夏青松 周儷珊 吳凡 鞏靜 鄒欣 徐麗君 董慧 陸付耳

摘要 目的：探討胡蘆巴丸及其單味藥抗氧化應(yīng)激治療大鼠糖尿病腎?。―KD）的分子機(jī)制。方法：采用高糖高脂飲食和尾靜脈小劑量鏈脲佐菌素（STZ）的方法建立大鼠糖尿病腎病模型，將大鼠隨機(jī)分為模型組、胡蘆巴組、補(bǔ)骨脂組、胡蘆巴丸組、卡托普利組，另設(shè)正常對(duì)照組，給予相應(yīng)藥物灌胃治療16周后，檢測(cè)血糖、血脂、血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、尿24 h總蛋白（UTP）、尿24 h尿白蛋白（UALB），光鏡下觀察腎臟形態(tài)學(xué)改變（HE染色、PAS染色、Masson染色）、電鏡下觀察腎臟超微結(jié)構(gòu)改變，DHE染色評(píng)估腎臟組織超氧陰離子水平，濃度比色法檢測(cè)腎組織煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）活性，Western Blotting檢測(cè)腎臟組織磷酸化蛋白激酶C-α（PKC-α、NADPH氧化酶p47phox亞基、纖黏蛋白（Fibronectin）的表達(dá)水平，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè)腎臟組織p47phox、PKC-α的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組大鼠血糖升高、血脂紊亂，24 h尿總蛋白及白蛋白水平均明顯升高（P<0.001），腎小球體積增大、腎小球纖維化、細(xì)胞外基質(zhì)增生、足細(xì)胞足突融合;與模型組比較，胡蘆巴、補(bǔ)骨脂、胡蘆巴丸組大鼠血糖水平下降，血脂紊亂改善，24 h尿總蛋白及白蛋白水平均明顯下降（P<0.01），上述腎臟病理學(xué)改變明顯減輕。與正常組比較，模型組大鼠腎組織DHE染色熒光強(qiáng)度明顯升高，腎組織NADPH氧化酶活性、磷酸化PKC-α、p47phox、Fibronectin蛋白均明顯升高（P<0.001）;與模型組比較，胡蘆巴、補(bǔ)骨脂、胡蘆巴丸組大鼠腎組織DHE染色熒光強(qiáng)度明顯降低，腎組織NADPH氧化酶活性、磷酸化PKC-α、p47phox、Fibronectin蛋白均明顯降低（P<0.01），p47phox、PKC-α的mRNA表達(dá)水平降低（P<0.01）。與單味藥比較，胡蘆巴丸復(fù)方組在抗氧化應(yīng)激，改善腎小球纖維化，降低血脂血糖優(yōu)于胡蘆巴組和補(bǔ)骨脂組。結(jié)論：胡蘆巴丸通過(guò)抑制PKC-α/NADPH通路抗氧化應(yīng)激以治療糖尿病腎病。

關(guān)鍵詞 胡蘆巴丸;糖尿病腎病;氧化應(yīng)激;磷酸化蛋白激酶-α;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶

