，BBR和CA對胰島B細胞脂質沉積的協(xié)同作用亦未被研究。本研究旨在比較BBR、CA及其配伍對軟脂酸誘導的NIT-1胰島B細胞內脂質沉積的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞 小鼠NIT-1胰島B細胞株（華中科技大學同濟醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，貨號：CL-0562）。

1.1.2 藥物 鹽酸小檗堿（Berberine，BBR，黃連素，純度>98%）（四川蘄州市市郊植物提制，批號：110406），二甲雙胍（深圳市中聯(lián)制藥有限公司，批號：1103078）。

1.1.3 試劑與儀器 肉桂酸（Cinnamic Acid，CA，Sigma公司，美國，貨號：MK887111），軟脂酸（Palmitic Acid，PA，Sigma公司，美國，貨號：087K1877）和牛血清清蛋白（BSA，Sigma公司，美國，貨號：041M18021V），南非胎牛血清（FBS）（Thermo公司，美國，貨號：10091155）、DMEM高糖培養(yǎng)基（Thermo公司，美國，貨號：11965092）、RMPI 1640培養(yǎng)基（Thermo公司，美國，貨號：11875101），胰蛋白酶（武漢谷歌生物科技有限公司，貨號：G4001），青鏈霉素（武漢谷歌生物科技有限公司，貨號：G4003），MTT試劑盒（武漢谷歌生物科技有限公司，貨號：G4101），三酰甘油檢測試劑盒（長春匯力生物技術有限公司，貨號：K068a），BCA法蛋白測定試劑盒（碧云天生物技術研究所，貨號：P0012），肉堿脂酰轉移酶-1（CPT-1）抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab234111），腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab32047），乙酰輔酶A羧化酶抗體（ACC，Abcam公司，英國，貨號：ab45174），磷酸化乙酰輔酶A羧化酶（p-ACC）抗體（Abcam公司，英國，貨號：ab68191），脂肪酸合成酶（FAS）抗體（GeneTex公司，美國，貨號：GT1169），TRIzol試劑（TaKaRa公司，日本，貨號：740955.50），PrimeScript RT試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號：RR014B），SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司，日本，貨號：639676）。CO2培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司，型號：BPN-80CRH），電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司，型號：DKB-600B），恒溫水平搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：Orbital Shaker TS-1），生化分析儀（Roche公司，瑞士，型號：iMagic-M7），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（Odyssey公司，美國，型號：LI-COR Odyssey），光學顯微鏡（Nikon公司，日本，型號：E100），核酸/蛋白分析儀（Thermo公司，美國，型號：NanoDrop ONEC），Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System（Applied Biosystems公司，美國，型號：4376599）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

取90 mL 1640培養(yǎng)基、10 mL FBS和1 mL青鏈霉素，充分混勻得到1640完全培養(yǎng)基。將一定量的小鼠NIT-1胰島B細胞接種于25 mL的培養(yǎng)瓶內，用配制好的完全培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d換液1次，當細胞生長至80%～90%時，進行傳代或凍存。

棄掉NIT-1胰島B細胞中原有的培養(yǎng)基，加入含0.5% BSA，0.25 mmol/L PA培養(yǎng)基，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，建立高脂誘導的NIT-1胰島B細胞內脂肪沉積模型后將細胞分為對照組、模型組、小檗堿組、肉桂酸組、交泰丸組分配伍組（BBR/CA）和二甲雙胍組。

1.2.2 干預方法

將處于對數生長期的NIT-1胰島B細胞以1×105個/mL接種到96孔板中，待細胞融合按不同濃度梯度加入藥物：1）PA：0.10、0.25、0.40、0.50 μmol/L;2）BBR：5、10、15、20、30、50、100 μmol/L;3）CA：50、100、200、300、500 μmol/L;4）Met：10、15、20、25、30、35、40 μmol/L。每組設置6個復孔，正常組和空白對照組分別加入等量未加藥的細胞懸液和PBS，孵育24 h。向每孔加入MTT工作液50 μL，孵育4 h后棄掉液體，加入100 μL的DMSO，搖床振蕩10 min后，用酶標儀測定490 nm波長各孔的吸光度。選擇合適的藥物干預濃度干預對應組別細胞，進行后續(xù)實驗。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 細胞內TG測定

