穆 璐，張瀟筠，韓寶泉，陳昱光，張智英，徐 坤

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌712100)

大眼獅鱸魚皮膚腫瘤病毒(walleye dermal sarcoma virus，WDSV)所誘導(dǎo)的皮膚腫瘤(WDS)具有季節(jié)性生長(zhǎng)的特點(diǎn)，即秋季發(fā)生、春季萎縮、夏季基本消失。WDSV基因組除了包含病毒復(fù)制所必需的gag、pol和env基因外，還有orfA、orfB和orfC3個(gè)輔助基因。研究表明，萎縮期WDS中輔助基因的表達(dá)量比生長(zhǎng)期腫瘤高100倍以上[1]，說(shuō)明這些輔助基因在腫瘤萎縮過(guò)程中起著極其重要的作用。其中，orfA是目前研究報(bào)道最多的WDSV輔助基因，但是對(duì)其功能的認(rèn)識(shí)目前尚存在爭(zhēng)議[2]。

WDSV OrfA蛋白與哺乳動(dòng)物細(xì)胞D型周期蛋白具有一定的相似性，在酵母中表達(dá)OrfA能夠補(bǔ)償酵母D型周期蛋白缺陷，因此OrfA也被稱為逆轉(zhuǎn)錄病毒周期蛋白(retroviral cyclin,RV-cyclin)[3]。Lairmore等[4]提出orfA是致癌基因，因其發(fā)現(xiàn)orfA轉(zhuǎn)基因小鼠生長(zhǎng)遲緩、毛囊數(shù)減少，雌鼠失去泌乳功能,尾巴剪切后出現(xiàn)鱗狀上皮增生。Rovnak及其團(tuán)隊(duì)[5-9]經(jīng)過(guò)一系列研究發(fā)現(xiàn)，OrfA能夠通過(guò)其C端激活域(activation domain,AD)與TATA結(jié)合蛋白相關(guān)因子9(TATA binding protein-associa-ted factor 9,TAF9)結(jié)合，利用其N端細(xì)胞周期蛋白盒(cyclin box)與細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶3和8(cyclin-dependent kinases 3 and 8,CDK3 and CDK8)相互作用，參與宿主細(xì)胞的基因表達(dá)調(diào)控。有研究還發(fā)現(xiàn)，OrfA能夠增強(qiáng)直腸癌細(xì)胞中CDK8介導(dǎo)的血清應(yīng)答基因(immediate early genes,IEGs)的轉(zhuǎn)錄延伸和再起始效率，推測(cè)其與腫瘤的形成有關(guān)[10]。但是，這些證據(jù)尚不能充分支持orfA是致癌基因的假說(shuō)。

此外，早期研究發(fā)現(xiàn)，OrfA能夠在魚皮膚細(xì)胞W12及小鼠細(xì)胞NIH 3T3中抑制WDSV啟動(dòng)子(LTR)和一些真核啟動(dòng)子的活性，并抑制W12和NIH 3T3細(xì)胞的正常生長(zhǎng)[11-12]。Quackenbush等[13]的相關(guān)研究也表明，OrfA能夠在多種哺乳動(dòng)物和魚的細(xì)胞中抑制WDSV啟動(dòng)子及NF-κB依賴性啟動(dòng)子的活性。但對(duì)orfA轉(zhuǎn)基因斑馬魚的相關(guān)研究結(jié)果與轉(zhuǎn)基因小鼠結(jié)果相反，其研究結(jié)果表明，orfA基因的表達(dá)不僅沒(méi)有引起斑馬魚組織增生，反而能夠在致癌物質(zhì)處理下抑制肝癌的發(fā)生[14-15]。因此，并不能排除orfA作為抑癌基因通過(guò)調(diào)控WDSV和宿主基因誘導(dǎo)腫瘤萎縮的可能性。另有研究發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)WDSV克隆和orfA基因?qū)PC-A-1及Hela細(xì)胞具有一定的毒性，但是未檢測(cè)到細(xì)胞凋亡現(xiàn)象[16]，相關(guān)結(jié)果尚待商榷。