Abstract Objective：To investigate the molecular mechanism of hu-lu-ba-wan and its single components in the anti-oxidative stress treatment of the diabetic kidney disease（DKD） in rats.Methods：A high-sugar and high-fat diet with intravenous injection of small dose of streptozotocin（STZ） was used to establish the diabetic kidney disease（DKD） model in rat.The rats were randomly divided into model group，TFG group，PC group，and Hu-lu-ba-wan group，captopril group，and a normal control group was set to compare.After 16 weeks of intragastric treatment with corresponding drugs，blood glucose，blood lipids，blood urea nitrogen（BUN），blood creatinine（SCr），and 24-hour urine total protein（UTP），24-hour urine albumin（UALB） were examined.HE staining，PAS staining，Masson staining were used to observe renal morphological changes and electron microscope was applied to observe kidney ultrastructural changes.The assess of the level of superoxide anion in kidney tissue was conducted by DHE staining and the activity of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate（NADPH） in kidney tissue was detected using the concentration colorimetric method.Western Blotting was used to detect the expression level of phosphorylated PKC-α，NADPH oxidase p47phox subunit，F(xiàn)ibronectin protein in kidney tissue，and the mRNA expression levels of p47phox and PKC-α in kidney tissues were detected by real-time fluorescent quantitative PCR（RT-PCR）.Results：Compared with the normal group，the rats in the model group had elevated blood sugar and dyslipidemia，and the 24 h urine total protein and albumin levels were significantly increased（P<0.001），and showed increased glomerular volume，glomerular fibrosis，and extracellular matrix proliferation and podocyte foot process fusion.Compared with the model group，the blood glucose levels decreased，dyslipidemia were improved，and 24-hour urine total protein and albumin levels significantly decreased in rats of the TFG group，PC group，and hu-lu-ba-wan group were significantly lower than the model group（P<0.01）.Besides，the above-mentioned renal pathological changes were obviously reduced.Compared with normal group，the fluorescence intensity of DHE staining in the kidney tissue of the model group was significantly increased，and the NADPH oxidase activity，phosphorylated PKC-α，p47phox，and Fibronectin protein in the kidney tissue were distinctly enhanced in the model group（P<0.001）.In comparison of model group，the fluorescence intensity of DHE staining in the kidney tissue of rats was significantly reduced and the NADPH oxidase activity，phosphorylated PKC-α，p47phox，and Fibronectin protein in the kidney tissue were significantly reduced（P<0.01），and mRNA expression levels of p47phox and PKC-α were reduced in the TFG group，PC group，and hu-lu-ba-wan group（P<0.01）.Compared with the single components，the hu-lu-ba-wan group was better than the TFG group and the PC group in anti-oxidative stress，improving glomerular fibrosis，and lowering blood lipids and blood glucose.Conclusion：Hu-lu-ba-wan improves diabetic kidney disease by inhibiting the oxidative stress of PKC-α/NADPH pathway.

Keywords Hu-lu-ba-wan; Diabetic kidney disease; Oxidative stress; PKC-α; NADPH oxidase

中圖分類號(hào)：R587.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.19.005

糖尿?。―iabetes Mellitus，DM）作為21世紀(jì)全球嚴(yán)重的公共健康問(wèn)題，在中國(guó)糖尿病患者超過(guò)1.1億，占全球糖尿病患者24%，患病率高達(dá)11.2%[1]。在DM起病的20～25年內(nèi)，25%～40%的患者將發(fā)展為糖尿病腎臟?。―iabetic Kidney Disease，DKD）。DKD作為DM最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，患病率呈逐年上升的趨勢(shì)[2]。據(jù)流行病學(xué)調(diào)查資料顯示，我國(guó)社區(qū)及三甲醫(yī)院住院的人群中，DM已經(jīng)超過(guò)腎小球腎炎，成為慢性腎臟病發(fā)病的主因，而且DM患者尿微量白蛋白升高等早期DKD表現(xiàn)一旦出現(xiàn)，進(jìn)展為終末期腎病速度約為其他腎病的18倍，死亡風(fēng)險(xiǎn)增加4倍[2-3]。DKD早期癥狀隱匿，發(fā)病晚且難以逆轉(zhuǎn)，目前缺乏有效的治療方法。有資料證實(shí)高血糖及其所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激是DKD的發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵因素[4-7]。因此，尋求具有抗氧化和降血糖雙重作用的藥物是治療糖尿病腎病的關(guān)鍵。