將細胞按1×105個/mL種入6孔板，按對照組、模型組、小檗堿組、肉桂酸組、交泰丸組分配伍組（BBR/CA）和二甲雙胍組的分組進行造模加藥。孵育24 h后裂解各組細胞，以酶法檢測細胞內TG含量。

1.2.3.2 油紅O染色

如前所述對細胞進行分組造模加藥。孵育24 h后用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗2遍，固定于10%甲醛中，加入油紅染液染色1 h，使用光學顯微鏡觀察并拍攝脂滴。

1.2.3.3 Western Blotting法檢測

棄去含藥培養(yǎng)基，用PBS洗滌2次后將細胞裂解提取蛋白，使用BCA法蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度，用Buffer給蛋白統(tǒng)一濃度。

配制10% SDS-PAGE凝膠，按40 μg的蛋白含量完成上樣，電泳完成后使用NC膜進行轉膜。轉膜后使用含5%脫脂奶粉或5% BSA的封閉液封閉1 h。在4 ℃下與一抗（AMPK、ACC、p-ACC、FAS、CPT-1）孵育過夜。TBST洗滌3次后，將膜與熒光標記的二抗在室溫下避光孵育1 h。最后將膜在TBST中洗滌3次后使用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)進行掃描，用ImageJ軟件分析條帶灰度，以目的基因條帶與內參基因β-actin的比值來表示蛋白的表達水平。

1.2.3.4 RT-PCR檢測

采用TRIzol和氯仿提取細胞總RNA，使用核酸/蛋白分析儀檢測所提取RNA的濃度和純度。根據PrimeScript RT試劑盒說明將RNA逆轉錄為cDNA。使用Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System，根據SYBR Premix Ex Taq試劑盒的說明依次加入cDNA、引物混合液和熒光試劑后設置RT-PCR程序：預變性95 ℃ 30 s，PCR 95 ℃、5 s，60 ℃、30 s。每個樣本設置3個復孔，擴增結束后以2-△△Ct法計算mRNA的表達水平。

引物序列如下：β-actin：前引物：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′;后引物：5′-ATGGAGCCACCGATCCACA-3′;SREBP-1c：前引物：5′-CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC-3′;后引物：5′-GAAGTCACTGTCTTGGTTGTTGATG-3′。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用單因素方差分析對各組數據進行比較，如果方差齊性用LSD-t檢驗，如果方差不齊性用Dunnett′s T3檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。使用GraphPad軟件完成制圖。

2 結果

2.1 各組藥物及軟脂酸對NIT-1胰島B細胞生長抑制的影響

如前所述，用不同濃度PA、BBR、CA和Met干預NIT-1胰島B細胞，孵育24 h后比較相鄰2濃度細胞存活率間差值的差異（△D），將差異最大的濃度作為藥物干預的合適濃度，最終選擇0.25 mmol/L的PA、10 μmol/L的BBR、100 μmol/L的CA和35 μmol/L的Met供后續(xù)實驗使用。

2.2 BBR、CA及其配伍對NIT-1胰島B細胞內TG含量的影響

與對照組比較，PA誘導的模型組NIT-1胰島B細胞內TG含量顯著增加（P<0.01）;與模型組比較，小檗堿組、交泰丸組分配伍組和二甲雙胍組細胞內TG含量均顯著降低，而肉桂酸組細胞內TG含量差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）;單獨給予BBR處理后細胞內TG含量與交泰丸組分配伍組比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），而肉桂酸組細胞內TG含量與交泰丸組分配伍組比較顯著升高（P<0.05）。見圖1A。

