任雪梅，南力彰，李旭凱

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

玉米是糧食、飼料和能源兼用的作物，不僅能夠作為許多發(fā)展中國家人口的主食，又可作為畜牧業(yè)肉、蛋、奶生產(chǎn)的主要原料。在我國，玉米主要以飼料加工為主，也有部分成為了餐桌上的美味佳肴。

目前種植和推廣的玉米品種以高產(chǎn)的普通玉米為主，其玉米籽粒中賴氨酸、色氨酸含量較低，品質(zhì)較差。普通玉米籽粒賴氨酸含量?jī)H在0.23%左右，達(dá)不到畜禽飼料對(duì)賴氨酸的需求（0.6%～0.8%）[1]。其主要原因是由于占胚乳儲(chǔ)藏蛋白絕大多數(shù)的醇溶蛋白（70%）所含的賴氨酸及色氨酸含量低所造成。因此，不能依靠增加玉米籽粒蛋白質(zhì)含量來增加玉米的營養(yǎng)價(jià)值，而是需要通過降低胚乳醇溶蛋白的含量，進(jìn)而增加玉米胚乳中賴氨酸的含量來改良玉米蛋白質(zhì)的品質(zhì)[1]。

玉米硬質(zhì)胚乳和粉質(zhì)胚乳的比例決定玉米的籽粒質(zhì)地。opaque2玉米突變體的籽粒中胚乳醇溶蛋白的含量降低，賴氨酸含量顯著增加，但其籽粒中硬質(zhì)胚乳含量降低，粉質(zhì)胚乳含量增高，因此，胚乳表現(xiàn)出軟質(zhì)、粉質(zhì)的特征，不僅影響玉米產(chǎn)量，而且易受機(jī)械損傷，易感染昆蟲、病原菌等[2-3]。育種工作者通過利用opaque-2（o2）修飾因子，在o2存在的情況下恢復(fù)籽粒硬度培育了優(yōu)質(zhì)蛋白玉米（Quality protein maize，QPM），從而應(yīng)用到生產(chǎn)中[4]。

本研究從玉米籽粒形態(tài)結(jié)構(gòu)、玉米胚乳醇溶蛋白的分類及形成過程、轉(zhuǎn)錄因子對(duì)醇溶蛋白表達(dá)的調(diào)控這3個(gè)部分展開敘述，綜述了玉米胚乳醇溶蛋白合成的分子機(jī)制，對(duì)優(yōu)良玉米品種的培育具有重要意義。

1 玉米籽粒的形態(tài)結(jié)構(gòu)

成熟的玉米籽粒由胚（embryo）、胚乳（endosperm）以及包裹胚和胚乳的種皮（pericarp）3個(gè)部分組成，其中，胚乳占籽粒體積和質(zhì)量的絕大部分，大約占籽粒干質(zhì)量的85%，是決定玉米籽粒大小和產(chǎn)量的關(guān)鍵因素（圖1）[5]。

玉米籽粒通過雙受精獲得，雄配子體的一個(gè)精細(xì)胞與卵細(xì)胞融合成受精卵，進(jìn)而發(fā)育形成二倍體的胚；另一個(gè)精細(xì)胞與具有雙核的中央細(xì)胞融合成受精極核，最終發(fā)育形成三倍體的胚乳；種皮由來自母本的珠被發(fā)育而來，包裹著胚和胚乳。胚的結(jié)構(gòu)由外到內(nèi)依次為：盾片（scutellum）、胚芽鞘（coleoptile）、胚根鞘（coleorhiza）、胚芽（shoot apex）、胚根（root）以及中胚軸（mesocotyl）。胚乳的結(jié)構(gòu)包含胚周圍區(qū)（Embryo surrounding region，ESR）、基部胚乳轉(zhuǎn)移層（Basal endosperm transfer layer，BETL）、淀粉胚乳區(qū)（Starchy endosperm region）以及糊粉層（Aleurone layer）。其中，淀粉胚乳區(qū)是籽粒構(gòu)成的主體部分，主要負(fù)責(zé)蛋白和碳水化合物的合成[5]。

2 玉米胚乳醇溶蛋白分類及形成過程

玉米籽粒胚乳是營養(yǎng)物質(zhì)的儲(chǔ)藏中心，主要包含淀粉及儲(chǔ)藏蛋白。玉米胚乳儲(chǔ)藏蛋白的組分決定了胚乳的結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)品質(zhì)[5-6]。儲(chǔ)藏蛋白以蛋白體的形式存在，根據(jù)溶解度的不同將胚乳儲(chǔ)藏蛋白分為白蛋白（albumin）、球蛋白（globulin）、谷蛋白（glutelin）和醇溶蛋白（prolamin）。其中，醇溶蛋白占到總蛋白含量的70%，是含量最多的胚乳儲(chǔ)藏蛋白[7]。