中醫(yī)認(rèn)為糖尿病腎病屬于“消渴病-腎虛證”，中草藥及其有效單體在治療2型糖尿病中發(fā)揮不容小覷的優(yōu)勢(shì)，廣泛用于臨床以降低血糖，改善臨床癥狀，提高生命質(zhì)量[8-9]。胡蘆巴丸是由胡蘆巴和補(bǔ)骨脂構(gòu)成的治療腎虛的方劑，而胡蘆巴及補(bǔ)骨脂中有效成分具有降糖調(diào)脂，抗炎抗腫瘤，抗氧化應(yīng)激等多重功效[10-13];在保護(hù)腎功能方面，胡蘆巴中有效成分可降低谷氨酸脫氫酶和D-羥基丁酸脫氫酶的活性以阻止早期DKD腎臟結(jié)構(gòu)異常[14]，補(bǔ)骨脂中有效成分抑制酪氨酸蛋白磷酸酶1B的活性以調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，減輕DKD的早期進(jìn)展[15]。然而美中不足的是，上述研究局限于胡蘆巴和補(bǔ)骨脂的單味藥及其有效單體，而針對(duì)中藥復(fù)方胡蘆巴丸治療DKD未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究擬從抗氧化應(yīng)激環(huán)節(jié)切入，探討胡蘆巴丸治療糖尿病、保護(hù)腎功能的潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 選取SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自湖北省疾病預(yù)防控制中心（動(dòng)物許可證編號(hào)：00018082），動(dòng)物飼養(yǎng)于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)。飼養(yǎng)條件：溫度為22 ℃左右，濕度為40%～60%，自然晝夜節(jié)律，12 h/12 h光照明暗交替，自由攝食飲水。食物為高糖高脂飼料，配方如下：基礎(chǔ)飼料67.5%，豬油15%，糖15%，膽固醇2%，膽鹽0.5%。

1.1.2 藥物 胡蘆巴和補(bǔ)骨脂飲片購(gòu)自湖北省中藥材公司（中國(guó)武漢）并由湖北中醫(yī)藥大學(xué)生藥教研室（中國(guó)武漢）鑒定。根據(jù)古方記載，二者按照質(zhì)量1∶1制備，大鼠用藥劑量按照（中華人民共和國(guó)藥典，2020版）體表面積與人用藥劑量來(lái)計(jì)算，最終，1 g胡蘆巴丸（分別含有0.5 g胡蘆巴和0.5 g補(bǔ)骨脂）、1 g胡蘆巴、1 g補(bǔ)骨脂分別獲得1.32 mL、0.63 mL、0.66 mL中藥藥液。胡蘆巴丸藥液制備流程如下：將干燥的種子打成粉末，浸泡過(guò)夜后煎煮1.5 h，將煎煮液冷卻至室溫后，用95%乙醇按1∶1體積室溫過(guò)夜醇提，用濾器收集沉淀物，將醇提液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀采用蒸餾法去除乙醇，并溶回沉淀物進(jìn)一步濃縮。胡蘆巴和補(bǔ)骨脂單味藥藥液制備方法同上。

1.1.3 試劑與儀器 總膽固醇（TC）（南京建成科技有限公司，貨號(hào)：A111-1-1），三酰甘油（TG）（南京建成科技有限公司，貨號(hào)：A110-1-1），低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）（南京建成科技有限公司，貨號(hào)：A113-1-1），高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）（南京建成科技有限公司，貨號(hào)：A112-1-1）生化試劑盒檢測(cè)，血尿素氮和血肌酐試劑盒（南京建成科技有限公司，貨號(hào)：C013-2-1、C011-2-1），NADPH活性定量檢測(cè)試劑盒（上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司，貨號(hào)：GMS50353.4），DHE粉末（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：S0063），DMSO（Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：D8418），p47phox（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab181090），p-PKC-α（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab109539），PKC-α（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab11723），F(xiàn)ibronectin（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab2413），β-actin（Abcam公司，英國(guó)，貨號(hào)：ab8226），山羊抗兔Dylight-800（KPL公司，貨號(hào)：ab201806），Trizol（TaKaRa公司，貨號(hào)：740955.50），PrimeScript RT試劑盒（TaKaRa公司，貨號(hào)：RR014B），SYBR Premix Ex Taq試劑盒（TaKaRa公司，貨號(hào)：639676），95%乙醇（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：E111991）。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（BUCHI公司，瑞士，型號(hào)：R1020），生化分析儀（Roche公司，瑞士，型號(hào)：iMagic-M7），光學(xué)顯微鏡（Nikon公司，日本，型號(hào)：E100），血糖儀（Roche公司，瑞士，型號(hào)：羅氏精采型），Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（Odyssey公司，美國(guó)，型號(hào)：LI-COR Odyssey），核酸/蛋白分析儀（Thermo公司，美國(guó)，型號(hào)：NanoDrop ONEC），Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System（Applied Biosystems公司，美國(guó)，型號(hào)：4376599）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)選擇8只大鼠作為正常對(duì)照組（Normal組），給予普通飼料。剩下的大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食12 h，尾靜脈注射鏈脲佐菌素（STZ）（30 mg/kg），1周后采用口服葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）挑選出成模的大鼠，將成模大鼠隨機(jī)分為模型組（Diabetic組）、胡蘆巴組（TFG組）、補(bǔ)骨脂組（PC組）、胡蘆巴丸組（HLBW組）及卡托普利組（Captopril組）（陽(yáng)性藥物對(duì)照），每組8只。