為了進(jìn)一步探討WDSV OrfA的作用機(jī)制，本課題組前期通過(guò)酵母雙雜交(yeast two-hybrid,Y2H)篩選試驗(yàn)初步發(fā)現(xiàn)了OrfA與轉(zhuǎn)錄因子E2F5的互作關(guān)系[17-18]。E2F家族成員具有調(diào)控細(xì)胞周期的重要功能，同時(shí)還是腫瘤抑制蛋白和腫瘤病毒轉(zhuǎn)化蛋白的分子靶標(biāo)[19-20]。作為E2F家族的一員，E2F5可與腫瘤抑制蛋白因子p130和p107相互作用[21]。此外，E2F5與多種癌癥發(fā)生有關(guān)，是一種潛在的致癌因子[22-24]。因此，推測(cè)OrfA極有可能通過(guò)與E2F5互作調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖，進(jìn)而影響腫瘤的發(fā)生或萎縮。

本研究通過(guò)酵母雙雜交回轉(zhuǎn)試驗(yàn)和免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP)試驗(yàn)，進(jìn)一步確認(rèn)OrfA與E2F5的互作關(guān)系，并分析過(guò)表達(dá)orfA基因?qū)2F5蛋白表達(dá)較高的SPC-A-1細(xì)胞增殖的影響，以期為后續(xù)深入研究orfA基因在腫瘤發(fā)生和萎縮過(guò)程中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

所用HEK293T細(xì)胞、Hela229宮頸癌細(xì)胞、A375惡性黑色素瘤細(xì)胞、SMMC-7721肝癌細(xì)胞和SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞，均購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)，經(jīng)本課題組傳代凍存。pLenti-EF1α-Blank、pGBKT7、pGBKT7-orfA、pGADGH、pPrey-E2F5、pGADGH-E2F5、pGBKT7-53和pGADT7-T載體，AH109酵母菌株、DH5α大腸桿菌，均為本課題組前期保存；RNA分離試劑TRizol Reagent，購(gòu)自Invitrogen公司；定量試劑TB Green?Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購(gòu)自O(shè)mega公司；細(xì)胞培養(yǎng)用試劑，購(gòu)自Gibco公司；RIPA裂解緩沖液，購(gòu)自普利萊基因技術(shù)有限公司；Protein G Agarose、Cell Counting Kit-8及Propidium Iodide檢測(cè)試劑，購(gòu)自碧云天生物有限公司；GAPDH抗體(鼠)、c-Myc標(biāo)簽抗體(兔)和一步法快速WB(HRP)試劑盒(羊抗鼠、羊抗兔)，購(gòu)自康為世紀(jì)公司；E2F5單克隆抗體(鼠)，購(gòu)自Abcam公司；Western Blot用PVDF膜、ECL顯色液，購(gòu)自Millipore公司；其他試劑均為分析純或更高級(jí)別試劑。試驗(yàn)所用引物由楊凌奧科生物有限公司合成，工作濃度為10 μmol/L。

1.2 方 法

1.2.1orfA與E2F5基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建 (1)orfA基因過(guò)表達(dá)載體pLenti-EF1α-orfA的構(gòu)建。以質(zhì)粒pGBKT7-orfA為模板，使用上游引物(5′-TTGCGTACGATGGAGGAGCAGAAGCTGA-TC-3′)和下游引物(5′-CGCGGATCCTCCTATTGGATCGACGACGTTG-3′)擴(kuò)增c-Myc標(biāo)簽與orfA基因(GenBank登錄號(hào)AF033822.1)片段，長(zhǎng)度為969 bp。采用普通PCR，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)BsiWⅠ/BamHⅠ雙酶切定向克隆到pLenti-EF1α-Blank載體中，構(gòu)建獲得orfA基因過(guò)表達(dá)載體pLenti-EF1α-orfA。