油紅O染色的結果顯示，與對照組比較，模型組細胞內脂滴數量明顯增多;與模型組比較，小檗堿組和交泰丸組分配伍組細胞內的脂滴數量均顯著減少，Met處理后脂滴數量同樣減少，而單獨給予CA處理后細胞內脂滴數量雖有所減少，但效果不如其他組明顯。見圖1B。

2.3 BBR、CA及其配伍對NIT-1胰島B細胞AMPK及其下游脂肪生成基因表達的影響

與對照組比較，PA作用24 h后NIT-1胰島B細胞內FAS和ACC蛋白表達顯著增加而AMPK和p-ACC蛋白表達水平明顯下降（P<0.01）。與模型組比較，小檗堿組、肉桂酸組、交泰丸組分配伍組和二甲雙胍組細胞內FAS和ACC蛋白表達明顯降低（P<0.01），AMPK和p-ACC蛋白表達水平顯著升高（P<0.01）。與交泰丸組分配伍組比較，小檗堿組細胞AMPK蛋白表達顯著升高（P<0.05），而小檗堿組和肉桂酸組細胞FAS蛋白表達均明顯降低（P<0.05）。見圖2。

2.4 BBR、CA及其配伍對NIT-1胰島B細胞AMPK下游脂肪酸氧化基因表達的影響

經PA誘導后，NIT-1胰島B細胞中CPT-1蛋白表達顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，小檗堿組、肉桂酸組、交泰丸組分配伍組和二甲雙胍組細胞CPT-1蛋白表達均顯著增加（P<0.01）。與交泰丸組分配伍組比較，單獨給予BBR處理后細胞CPT-1蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），單獨給予CA處理后細胞內CPT-1蛋白表達顯著降低（P<0.05），這或許證明CA可以增強NIT-1胰島B細胞中的脂肪酸氧化。見圖3。

2.5 各組NIT-1胰島B細胞SREBP-1c mRNA表達的比較

與對照組比較，PA作用24 h后NIT-1胰島B細胞SREBP-1c mRNA表達顯著增加（P<0.01）。給予BBR、CA或BBR聯(lián)合CA處理后NIT-1胰島B細胞SREBP-1c mRNA表達顯著降低（P<0.05，P<0.01），而Met處理后細胞內SREBP-1c mRNA的表達差異無統(tǒng)計學意義。與BBR/CA組比較，肉桂酸組細胞SREBP-1c mRNA表達顯著增加（P<0.01），小檗堿組差異無統(tǒng)計學意義。

3 討論

DM的發(fā)病率正在逐年上升，對人類健康的影響巨大，其帶來的醫(yī)療保健費用也日益增長，給患者本身及其家庭以及社會帶來沉重的負擔。DM在中醫(yī)學中屬于消渴病范疇，正如《素問病機氣宜保命集·卷下·消渴論》所記載的“上熱故煩渴多飲，下寒故小便多出。本因下部腎水虛，而不能制其上焦心火，故上實熱而下虛冷”，腎陽虛于下，心火亢于上，是消渴的重要病機[20]。由黃連和肉桂兩味藥所組成的交泰丸，一直以來是治療心煩不寐、心悸不安、頭暈耳鳴、腰酸遺精、五心煩熱等心腎不交癥狀的經典方劑，其溫腎清心、交通心腎的功效正切中消渴腎陽虛心火亢的基本病機。本課題組將交泰丸臨床應用于T2DM患者的治療發(fā)現(xiàn)，給予交泰丸治療后，患者的睡眠質量得到明顯改善，血糖也有不同程度的下降，血脂紊亂得到糾正。而許多動物實驗結果同樣表明，交泰丸及其單味藥黃連、肉桂可有效治療T2DM大鼠[10-11，21]，其降糖調脂的作用機制可能與降低肝臟、胰腺、骨骼肌和心肌TG含量，減少胰島細胞凋亡有關[22-23]。