1.2.2 給藥方法 藥物組灌胃16周，灌胃劑量如下：胡蘆巴組9 g/（kg·d），補(bǔ)骨脂組9 g/（kg·d），胡蘆巴丸組18 g/（kg·d），卡托普利組10 g/（kg·d）。實(shí)驗(yàn)樣品制備：所有實(shí)驗(yàn)大鼠在灌胃16周后，行OGTT實(shí)驗(yàn)，留取24 h尿液標(biāo)本后處死。1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔注射麻醉后，腹主動(dòng)脈取血10～12 mL，3 000 r/min，離心半徑10 cm，離心15 min，分離血清，于-80 ℃冰箱保存。取雙側(cè)腎組織，用磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗后，右腎裝入EP管中，-80 ℃保存，用于后續(xù)Western Blotting和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-PCR）檢測(cè);部分左腎用4%多聚甲醛固定，用于石蠟包埋;部分左腎用電鏡液固定，用于透射電子顯微鏡觀察腎小球的超微結(jié)構(gòu);部分左腎用于制作冰凍切片。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 OGTT實(shí)驗(yàn) 大鼠于OGTT實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，剪尾取第二滴血測(cè)空腹血糖，后給予50%葡萄糖2 g/kg灌胃，于灌胃后1 h和2 h再次剪尾取血測(cè)血糖值。成模條件：2個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖值高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血糖正常范圍（正常大鼠血糖值95%置信區(qū)間為正常范圍）上限，或一個(gè)時(shí)間點(diǎn)血糖值高于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)血糖正常范圍上限20%，則認(rèn)為造模成功。

1.2.3.2 生化指標(biāo)檢測(cè) 血糖使用血糖儀檢測(cè)，采用葡萄糖氧化酶法測(cè)定?？偰懝檀迹═C）、三酰甘油（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C），用生化試劑盒檢測(cè)，方法參照說(shuō)明書(shū)。血尿素氮和血肌酐采用比色法化學(xué)試劑盒進(jìn)行，方法參照說(shuō)明書(shū)。尿總蛋白和尿白蛋白用生化分析儀，采用免疫濁度法測(cè)定。

1.2.3.3 腎臟組織學(xué)形態(tài)檢測(cè) 腎臟組織學(xué)形態(tài)檢測(cè)包括：蘇木精-伊紅（HE）染色、過(guò)碘酸雪夫（PAS）染色、馬松（Masson）染色，采用光學(xué)顯微鏡拍攝。HE染色用于觀察腎小球形態(tài)，PAS染色用于觀察腎小球基底膜厚度及系膜增生情況，Masson染色用于觀察腎小球纖維化情況。