(2)E2F5基因過(guò)表達(dá)載體pLenti-EF1α-E2F5的構(gòu)建。以質(zhì)粒pGADGH-E2F5為模板，使用上游引物(5′-TTGCGTACGCCGCGGGGCCGGGA-3′)和下游引物(5′-CGCGGATCCATAATTTAGTA-TCTGGACATC-3′)擴(kuò)增E2F5基因片段，長(zhǎng)度為1 071 bp。采用降落式PCR(touchdown PCR,TD PCR)，反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，68 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，16個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火溫度降低1 ℃；然后94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，20個(gè)循環(huán)；最后72 ℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物通過(guò)BsiWⅠ/BamHⅠ雙酶切定向克隆到pLenti-EF1α-Blank載體中，構(gòu)建獲得E2F5基因過(guò)表達(dá)載體pLenti-EF1α-E2F5。

1.2.2 不同類型細(xì)胞系中E2F5蛋白表達(dá)的檢測(cè) 選用HEK293T細(xì)胞、Hela229宮頸癌細(xì)胞、A375惡性黑色素瘤細(xì)胞、SMMC-7721肝癌細(xì)胞和SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞5種細(xì)胞系進(jìn)行E2F5蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)。細(xì)胞培養(yǎng)條件均為：體積分?jǐn)?shù)90% DMEM培養(yǎng)基，體積分?jǐn)?shù)10% FBS，100 μg/mL的青鏈霉素，體積分?jǐn)?shù)5% CO2，溫度37 ℃。待細(xì)胞密度為70%～90%時(shí)，去除培養(yǎng)基，加入1～2 mL體積分?jǐn)?shù)0.25%含EDTA的胰酶消化1～2 min，4 ℃條件下以800g離心5 min收集細(xì)胞，使用RIPA裂解液按說(shuō)明書操作提取總蛋白。然后采用Wes-tern Blot按照標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)步驟檢測(cè)5種細(xì)胞系中E2F5及GAPDH蛋白的表達(dá)水平，并進(jìn)行灰度分析，從中選取E2F5蛋白表達(dá)量最高的細(xì)胞系備用。

1.2.3 OrfA與E2F5互作關(guān)系的驗(yàn)證 (1)酵母雙雜交試驗(yàn)。按質(zhì)粒組合分組，分別為陰性對(duì)照組pGBKT7/pGADGH、試驗(yàn)組1 pGBKT7-orfA/pGADGH、試驗(yàn)組2 pGBKT7/pGADGH-E2F5、試驗(yàn)組3 pGBKT7-orfA/pGADGH-E2F5和陽(yáng)性對(duì)照組pGBKT7-53/pGADT7-T。每組質(zhì)?？傎|(zhì)量為5 μg，2個(gè)質(zhì)粒物質(zhì)的量比為1∶1，總體積50 μL。采用醋酸鋰法按標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)步驟轉(zhuǎn)化AH109酵母菌株，涂布腺嘌呤核苷酸(Ade)和組氨酸(His)缺陷型SD固體培養(yǎng)基(SD/-Ade-His)平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d，篩選轉(zhuǎn)化陽(yáng)性克隆菌落。每個(gè)轉(zhuǎn)化分別挑取3個(gè)陽(yáng)性克隆菌落，接種到2 mL SD/-Ade-His液體培養(yǎng)基中，30 ℃、200 r/min過(guò)夜搖菌；采用分光光度計(jì)測(cè)OD600，調(diào)整所有菌液濃度至一致。每5個(gè)不同的酵母轉(zhuǎn)化子菌液為一組，分別按10倍梯度倍比稀釋至10 000倍；每個(gè)濃度梯度取5 μL菌懸液平行點(diǎn)布于腺嘌呤核苷酸(Ade)、組氨酸(His)、亮氨酸(Leu)和色氨酸(Trp)缺陷型SD固體培養(yǎng)基(SD/-Ade-His-Leu-Trp)平板上；30 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，觀察并拍照。