異位脂質堆積是指非脂肪組織中出現(xiàn)脂肪沉積，肝臟中的異位脂質堆積與肥胖、胰島素抵抗和T2DM密切相關[24]。骨骼肌中過量的脂質堆積同樣被認為與胰島素抵抗的發(fā)生發(fā)展有關[24-25]。高脂飲食會引起循環(huán)中FFA水平升高，而長時間的FFA水平升高會引起B(yǎng)細胞內脂質沉積，最終導致B細胞損傷及功能下降。FFA能酯化為TG儲存于體內各器官中：一方面，TG分解代謝時產生大量的脂酰輔酶A（CoA），其中一部分進行β氧化產能，更多的脂酰CoA進入非氧化的代謝途徑，代謝產物可對B細胞產生脂毒性，誘導B細胞凋亡;另一方面，軟脂酸CoA可與絲氨酸在絲氨酸神經酰胺轉移酶的催化下，合成神經酰胺，后者激活核因子κB（NF-κB），進而使誘導型一氧化氮合酶（iNO）表達增加，NO合成增多，NO源性氧自由基過多，造成B細胞DNA的損傷，B細胞凋亡[26-27]。因此，可以通過減少細胞內脂肪沉積來減輕B細胞損傷，從而達到改善脂毒性和預防T2DM發(fā)展的目的。由于交泰丸可能具有減少胰島細胞凋亡的作用，但中藥成分復雜，因此我們選擇黃連、肉桂各自的有效活性成分小檗堿和肉桂酸為研究對象，通過體外藥理學實驗進一步探索交泰丸活性成分對NIT-1胰島B細胞內脂肪沉積的影響。

本研究中，我們采用軟脂酸作用24 h誘導NIT-1胰島B細胞內脂肪沉積。結果顯示細胞內TG含量升高，油紅O染色也觀察到細胞內脂滴明顯增多，提示模型建立成功。給予BBR以及BBR/CA干預后，細胞內TG含量下降，脂滴明顯減少，而CA干預使細胞內脂滴有一定程度的減少，細胞內TG含量下降，但與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義，以上結果提示BBR減少細胞內脂肪沉積作用優(yōu)于CA。此外，交泰丸組分配伍組，即BBR/CA組降低細胞內TG含量作用并不優(yōu)于BBR單藥，這可能與二者配伍后有效濃度下降有關。全世建等[28]采用高效液相色譜法測定黃連和肉桂不同比例配伍后的5種有效成分小檗堿、藥根堿、巴馬亭、桂皮醛和肉桂酸的質量百分含量變化趨勢，結果表明，黃連含量固定時，隨著肉桂配伍含量增加，黃連中的生物堿含量比例下降;而隨著肉桂含量增加，桂皮醛和肉桂酸含量未呈比例上升。本課題組前期研究同樣證實，肉桂比例升高會降低黃連中小檗堿的溶出量;黃連比例越高，肉桂中肉桂醛、肉桂酸含量越低，這可能是由于黃連和肉桂配伍后，在煎煮過程中黃連中的生物堿與肉桂中的酚酸類成分產生沉淀所導致的[29-30]。

AMPK是脂肪組織中一個主要的能量感應器和調節(jié)器。AMPK的抑制與肥胖和DM等脂肪沉積障礙的發(fā)展有關，相反，AMPK的激活可以抑制脂肪生成并刺激脂肪酸氧化，導致細胞內脂質含量減少[31-32]。脂肪的累積取決于脂肪合成加再酯化和脂肪分解兩方面，F(xiàn)AS和ACC是調控該過程的2個關鍵酶。An等[33]的研究顯示，AMPK在脂肪酸代謝過程中有著重要作用，在一定程度上可以調控ACC的活性。此外，長鏈脂肪酸（Long Chain Fatty Acid，LCFA）氧化的調控在代謝性疾病的研究中引起了越來越多的關注，通過CPT-1在線粒體外膜運輸是LCFA氧化的限速步驟，研究結果證實CPT-1是LCFA的氧化過程中必不可少的部分[34]。此外，肝脂質穩(wěn)態(tài)是由一些核受體和轉錄因子密切調控的。SREBP-1c是刺激一些與脂肪合成相關的基因表達的轉錄調節(jié)因子，它可以連接脂肪合成基因包括固醇調節(jié)元件的啟動區(qū)，如ACC和FAS，并且能夠上調這些基因的表達[35-36]。Zhu等[37]的研究結果證實，SREBP-1c基因的表達水平與肝細胞內TG含量存在密切聯(lián)系。