1.2.3.4 超氧離子水平及煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶活性檢測(cè) 使用二氫乙啶（DHE）染色，DHE是一種活性氧熒光探針，可進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)被活性氧所氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶摻入染色體DNA中，產(chǎn)生紅色熒光，采用DHE染色檢測(cè)個(gè)組大鼠腎組織超氧陰離子水平[16-17]。將5 mg DHE粉末溶解于317 μL DMSO以配置成50 mmol/L母液，將2 μL母液溶解于998 μL PBS中，稀釋成500 μmol/L的工作液。每組取3張冰凍切片，平衡至室溫，用免疫組化筆圈出組織區(qū)域，每個(gè)圈加入100 μL DHE工作液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育20 min，用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗干凈后，每個(gè)圈加入100 μL DAPI工作液，于37 ℃培養(yǎng)箱中避光染色5 min，再次用PBS清洗干凈，在顯微鏡下觀察。提取腎皮質(zhì)總蛋白，按照NADPH活性定量檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Western Blotting檢測(cè) 取30 μg總蛋白，用10% SDS-PAGE分離膠電泳，NC膜轉(zhuǎn)膜，用5%脫脂奶粉或5%牛血清蛋白（BSA）室溫封閉1 h，4 ℃過(guò)夜孵育一抗，p47phox、p-PKC-α、PKC-α、fibronectin、β-actin，TBST洗膜310 min后，室溫避光孵育熒光二抗1 h，山羊抗兔Dylight-800，TBST避光洗膜310 min后，用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)掃膜，采用Quantity One軟件分析條帶。

1.2.5 RT-PCR檢測(cè)采用Trizol和氯仿提取樣本RNA，使用核酸/蛋白分析儀測(cè)定RNA樣品純度和濃度，用PrimeScript RT試劑盒按照說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄cDNA。采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒，配置成20 μL體系，按照cDNA、引物混合液、熒光染料進(jìn)行加樣，根據(jù)說(shuō)明書(shū)設(shè)置RT-PCR程序，預(yù)變性95 ℃：30 s，PCR 95 ℃：5 s，60 ℃：30 s，采用Applied Biosystems StepOne Real-Time PCR System。引物順序見(jiàn)表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，如果方差齊性采用LSD-t檢驗(yàn)，如果方差不齊性采用Dunnett′s T3檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胡蘆巴丸及其單味藥改善糖尿病大鼠的糖耐量（OGTT）

與正常組比較，模型組小鼠在空腹、1 h和2 h各時(shí)間點(diǎn)血糖明顯升高，且曲線下面積明顯大于正常組（P<0.01）;與模型組比較，各藥物處理組表現(xiàn)出良好的降低各時(shí)間點(diǎn)血糖水平，且曲線下面積明顯小于模型組（P<0.01）。見(jiàn)圖1A、1B。

2.2 胡蘆巴丸及其單味藥改善糖尿病大鼠血脂

模型組大鼠較正常組大鼠而言，表現(xiàn)出明顯的血脂紊亂，血清TG、TC、LDL-C明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，胡蘆巴丸及胡蘆巴能不同程度的降低TG、TC、LDL-C（P<0.01），而補(bǔ)骨脂組只能降低TG、TC（P<0.01），卡托普利組能降低TC（P<0.01）、LDL-C（P<0.01）。各組大鼠血清中HDL-C水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見(jiàn)圖1C、1D、1E。