玉米胚乳醇溶蛋白包含4個(gè)亞類（圖2），即α-zeins（19、22 ku）、γ-zeins（50、27、16 ku）、β-zeins（15 ku）和δ-zeins（18、10 ku）[8]。其中，α-zein占總醇溶蛋白含量的60%以上，是醇溶蛋白的主要組分。

醇溶蛋白在胚乳中的形成和積累具有特異性。大約授粉后10 d左右，醇溶蛋白開始合成[7]。胚乳發(fā)育的過程中蛋白體由外向內(nèi)逐漸形成，在蛋白體形成早期，β-zein和γ-zein作為結(jié)構(gòu)蛋白在糙面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上先合成，并積累在蛋白體的外圍（圖3-A）。在蛋白體形成的中期，大多數(shù)的α-zein和少數(shù)的δ-zein開始在內(nèi)部積累，并逐漸形成球形的蛋白體（圖3-B）。在蛋白體形成的后期，19 ku α-zein及δ-zein位于蛋白體的核心，包裹在22 ku α-zein的內(nèi)部，而最外層是β-zein和γ-zein，形成成熟的蛋白體（圖3-C）。成熟的蛋白體直徑在1～2 μm，呈均勻的圓形，并且α-zein必須在γ-zein存在下才能穩(wěn)定積累[9-10]。

玉米醇溶蛋白在胚乳發(fā)育過程中的胚乳蛋白體中大量積累，對(duì)蛋白體的形成具有重要作用，進(jìn)而能夠影響玉米籽粒的質(zhì)地[10]。關(guān)于玉米質(zhì)地的形成，DUVICK的觀點(diǎn)被廣泛認(rèn)可。他認(rèn)為在發(fā)育中的胚乳外周區(qū)域存在一定比例的淀粉粒、蛋白質(zhì)和黏性細(xì)胞質(zhì)，在籽粒成熟脫水時(shí)形成堅(jiān)硬的致密的透明的硬質(zhì)胚乳；而在胚乳中央?yún)^(qū)域，醇溶蛋白體較小且數(shù)量較少，籽粒成熟干燥時(shí)不能形成堅(jiān)硬的基質(zhì)，淀粉粒完全裸露，導(dǎo)致了胚乳中央?yún)^(qū)域呈現(xiàn)粉質(zhì)狀（圖4）[11]。在o2突變體中，主要的醇溶蛋白組分α-zein的含量降低了60%以上，因此，胚乳外周區(qū)域也粉質(zhì)化（圖4）。而o2突變體中籽粒總蛋白含量幾乎保持不變，因此相應(yīng)地提高了籽粒中的非醇溶蛋白及賴氨酸含量[12]。然而，粉質(zhì)化嚴(yán)重影響了o2突變體在實(shí)際儲(chǔ)存及生產(chǎn)中的應(yīng)用。經(jīng)過墨西哥國際玉米和小麥改良中心（CIMMYT）對(duì)硬粒透明o2突變體品種的選育，篩選到了QPM品種，既保留了o2突變體中低含量的α-zein及高含量的賴氨酸和色氨酸，又具有和野生型基本相同的籽粒硬度[4]。

因此，改變胚乳醇溶蛋白的合成及蛋白體的形成就能改變籽粒的質(zhì)地。與其他3種儲(chǔ)藏蛋白（也叫非醇溶蛋白）相比，醇溶蛋白缺乏必需的賴氨酸及色氨酸，嚴(yán)重影響了玉米的營養(yǎng)品質(zhì)。因而，改變醇溶蛋白的組分及含量對(duì)改善玉米營養(yǎng)品質(zhì)及籽粒外觀具有重要意義。通過育種技術(shù)改變醇溶蛋白的組分及含量，提高玉米品質(zhì)、肉蛋制品的品質(zhì)及改善人類營養(yǎng)攝取是重要的手段[13]。

3 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)醇溶蛋白表達(dá)的調(diào)控

盡管已經(jīng)有一些報(bào)道指出醇溶蛋白基因是受轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[14-15]，但是轉(zhuǎn)錄因子（Transcription factor，TF）對(duì)醇溶蛋白的轉(zhuǎn)錄調(diào)控發(fā)揮主要作用（表1）[16]。轉(zhuǎn)錄因子能夠結(jié)合在醇溶蛋白基因啟動(dòng)子區(qū)的調(diào)控元件上，從而調(diào)控醇溶蛋白基因的表達(dá)。目前報(bào)道的調(diào)控醇溶蛋白基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子有5個(gè)家族，bZIP（basicregion-leucinezipper）家族的O2（Opaque-2）、OHP1/2（O2 Heterodimerizing Protein 1/2）和ZmbZip22，Dof（DNA binding with One Finger）家族的PBF1（P-box Binding Factor1），MADS家族的Zm-MADS47以及NAC家族的ZmNAC128/130。