(2)免疫共沉淀試驗(yàn)。根據(jù)1.2.2節(jié)的試驗(yàn)結(jié)果，選用SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞進(jìn)行免疫共沉淀試驗(yàn)。設(shè)置試驗(yàn)組pLenti-EF1α-orfA/pLenti-EF1α-E2F5、pLenti-EF1α-orfA/pLenti-EF1α-Blank和對(duì)照組pLenti-EF1α-Blank，按Lipofectamine 3000說(shuō)明書操作步驟轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞；60 h后按1.2.1節(jié)中方法收集細(xì)胞總蛋白，采用E2F5單克隆抗體(鼠)按照Protein G Agarose說(shuō)明書步驟進(jìn)行免疫沉淀；對(duì)共沉淀復(fù)合物進(jìn)行SDS-PAGE電泳，采用c-Myc標(biāo)簽抗體(兔)作為一抗、HRP偶聯(lián)羊抗兔IgG作為二抗進(jìn)行Western Blot檢測(cè)。

1.2.4 過(guò)表達(dá)orfA基因?qū)PC-A-1細(xì)胞增殖的影響 (1)CCK-8檢測(cè)試驗(yàn)。按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書操作步驟，采用Lipofectamine 3000將pLenti-EF1α-orfA載體及骨架載體pLenti-EF1α-Blank(對(duì)照組)分別轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞24，48，72 h后，消化收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞并稀釋至密度為20 μL-1；以每孔100 μL細(xì)胞懸液重新接種于96孔板中進(jìn)行培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)避光孵育1 h，在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。每組6個(gè)重復(fù)，根據(jù)吸光度值評(píng)估OrfA過(guò)表達(dá)對(duì)SPC-A-1細(xì)胞增殖的影響。

(2)細(xì)胞周期流式檢測(cè)試驗(yàn)(PI單染色法)。按照PBS/PI/RNAase為100∶5∶1的體積比配制PI染液，用錫箔紙包裹避光保存。用pLenti-EF1α-Blank和pLenti-EF1α-orfA載體分別轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，1 200 r/min低速離心3 min，PBS清洗2遍，棄上清保留細(xì)胞沉淀。使用300 μL PBS重懸細(xì)胞沉淀，并逐滴加入到700 μL無(wú)水乙醇(預(yù)冷)中，輕輕混勻，4 ℃過(guò)夜固定。將過(guò)夜處理的細(xì)胞1 200 r/min低速離心3 min,棄上清，每管加入100 μL PI染液重懸細(xì)胞，置于37 ℃水浴鍋中孵育30 min。最后使用孔徑0.05 mm濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞，并進(jìn)行流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)分析。

1.2.5orfA基因過(guò)表達(dá)對(duì)SMAD4和caspase-3表達(dá)的影響 用pLenti-EF1α-Blank和pLenti-EF1α-orfA載體分別轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞；采用TRizol和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說(shuō)明書步驟操作，提取總RNA并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，制備獲得相應(yīng)的cDNA。采用BIO-RAD CFX96系統(tǒng)和SYBR Green熒光染料法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR。以GAPDH基因作為內(nèi)參對(duì)照，分別檢測(cè)SMAD4和caspase-3基因的表達(dá)情況。每個(gè)檢測(cè)最少設(shè)3個(gè)平行重復(fù)，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

所用引物序列為，GAPDH-F:5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′,GAPDH-R:5′-GGGGT-CGTTGATGGCAACA-3′;SMAD4-F:5′-CTCAT-GTGATCTATGCCCGTC-3′,SMAD4-R:5′-AGGT-GATACAACTCGTTCGTAGT-3′;CASP3-F:5′-CAGAACTGGACTGTGGCATTG-3′,CASP3-R:5′-GCTTGTCGGCATACTGTTTCA-3′。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有試驗(yàn)均最少設(shè)3個(gè)平行或獨(dú)立重復(fù)；數(shù)值均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(SEM)”表示，采用非配對(duì)雙尾t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 orfA與E2F5基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與驗(yàn)證

以質(zhì)粒pGBKT7-orfA為模板，采用普通PCR擴(kuò)增c-Myc標(biāo)簽與orfA基因序列，定向克隆到pLenti-EF1α-Blank載體中，獲得orfA基因過(guò)表達(dá)載體pLenti-EF1α-orfA(圖1-A)。