2.3 胡蘆巴丸及其單味藥減輕糖尿病大鼠蛋白尿，改善腎功能

在光學(xué)顯微鏡和電鏡下觀察，正常組HE染色顯示腎小球、腎小管及間質(zhì)未見(jiàn)明顯病理改變;電鏡下正常組未見(jiàn)腎小球、腎小管及間質(zhì)結(jié)構(gòu)異常。模型組HE染色顯示出腎小管上皮細(xì)胞壞死脫落，少數(shù)區(qū)見(jiàn)有糖原沉著，腎小管上皮細(xì)胞透亮，腎小球體積增大;電鏡下顯示模型組腎小球足突節(jié)段性融合，灶狀纖維增生。胡蘆巴組、補(bǔ)骨脂組HE染色顯示腎小管及間質(zhì)未見(jiàn)明顯病理改變。胡蘆巴丸組HE染色顯示腎小管及其間質(zhì)未見(jiàn)明顯改變，少數(shù)腎小球呈分葉狀?？ㄍ衅绽MHE染色鏡下顯示腎小球呈分葉狀，腎小管糖原沉積，腎小管上皮細(xì)胞透亮。見(jiàn)圖2A、2B。模型組大鼠腎重/體質(zhì)量比例較正常組明顯升高（P<0.01），血清尿素氮（BUN）、肌酐（SCr）、24 h尿總蛋白（UTP）和尿白蛋白（UALB）升高明顯（P<0.01）;在各藥物處理組中，血清BUN、SCr、UTP、UALB明顯較模型組降低（P<0.01），但各藥物處理組間在大鼠腎重/體質(zhì)量比例、血清BUN、SCr、UTP、UALB水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2C、2D、2E、2F、2G。

2.4 胡蘆巴丸及其單味藥減輕糖尿病大鼠腎小球纖維化和氧化應(yīng)激

正常組PAS染色顯示腎小球毛細(xì)血管叢基底膜未見(jiàn)明顯增厚，系膜區(qū)、基質(zhì)未見(jiàn)增生;Masson染色顯示腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管清晰，呈網(wǎng)狀。模型組PAS染色見(jiàn)腎小球毛細(xì)血管叢基底膜增厚明顯，系膜區(qū)、基質(zhì)增生;Masson染色腎小球結(jié)構(gòu)正常，有輕度纖維化。胡蘆巴組PAS染色腎小球毛細(xì)血管從基底膜未見(jiàn)明顯增厚，系膜區(qū)、基質(zhì)部分增生，系膜細(xì)胞增多;Masson染色腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)基本正常，毛細(xì)血管清晰，呈網(wǎng)狀，輕度纖維化。補(bǔ)骨脂組PAS染色顯示腎小球毛細(xì)血管叢基底膜未見(jiàn)明顯增厚，系膜區(qū)、基質(zhì)增生;Masson染色顯示腎小球肥大、纖維化明顯。胡蘆巴丸組PAS染色顯示腎小球毛細(xì)血管叢基底膜未見(jiàn)明顯增厚，系膜、基質(zhì)區(qū)未見(jiàn)增生;Masson染色顯示腎小球有輕度纖維化?？ㄍ衅绽MPAS染色顯示腎小球毛細(xì)血管叢基底膜未見(jiàn)明顯增厚，系膜區(qū)、基質(zhì)未見(jiàn)增生;Masson染色顯示腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常，毛細(xì)血管清晰，呈網(wǎng)狀。見(jiàn)圖3A、3B。

氧化應(yīng)激是DKD發(fā)展的重要因素，模型組大鼠腎組織中NADPH氧化酶活性較正常組明顯升高（P<0.01），與模型組比較，胡蘆巴丸組、胡蘆巴組、補(bǔ)骨脂組、卡托普利組大鼠腎組織NADPH氧化酶活性均顯著降低（P<0.01），胡蘆巴丸組NADPH氧化酶活性是模型組的一半。在熒光顯微鏡下觀察到模型組大鼠有明顯的紅色熒光顯色。見(jiàn)圖3C。與模型組比較，胡蘆巴丸組大鼠腎臟組織紅色熒光強(qiáng)度明顯減弱;胡蘆巴組、補(bǔ)骨脂組、卡托普利組大鼠腎臟組織紅色熒光強(qiáng)度較模型組減弱，但其中胡蘆巴丸組紅色熒光強(qiáng)度減弱最明顯。見(jiàn)圖4。