表1 調(diào)控醇溶蛋白的轉(zhuǎn)錄因子

O2是正向調(diào)控胚乳醇溶蛋白表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，通過轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽法克隆到O2基因，發(fā)現(xiàn)其在發(fā)育的胚乳中特異性表達(dá)[27]。O2通過結(jié)合22 ku α-zein啟動(dòng)子區(qū)的O2-box（5′-TCCACGTAG-3′）核心元件調(diào)控其轉(zhuǎn)錄[21]。該基因突變會(huì)導(dǎo)致22 ku α-zein基因的表達(dá)量降低，并會(huì)使得富含賴氨酸的非醇溶蛋白的含量增加[21]。此外，o2基因的突變還能增加游離氨基酸的含量[28]。利用染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序研究表明，除了編碼16 ku γ-zein的基因外，O2可以直接激活幾乎所有的醇溶蛋白編碼基因；然而，O2對(duì)不同的醇溶蛋白基因啟動(dòng)子的激活程度不同[17，20，26，29]。

o2是隱性的、多效性的，而且在不同的α-zein單倍型中滲透程度不同[30]。在有的品系中α-zein的含量能減少60%以上[8]。o2修飾因子（o2 modifier）能夠在o2存在條件下，將粉質(zhì)的胚乳轉(zhuǎn)化為堅(jiān)硬的籽粒質(zhì)地。這種經(jīng)修飾產(chǎn)生的o2突變體即為QPM[31-32]。QPM胚乳中α-zein維持較低的含量，而積累了大量的小的、富含γ-zein的蛋白體，其γ-zein含量是野生型及o2突變體胚乳的2～3倍[33]，這些蛋白體被認(rèn)為可以形成一種堅(jiān)硬的硬質(zhì)基質(zhì)，其質(zhì)地類似于成熟的野生型胚乳（圖4）。

2008年HOLDING等[32]的研究發(fā)現(xiàn)，在玉米7號(hào)染色體上存在7個(gè)o2修飾因子位點(diǎn)，其中，o2 modifier1落在7號(hào)染色體上（chr7：13861507-128175453），位于27 ku γ-zein位點(diǎn)的附近，是主效的胚乳修飾位點(diǎn)，而其余6個(gè)修飾位點(diǎn)的效應(yīng)較小。γ-zein被認(rèn)為是胚乳修飾所必需的[34]。為了進(jìn)一步探究γ-zein對(duì)QPM胚乳修飾的作用，巫永睿研究員課題組通過全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)合連鎖分析發(fā)現(xiàn)一個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)（Quantitative trait locus，QTL）qγ27，該位點(diǎn)位于o2 modifier1的同一區(qū)域。qγ27是在27 ku γ-zein位點(diǎn)上產(chǎn)生15.26 kb的重復(fù)，增強(qiáng)了27 ku γ-zein在QPM胚乳修飾中的表達(dá)。這個(gè)片段的復(fù)制發(fā)生在玉米馴化改良之前，其祖先大芻草中已存在此片段。由于提高27 ku γ-zein表達(dá)量對(duì)優(yōu)質(zhì)蛋白玉米胚乳修飾具有重要作用，因此，推測(cè)qγ27位點(diǎn)的存在是人工選擇的結(jié)果，并且這項(xiàng)研究將會(huì)為優(yōu)質(zhì)蛋白玉米育種提供有效的分子標(biāo)簽[35]。