A.pLenti-EF1α-orfA質(zhì)粒示意圖譜；B.pLenti-EF1α-E2F5質(zhì)粒示意圖譜；C.pLenti-EF1α-orfA與pLenti-EF1α-E2F5雙酶切鑒定: 1.Trans 15K DNA Marker，2～3.pLenti-EF1α-orfA質(zhì)粒的AgeⅠ/XbaⅠ酶切條帶，4～5.pLenti-EF1α-E2F5質(zhì)粒的AgeⅠ/ BamHⅠ酶切條帶；D.質(zhì)粒轉(zhuǎn)染SPC-A-1細(xì)胞24 h后熒光顯微鏡觀察，比例尺=100 μmA.Schematic of tpLenti-EF1α-orfA plasmid;B.Schematic of pLenti-EF1α-E2F5 plasmid; C.The agarose gel electrophoretogram result of double-digested pLenti-EF1α-orfA and pLenti-EF1α-E2F5 plasmids:1.Trans2K Plus Ⅱ DNA Marker,2-3.The pLenti-EF1α-orfA plasmid digested by AgeⅠ/XbaⅠ, 4-5.pLenti-EF1α-E2F5 plasmid digested by AgeⅠ/BamHⅠ;D.The SPC-A-1 cells photographed by fluorescence microscope 24 h after transfection;Scale bar=100 μm圖1 orfA與E2F5基因過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定Fig.1 Construction and verification of plasmids for E2F5 and orfA overexpression

采用AgeⅠ/XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切條帶為8 878和2 083 bp(圖1-C泳道2和3)，結(jié)果鑒定正確；進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明，orfA基因序列無(wú)突變。轉(zhuǎn)染進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光(圖1-D)，表明pLenti-EF1α-orfA載體中OrfA-eGFP閱讀框正確，能夠有效表達(dá)。以質(zhì)粒pGADGH-E2F5為模板，采用降落式PCR擴(kuò)增E2F5基因的全長(zhǎng)序列，定向克隆到pLenti-EF1α-Blank載體中，獲得E2F5基因過(guò)表達(dá)載體pLenti-EF1α-E2F5(圖1-B)。采用AgeⅠ/BamHⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定，酶切條帶為8 893和2 159 bp(圖1-C泳道4和5)，結(jié)果鑒定正確；進(jìn)一步測(cè)序結(jié)果表明，E2F5基因序列無(wú)突變；轉(zhuǎn)染進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡下觀察有綠色熒光細(xì)胞，且明顯比pLenti-EF1α-orfA組增多(圖1-D)，表明pLenti-EF1α-E2F5載體中E2F5-eGFP閱讀框正確，能夠有效表達(dá)且效果優(yōu)于OrfA-eGFP。

2.2 不同類型細(xì)胞系中E2F5蛋白的表達(dá)量檢測(cè)

對(duì)HEK293T細(xì)胞、Hela229宮頸癌細(xì)胞、A375惡性黑色素瘤細(xì)胞、SMMC-7721肝癌細(xì)胞和SPC-A-1肺腺癌細(xì)胞中的E2F5蛋白表達(dá)量進(jìn)行Wes-tern Blot檢測(cè)，以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果如圖2-A所示，SMMC-7721和A375因細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)較差，Western Blot檢測(cè)效果不理想；但在 HEK293T、Hela229和SPC-A-1細(xì)胞中均檢測(cè)到了明顯的E2F5表達(dá)。灰度分析結(jié)果(圖2-B)顯示，SPC-A-1細(xì)胞中E2F5蛋白表達(dá)量相對(duì)較高，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，因此選取SPC-A-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

A.Western Blot檢測(cè)結(jié)果；B.蛋白相對(duì)表達(dá)量結(jié)果A.Result of Western Blot assay;B.Statistical analysis of relative expression of E2F5 protein圖2 不同細(xì)胞系中E2F5蛋白的表達(dá)情況Fig.2 Expression of E2F5 protein in different cell lines

2.3 WDSV OrfA與E2F5的相互作用

如圖3-A中AH109回轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果所示，雖然pGBKT7-orfA/pGADGH-E2F5轉(zhuǎn)化組效果明顯，但是pGBKT7-orfA/pGADGH轉(zhuǎn)化組也有較小的酵母菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明OrfA具有微弱的自激活作用，極有可能與E2F5互作，但仍有待進(jìn)一步核實(shí)。