2.5 胡蘆巴丸及其單味藥對(duì)p47phox、磷酸化PKC-α、Fibronectin蛋白和基因表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中p47phox蛋白及mRNA水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，胡蘆巴丸組、補(bǔ)骨脂組、卡托普利組大鼠腎臟組織中p47phox蛋白及mRNA水平明顯降低（P<0.01）;相對(duì)胡蘆巴丸組而言，胡蘆巴組、補(bǔ)骨脂組單味藥降低p47phox蛋白及mRNA水平不及胡蘆巴丸。見(jiàn)圖5A、5B和5E。胡蘆巴丸及其單味藥可以明顯降低p47phox蛋白及mRNA水平。與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中磷酸化PKC-α蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01），與模型組比較，胡蘆巴丸組、胡蘆巴組、補(bǔ)骨脂組及卡托普利組大鼠腎臟組織中磷酸化PKC-α蛋白表達(dá)均明顯降低;胡蘆巴組和補(bǔ)骨脂組磷酸化PKC-α蛋白降低程度不及胡蘆巴丸組。見(jiàn)圖5A、5C。但各組之間PKC-α mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖5F。胡蘆巴丸及其單味藥可以明顯降低PKC-α蛋白水平，但對(duì)mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中Fibronectin蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，胡蘆巴丸組、胡蘆巴組、補(bǔ)骨脂組及卡托普利組均能明顯降低Fibronectin蛋白（P<0.05），然而胡蘆巴丸降低Fibronectin蛋白水平較單味藥明顯。胡蘆巴丸能明顯降低Fibronectin蛋白水平，減輕DKD腎小球纖維化。見(jiàn)圖5D。

3 討論

胡蘆巴丸是由胡蘆巴和補(bǔ)骨脂組成的補(bǔ)腎中藥復(fù)方，前期已有動(dòng)物和臨床試驗(yàn)均證實(shí)了胡蘆巴具有潛在的降糖、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和腎臟保護(hù)作用[10-11，14]。但是未見(jiàn)到有關(guān)胡蘆巴丸及其單味藥物治療糖尿病腎病的研究。

本研究顯示，采用高湯高脂飲食和小劑量STZ尾靜脈注射的方法，可成功建立大鼠T2DM模型，該模型具有糖脂代謝紊亂的特點(diǎn)，表現(xiàn)為血糖升高、血脂升高;同時(shí)，該模型還表現(xiàn)出糖尿病腎病的特點(diǎn)，包括：血肌酐、血尿素氮、24 h尿總蛋白及白蛋白水平顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，胡蘆巴丸不僅具有降低血糖、降低血脂的作用，還具有降低血肌酐、血尿素氮等保護(hù)腎臟的作用。而且胡蘆巴、補(bǔ)骨脂單味藥物觀察組也顯示出降糖調(diào)脂，保護(hù)腎功能的作用。