在編碼醇溶蛋白基因翻譯起始位點(diǎn)上游約300 bp的啟動(dòng)子區(qū)存在保守的醇溶蛋白框（Prolamin Box，P-box）基序（5′-TGTAAAG-3′），該基序存在于多種作物中編碼種子儲(chǔ)藏蛋白基因的啟動(dòng)子區(qū)[23]。PBF（Prolamin-box Binding Factor）屬于植物特有的鋅指DNA結(jié)合蛋白的Dof類轉(zhuǎn)錄因子家族，其能夠與P-box基序結(jié)合并激活醇溶蛋白基因在胚乳發(fā)育時(shí)期特異表達(dá)[23]。PBF還能與O2相互作用，O2結(jié)合位點(diǎn)在22 ku α-zein基因啟動(dòng)子區(qū)P-box下游的20 bp處，二者協(xié)同調(diào)控α-zein基因的轉(zhuǎn)錄[7]。令人驚訝的是，使用RNAi沉默PBF1導(dǎo)致27 ku γ-zein嚴(yán)重減少，而α-zein的減少量較少[7]，這表明PBF1在調(diào)控醇溶蛋白基因表達(dá)中的作用可能是復(fù)雜的。然而，缺乏有效的突變體去進(jìn)一步探究該基因在胚乳發(fā)育中的具體作用。利用瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)研究玉米PBF1和O2對(duì)水稻及小麥儲(chǔ)藏蛋白基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，研究發(fā)現(xiàn)，PBF1和O2對(duì)水稻及小麥儲(chǔ)存蛋白表達(dá)具有協(xié)同疊加效應(yīng)，提高了水稻籽粒儲(chǔ)藏蛋白基因的表達(dá)[36]。小麥中的WPBF（Wheat Prolamin-box Binding Factor）對(duì)小麥籽粒發(fā)育過程中α-zein基因的表達(dá)也發(fā)揮同樣作用[37]。由此可見，不同禾本科物種中PBF1和O2的同源基因都能夠在胚乳發(fā)育過程中發(fā)揮相似的作用，參與調(diào)控胚乳發(fā)育的基因在遺傳基礎(chǔ)上具有一定的保守性。

O2異源二聚體蛋白OHP1（O2 Heterodimerizing Protein，OHP）、OHP2是2個(gè)bZIP轉(zhuǎn)錄因子[38-39]。與O2不同，OHPs在所有玉米組織中組成型表達(dá)[24]。OHP能夠識(shí)別所有α-zein基因的啟動(dòng)子區(qū)并激活轉(zhuǎn)錄，但是OHP激活α-zein基因表達(dá)量的變化要比O2低得多。在O2正常表達(dá)的株系中抑制OPH的表達(dá)，α-zein基因的表達(dá)量沒有明顯下降，但是O2的缺失突變體中，OHP對(duì)α-zein的表達(dá)起重要作用。證實(shí)了O2是主要的轉(zhuǎn)錄因子而OHP只是發(fā)揮較小的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)在27 ku的γ-zein中是相反的結(jié)論，表明O2和OHP經(jīng)過基因復(fù)制后功能分化，對(duì)醇溶蛋白的表達(dá)發(fā)揮特異的調(diào)控作用[18]。從進(jìn)化分析，玉米轉(zhuǎn)錄因子O2和OHP1、OHP2起源于片段復(fù)制。OHP1和OHP2能夠結(jié)合到編碼27 ku γ-zein基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件O2-like box（5′-TTTACGT-3′）上，與PBF互作，共同調(diào)控27 ku γ-zein的表達(dá)。它們的沉默導(dǎo)致27 ku γ-zein蛋白豐度的顯著減少。o2；PbfRNAi；OhpRNAi的三突變體中醇溶蛋白蛋白體只有野生型的1/10大小[24]。這些研究證實(shí)，OHPs、O2和PBF是玉米醇溶蛋白合成的主要調(diào)節(jié)因子，它們以累加和協(xié)同的方式共同作用。OHP和O2基因表達(dá)模式的差異可能導(dǎo)致蛋白體形成過程中27 ku γ-zein和22 ku α-zein積累時(shí)間的輕微差異。

ZmbZIP22是另一個(gè)胚乳特異性表達(dá)的bZIP轉(zhuǎn)錄因子，能夠激活編碼27 ku γ-zein基因的轉(zhuǎn)錄[25]。ZmbZIP22直接與27 ku γ-zein基因啟動(dòng)子區(qū)的ACA GCTCA框結(jié)合，激活27 ku γ-zein基因的表達(dá)。通過CRISPR/Cas9獲得的zmbzip22突變體中，27 ku γ-zein基因的表達(dá)量明顯降低。通過螢光素酶互補(bǔ)呈像及酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)，ZmbZIP22能夠與PBF1、OHP1和OHP2相互作用，但不能與O2相互作用。因此，ZmbZIP22能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控27 ku γ-zein基因的表達(dá)。

ZmMADS47是MADS-box家族的轉(zhuǎn)錄因子，最初由酵母雙雜交篩選O2的互作蛋白獲得。Zm-MADS47主要通過與O2的相互作用，激活編碼αzein和50 ku γ-zein基因的表達(dá)[23]。盡管存在與O2的相互作用，ZmMADS47表現(xiàn)出的是一種與OHPs類似的組成型表達(dá)，而不是與O2表達(dá)模式相同的胚乳特異性表達(dá)[23]。