黃連及其有效成分BBR對DM的治療效果已被證實有效，且BBR在治療有血脂異常的T2DM患者時能兼顧有效性和安全性[38]。Shen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，BBR可以減少胰島B細胞內脂肪沉積，其可能機制是激活NIT-1細胞AMPK，同時引起其下游分子ACC磷酸化和FAS表達下降。本研究結果同樣表明，BBR能激活NIT-1細胞AMPK蛋白的表達，降低脂肪生成基因ACC、FAS和SREBP-1c的表達，上調ACC的磷酸化水平，提示BBR可抑制細胞內脂肪合成。這一發(fā)現(xiàn)與Brusq等[39]的研究結果一致，后者表明BBR通過AMPK激活抑制HepG2細胞中的脂質合成。此外，BBR干預后，AMPK下游脂肪酸氧化基因CPT-1表達上調，提示BBR可增加細胞內脂肪氧化。這可能是BBR減少NIT-1胰島B細胞內TG含量的原因之一。雖然本研究中沒有檢測p-AMPK蛋白的表達水平，但AMPK下游脂肪生成基因表達的減少和脂肪酸氧化基因的增強在一定程度上同樣可以反映B細胞中的AMPK活化。

CA是肉桂在機體代謝后的主要效應成分。Qin等[40]發(fā)現(xiàn)肉桂提取物對SREBP-1c mRNA表達的抑制效果可能涉及小腸上皮細胞的胰島素通路。本研究發(fā)現(xiàn)，CA與BBR一樣能激活NIT-1胰島B細胞AMPK的蛋白表達，降低脂肪生成基因ACC、FAS和SREBP-1c的表達，上調ACC的磷酸化水平，提示CA可抑制細胞內脂肪合成;CA干預可上調NIT-1胰島B細胞CPT-1蛋白表達，提示CA可增加細胞內脂肪氧化。然而，CA減少細胞內脂質沉積的作用明顯弱于BBR，且在增加AMPK蛋白表達和降低FAS蛋白表達方面，BBR單藥似乎比交泰丸組方配伍更有效。似乎CA單藥不能極大地抑制NIT-1胰島B細胞中的脂肪生成過程。這些發(fā)現(xiàn)可能是給予CA干預后NIT-1胰島B細胞內TG含量的降低與模型組比較差異無統(tǒng)計學意義的原因之一。此外，本研究并未觀察到BBR和CA對PA誘導的細胞內脂肪沉積和細胞凋亡的協(xié)同作用;相反，BBR的作用很可能會因培養(yǎng)基中CA的存在而減弱，這需要后續(xù)實驗進一步研究。

綜上所述，我們的體外研究表明，在低濃度軟脂酸存在下，交泰丸活性組分配伍和小檗堿單藥可有效抑制NIT-1胰島B細胞內脂肪沉積，其機制與增加AMPK的活性、減少脂肪合成以及增加脂肪酸氧化有關，這種抑制作用可以保護B細胞免受軟脂酸誘導的脂毒性的損傷。而交泰丸活性組分配伍組并不明顯優(yōu)于小檗堿、肉桂酸單藥組，其可能原因尚需進一步探討。

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（2021-08-10收稿 責任編輯：王明）