本研究進(jìn)一步觀察了胡蘆巴丸對(duì)于腎臟形態(tài)學(xué)的影響。結(jié)果顯示：模型組大鼠較正常組大鼠而言，腎小球體積增大、腎小球纖維化、系膜區(qū)及細(xì)胞外基質(zhì)增生、足細(xì)胞足突融合。經(jīng)胡蘆巴丸及其單味藥物治療后，腎小球體積增大減輕，腎小球纖維化緩解，系膜區(qū)及細(xì)胞外基質(zhì)增生減輕，足細(xì)胞足突融合不明顯。以上結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了胡蘆巴丸具有腎臟保護(hù)作用，而且胡蘆巴丸復(fù)方對(duì)腎臟形態(tài)學(xué)的改善作用較單味中藥治療的療效更顯著，尤其表現(xiàn)在改善腎小球纖維化的作用。我們觀察到，胡蘆巴丸在下調(diào)細(xì)胞外基質(zhì)主體蛋白——纖黏蛋白（Fibronectin）表達(dá)的作用上更具有優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明胡蘆巴丸對(duì)腎臟的保護(hù)作用可能通過(guò)緩解腎小球纖維化來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在糖尿病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，長(zhǎng)期的高糖和高脂環(huán)境引發(fā)氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激過(guò)程中所產(chǎn)生的自由基極易損傷腎臟組織的內(nèi)皮細(xì)胞，同時(shí)又加重糖脂代謝紊亂，二者形成惡性循環(huán)，是糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制，尤其對(duì)DKD的貢獻(xiàn)巨大[18-20]。氧化應(yīng)激時(shí)機(jī)體產(chǎn)生大量的活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），不僅容易攻擊脂質(zhì)、核酸和蛋白質(zhì)等生物大分子，引起氧化損傷，還作為第二信使的信號(hào)分子，嚴(yán)重干擾細(xì)胞的正常信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[21-22]。DHE是一種活性氧的熒光探針，因此DHE染色被廣泛應(yīng)用于反映組織氧化應(yīng)激水平的評(píng)價(jià)指標(biāo)。在超氧陰離子存在的條件下，DHE可被氧化，形成氧化乙啶，氧化乙啶可與細(xì)胞核的染色體DNA結(jié)合，產(chǎn)生紅色熒光[23-25]。本研究顯示，糖尿病大鼠腎臟組織中可觀察到大量的超氧陰離子累積，而經(jīng)過(guò)胡蘆巴丸及其單味中藥治療后，超氧陰離子的水平可明顯下降。同時(shí)，胡蘆巴丸較單味中藥對(duì)氧化應(yīng)激的改善程度更明顯，說(shuō)明胡蘆巴丸對(duì)腎臟的保護(hù)作用可能與其所具有的抗氧化應(yīng)激活性有關(guān)。

為探討蘆胡巴丸發(fā)揮改善腎組織氧化應(yīng)激作用的可能機(jī)制，本研究進(jìn)一步就與ROS產(chǎn)生的相關(guān)因子，從基因及蛋白水平進(jìn)行檢測(cè)。高糖環(huán)境下的腎臟，其ROS主要來(lái)源于NADPH氧化酶，對(duì)糖尿病腎病的發(fā)生與發(fā)展起著決定性的作用[26]。由于蛋白激酶C-α（PKC-α）及活化過(guò)程中的關(guān)鍵亞單位p47phox是NADPH氧化酶的上游分子，因此本研究對(duì)NADPH活性做了定量檢測(cè)，同時(shí)還觀察NADPH氧化酶上游調(diào)節(jié)機(jī)制中關(guān)鍵因子的基因表達(dá)，包括：PKC-α、活化過(guò)程中的關(guān)鍵亞單位p47phox，蛋白及mRNA表達(dá)量的變化。結(jié)果顯示：胡蘆巴丸可顯著抑制糖尿病大鼠腎組織中NADPH氧化酶的活性，降低p47phox基因的表達(dá)、磷酸化PKC-α蛋白的表達(dá)。同時(shí)，本研究亦發(fā)現(xiàn)，胡蘆巴丸的上述下調(diào)作用，與單味中藥的比較，效果更佳。但是，無(wú)論胡蘆巴丸還是單味藥，均表現(xiàn)出對(duì)PKC-α mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)作用。因此，本研究首次證實(shí)了胡蘆巴丸及其單味藥可能通過(guò)抑制PKC-α-NADPH氧化酶信號(hào)通路，從而實(shí)現(xiàn)減輕腎組織的ROS產(chǎn)生。

綜上所述，本研究證實(shí)了胡蘆巴丸及其單味藥（胡蘆巴、補(bǔ)骨脂）對(duì)于2型糖尿病大鼠DKD的改善作用：抑制PKC-α-NADPH氧化酶信號(hào)通路，減輕氧化應(yīng)激。此外，在腎臟保護(hù)作用、改善氧化應(yīng)激方面，胡蘆巴丸較單味藥更具有優(yōu)勢(shì)，為中醫(yī)理論體系中的“中藥配伍”理論提供了一定基礎(chǔ)。

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（2021-08-10收稿 責(zé)任編輯：王明）