A.酵母雙雜交回轉(zhuǎn)試驗(yàn)結(jié)果；B.OrfA和E2F5免疫共沉淀試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果:M.Protein marker，1.pLenti-EF1α-orfA/pLenti-EF1α-E2F5轉(zhuǎn)染組， 2.pLenti-EF1α-orfA/pLenti-EF1α-Blank轉(zhuǎn)染組，3.pLenti-EF1α-Blank對(duì)照組，+.基因過(guò)表達(dá)，-.基因未過(guò)表達(dá)A.Result of Y2H transformation assay;B.Result of Co-IP assay for OrfA and E2F5 interaction:M.Protein marker,1.The transfection group of pLenti-EF1α-orfA/pLenti-EF1α-E2F5,2.The transfection group of pLenti-EF1α-orfA/pLenti-EF1α-Blank, 3.The control transfection group of pLenti-EF1α-Blank,+.Gene was overexpressed,-.Gene was not overexpressed

本研究通過(guò)免疫共沉淀試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證OrfA與E2F5的互作關(guān)系，結(jié)果如圖3-B所示，pLenti-EF1α-orfA/pLenti-EF1α-E2F5轉(zhuǎn)染組OrfA和E2F5免疫共沉淀的效果顯著，在未過(guò)表達(dá)E2F5基因的pLenti-EF1α-orfA/pLenti-EF1α-Blank轉(zhuǎn)染組沉淀復(fù)合物中也明顯檢測(cè)到了OrfA-E2F5融合蛋白，表明WDSV OrfA與轉(zhuǎn)錄因子E2F5確實(shí)存在互作關(guān)系。

2.4 過(guò)表達(dá)orfA基因?qū)PC-A-1細(xì)胞增殖的影響

采用CCK-8試劑盒檢測(cè)過(guò)表達(dá)orfA基因?qū)PC-A-1細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果(圖4-A)表明，在SPC-A-1細(xì)胞被轉(zhuǎn)染24，48和72 h后，與pLenti-EF1α-Blank空載體對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pLenti-EF1α-orfA載體的OrfA過(guò)表達(dá)組細(xì)胞存活率均顯著增加。采用PI染色法結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)分析過(guò)表達(dá)orfA基因?qū)PC-A-1細(xì)胞周期的影響，結(jié)果如圖4-B所示，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染pLenti-EF1α-orfA載體的OrfA過(guò)表達(dá)組G1期細(xì)胞占比顯著減少，S期及G2期細(xì)胞占比略微增大。綜合2個(gè)試驗(yàn)的結(jié)果，推測(cè)過(guò)表達(dá)orfA基因能夠促進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞增殖。

A.CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果；B.細(xì)胞周期流式檢測(cè)結(jié)果；*代表差異顯著(P<0.05)，**代表差異極顯著(P<0.01)，下圖同A.Result of the CCK-8 assay;B.Result of the cell cycle analysis by flow cytometry;* represents a significant difference (P<0.05),** represents a highly significant difference (P<0.01),The same below

2.5 過(guò)表達(dá)orfA基因?qū)MAD4和caspase-3表達(dá)的影響

用RT-qPCR檢測(cè)orfA基因過(guò)表達(dá)對(duì)SMAD4基因和caspase-3基因表達(dá)的影響，結(jié)果(圖5)表明，轉(zhuǎn)染orfA基因過(guò)表達(dá)載體pLenti-EF1α-orfA的SPC-A-1細(xì)胞中，SMAD4基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著提高，而caspase-3基因mRNA相對(duì)表達(dá)量則極顯著降低，暗示W(wǎng)DSV OrfA可能通過(guò)抑制SPC-A-1細(xì)胞凋亡促進(jìn)其增殖。