編碼16-kD γ-zein基因的啟動(dòng)子區(qū)缺乏P-box和O2 box基序。因此，該基因的表達(dá)不受O2或PBF1的影響。ZmNAC128和ZmNAC130是2個(gè)胚乳特異性的NAC家族轉(zhuǎn)錄因子，能夠直接與16 ku γ-zein基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合激活其轉(zhuǎn)錄。這些NAC轉(zhuǎn)錄因子影響多個(gè)生物過程，RNAi沉默后影響胚乳中碳水化合物和氨基酸的利用以及胚乳中醇溶蛋白和非醇溶蛋白的積累[26]。

由以上分析可知，O2對(duì)玉米胚乳儲(chǔ)藏蛋白的積累具有較強(qiáng)的影響，能夠通過調(diào)控多種醇溶蛋白基因的表達(dá)進(jìn)而控制其積累量（表1）。醇溶蛋白基因的表達(dá)調(diào)控是多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子組合調(diào)控的結(jié)果，同一類型的醇溶蛋白受到多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控，如19 ku α-zein及22 ku δ-zein同時(shí)受到O2、PBF1及ZmMADS47的調(diào)控；27 ku γ-zein同時(shí)受到O2、PBF1、OHPs及ZmbZIP22的調(diào)控；50 ku γ-zein同時(shí)受到O2及ZmMADS47的調(diào)控。在調(diào)控醇溶蛋白基 因 的 轉(zhuǎn) 錄 因 子 中，O2、PBF1、ZmbZIP22、ZmNAC128和ZmNAC130都在胚乳中特異性表達(dá)，而OHPs和ZmMADS47則是組成性表達(dá)。這表明玉米醇溶蛋白編碼基因的表達(dá)模式不僅受胚乳特異性轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，還受到其他途徑的調(diào)控。

4 展望

玉米是我國最主要的糧食作物之一，在保障國家糧食安全和人口穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用。在前人不斷的育種實(shí)踐過程中，玉米的產(chǎn)量得到突飛猛進(jìn)的增長?，F(xiàn)階段對(duì)高品質(zhì)玉米、口感佳的鮮食玉米、抗逆玉米品種、適宜機(jī)械化收獲的玉米品種培育有了更多的需求，如鑒定和篩選抗旱及耐密易機(jī)收的玉米品種[40-41]、選育鮮食優(yōu)質(zhì)白糯玉米品種[42]、因地制宜選擇適宜特定產(chǎn)區(qū)的高產(chǎn)氮高效玉米品種[43]。探究玉米胚乳醇溶蛋白合成的分子機(jī)制對(duì)培育高品質(zhì)玉米品種具有現(xiàn)實(shí)意義。

隨著基因組學(xué)、生物化學(xué)和高分辨率顯微鏡技術(shù)的進(jìn)步，極大地?cái)U(kuò)展了研究人員對(duì)玉米醇溶蛋白生物合成和蛋白體形成的認(rèn)識(shí)。然而，研究人員對(duì)玉米醇溶蛋白基因表達(dá)調(diào)控的認(rèn)識(shí)還有更廣闊的空間需要去探索。根據(jù)現(xiàn)有的研究報(bào)道，大多數(shù)的醇溶蛋白基因由一個(gè)或多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，而將這些編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因突變體后，表現(xiàn)出醇溶蛋白的生物合成量降低而并非完全沒有積累。這表明醇溶蛋白的合成途徑還受到一些未被發(fā)掘的轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。前人總結(jié)了在小麥育種過程中利用其野生近緣種偃麥草屬植物對(duì)小麥遺傳改良的研究[44-45]，未來的玉米種質(zhì)的研究可能通過利用其野生資源大芻草挖掘更多新的調(diào)控醇溶蛋白的轉(zhuǎn)錄因子以及闡明其復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

近年來，隨著玉米醇溶蛋白表達(dá)調(diào)控以及分子遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，對(duì)QPM的調(diào)控機(jī)制也有了新的認(rèn)識(shí)，使得在不丟失其他優(yōu)良農(nóng)藝性狀的情況下調(diào)控籽粒營養(yǎng)成分成為可能。玉米胚乳醇溶蛋白的表達(dá)影響玉米籽粒的營養(yǎng)品質(zhì)。利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除部分編碼醇溶蛋白的基因，能夠選擇性地降低部分醇溶蛋白基因的表達(dá)，從而提高玉米籽粒的賴氨酸含量及蛋白品質(zhì)。通過對(duì)醇溶蛋白不斷深入的基礎(chǔ)研究將為QPM育種材料的選育提供指導(dǎo)，加快QPM的育種進(jìn)程。