3 討 論

由WDSV引起的WDS具有季節(jié)性生長(zhǎng)特點(diǎn)，WDSV的3個(gè)輔助基因orfA、orfB和orfC在WDS的發(fā)生和自然萎縮過(guò)程中起著關(guān)鍵作用。其中關(guān)于orfA基因的研究報(bào)道較多，但目前對(duì)其致癌性仍缺乏統(tǒng)一的認(rèn)知。一些研究結(jié)果推測(cè)orfA基因具有抑制腫瘤的作用[11-16]，而另一些研究則傾向于認(rèn)為orfA是致癌基因[4-10]。

圖5 過(guò)表達(dá)orfA基因?qū)MAD4和caspase-3 基因表達(dá)的影響Fig.5 Effect of orfA overexpression on SMAD4 and caspase-3 mRNA expression

本課題組前期通過(guò)酵母雙雜交篩選初步發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證了OrfA與轉(zhuǎn)錄因子E2F5的互作關(guān)系[17-18]。E2F家族是極其重要的轉(zhuǎn)錄因子家族，參與細(xì)胞周期、發(fā)育和腫瘤發(fā)生等多種細(xì)胞調(diào)控過(guò)程[20]。不同的E2F成員包含1個(gè)或多個(gè)高度保守的DNA結(jié)合域[21]。E2F5作為E2F家族的一員，與E2F4同源性較高，兩者均能與腫瘤抑制蛋白因子p130和p107相互作用[19]。許多microRNA通過(guò)干擾E2F5基因的表達(dá)來(lái)抑制多種腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移[25-28]。本研究在酵母雙雜交回轉(zhuǎn)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，OrfA具有微弱的自激活作用，這與OrfA蛋白C端含有非典型激活域的報(bào)道[7]一致。因此，雖然pGBKT7-orfA/pGADGH-E2F5轉(zhuǎn)化組菌落生長(zhǎng)效果明顯，但OrfA是否與E2F5直接互作仍有待核實(shí)；免疫共沉淀試驗(yàn)結(jié)果最終明確了二者的互作關(guān)系。

本研究篩選出E2F5蛋白表達(dá)量較高的SPC-A-1細(xì)胞，對(duì)其進(jìn)行CCK-8細(xì)胞增殖檢測(cè)試驗(yàn)和細(xì)胞周期流式檢測(cè)試驗(yàn)，初步證明過(guò)表達(dá)orfA基因可能促進(jìn)SPC-A-1細(xì)胞的增殖。這與前人“穩(wěn)定轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)WDSV克隆和orfA基因”的研究結(jié)果[16]相反。究其原因，可能與檢測(cè)手段、細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率、orfA基因表達(dá)載體及表達(dá)效率等不同有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，E2F5基因過(guò)表達(dá)載體中E2F5-eGFP融合蛋白的表達(dá)效果明顯強(qiáng)于orfA基因過(guò)表達(dá)載體中OrfA-eGFP。推測(cè)是因?yàn)閃DSV基因組orfA基因序列密碼子在人源細(xì)胞中的表達(dá)受到了一定程度的限制，在后續(xù)研究中將考慮依據(jù)目標(biāo)細(xì)胞種屬進(jìn)行相應(yīng)的密碼子優(yōu)化。

SMAD蛋白是TGF-β家族下游的受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其中SMAD4作為通用型SMAD蛋白，與R-SMAD聚合后以二聚體的形式在細(xì)胞核內(nèi)積累并調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄[29]。研究表明，E2F4、E2F5與SMAD4及p107等因子在TGF-β信號(hào)通路中均發(fā)揮重要作用[30]。Caspase-3作為細(xì)胞凋亡過(guò)程中最主要的終末剪切酶，是各種因素誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的最終執(zhí)行者，因此是細(xì)胞凋亡檢測(cè)中最常見(jiàn)的標(biāo)記分子。本研究發(fā)現(xiàn)，orfA基因過(guò)表達(dá)能夠顯著提高SMAD4基因的表達(dá)，但極顯著降低caspase-3基因的表達(dá)，暗示W(wǎng)DSV OrfA可能通過(guò)與E2F5互作調(diào)節(jié)SMAD4和caspase-3基因的表達(dá)，進(jìn)而抑制SPC-A-1細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其增殖，但具體分子機(jī)理有待進(jìn)一步研究。