馬 凱，佟廣香，張永泉，張慶漁，尹家勝，牟振波，匡友誼

(1中國水產(chǎn)科學(xué)研究院 黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150076；2西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院 水產(chǎn)科學(xué)研究所， 西藏 拉薩 850002；3黑龍江省冷水性魚類種質(zhì)資源及增養(yǎng)殖重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150076)

尖裸鯉(Oxygymnocyprisstewartii)屬鯉形目(Cypriniformes)、鯉科(Cyprinidae)、裂腹魚亞科(Schizothoracinae)、尖裸鯉屬(Oxygymnocypris)，俗稱斯氏裸鯉魚、拉薩白魚[1]，為我國西藏特有珍稀魚類。尖裸鯉分布范圍狹窄，僅分布于海拔3 600～4 300 m的雅魯藏布江中游及匯入該江段的各支流[2]，種群數(shù)量極易受到自然和人為因素影響。1981年，曹文宣等[3]根據(jù)鱗片和下咽齒等表型性狀，將其歸為裂腹魚類三個特化程度等級中的高度特化等級，但缺少相應(yīng)的細(xì)胞遺傳學(xué)證據(jù)。

尖裸鯉肉質(zhì)鮮美，市場需求巨大，為西藏重要經(jīng)濟(jì)魚類之一，曾為當(dāng)?shù)貪O民主要漁獲對象[4]，但由于過度捕撈和生境破壞，其自然資源量急劇下降，先后被列入中國瀕危動物紅皮書和中國脊椎動物紅色名錄[5-6]。為兼顧瀕危物種保護(hù)和漁業(yè)資源開發(fā)利用，開展尖裸鯉的人工養(yǎng)殖技術(shù)研究，將其開發(fā)成養(yǎng)殖魚類新品種是有效的解決途徑，這樣既可以避免大量捕撈野生個體又能滿足市場需求。培育魚類新品種首先需要制定種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，染色體是魚類遺傳物質(zhì)的主要載體，其數(shù)目、長度、著絲粒位置、隨體與次縊痕數(shù)目等統(tǒng)稱為染色體核型[7]，核型分析不僅對研究魚類演化規(guī)律、系統(tǒng)分類以及遺傳育種等具有重要意義[8]，也是制定種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的重要資料。目前，關(guān)于尖裸鯉染色體核型的研究極少，僅見發(fā)表于1989和1990年的2篇文獻(xiàn)[9-10]，但所報道的是同一份尖裸鯉染色體核型的研究結(jié)果，且由于早期拍照技術(shù)所限，獲得的尖裸鯉染色體核型圖譜非常模糊，也未提供詳細(xì)的染色體長度、臂比等信息，無法應(yīng)用于尖裸鯉種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)編制、染色體形態(tài)特征測量等。為此，本研究以西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所和中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所聯(lián)合馴養(yǎng)的尖裸鯉苗種為研究材料，對其進(jìn)行染色體核型分析及進(jìn)化地位研究，以期提供清晰可辨的尖裸鯉染色體核型圖譜和染色體長度、臂比等詳細(xì)數(shù)據(jù)信息，為尖裸鯉的進(jìn)化生物學(xué)、人工養(yǎng)殖種質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)制定和雜交育種親本選擇提供細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

2齡尖裸鯉雌雄各4尾，平均體長為(19.81±1.57) cm，平均體質(zhì)量為(51.35±10.12) g/尾，由西藏自治區(qū)農(nóng)牧科學(xué)院水產(chǎn)科學(xué)研究所繁殖，中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所渤海冷水性魚試驗(yàn)站養(yǎng)殖，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室后于充氣玻璃缸內(nèi)暫養(yǎng)5 d，水溫控制在(17±0.5) ℃，早晚各投喂1次。

1.2 方 法

1.2.1 染色體標(biāo)本制備 使用35 mg/L 3-氨基苯甲酸乙酯甲磺酸(MS-222)將試驗(yàn)魚麻醉后，參照林義浩[11]的方法，按10 μg/g劑量胸腔注射胎牛血清溶解的植物血球凝集素(PHA)，20 h后按1 μg/g劑量胸腔注射1×PBS溶解的秋水仙素，4 h后剪鰓放血，于超凈工作臺中取出頭腎后用7.5 g/L生理鹽水沖洗，然后用鑷子于7.5 g/L生理鹽水中將頭腎組織磨碎，游離出單個細(xì)胞，靜置5 min沉淀磨碎組織，取上清液于15 mL離心管中，4 ℃下1 500g離心6 min收集細(xì)胞沉淀，加入12 mL 5 g/L KCl低滲液吹打均勻后，室溫靜置45 min，1 500g離心6 min后加入12 mL卡諾氏固定液(V(甲醇)∶V(冰醋酸)=3∶1)懸浮細(xì)胞，室溫靜置30 min，1 500g離心6 min。重復(fù)固定2次。采用冷滴片法制片，室溫干燥，使用1 μg/mL PI避光染色10 min，蒸餾水洗去殘液后，室溫避光晾干。

1.2.2 核型分析 使用OLYMPUS熒光顯微鏡觀察染色體標(biāo)本并拍照，每個個體選取10個以上分散較好的染色體中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)，根據(jù)眾數(shù)確定尖裸鯉染色體數(shù)目，選擇5個清晰的染色體中期分裂相，根據(jù)耿龍武等[12]的方法使用E-ruler和Photoshop進(jìn)行核型分析。染色體分組依據(jù)Levan等[13]的標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)其絕對長度、著絲粒位置等進(jìn)行同源染色體配對[12]。

1.2.3 進(jìn)化地位分析 統(tǒng)計(jì)對比19種(或亞種)裂腹魚亞科魚類的染色體核型，按小島吉雄[14]的理論，分析尖裸鯉在裂腹魚亞科中的進(jìn)化地位。

2 結(jié)果與分析

2.1 尖裸鯉的染色體數(shù)目

試驗(yàn)共觀察了104個分散較好的尖裸鯉染色體中期分裂相，統(tǒng)計(jì)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知染色體眾數(shù)為92，其出現(xiàn)頻率為44.23%，據(jù)此得出尖裸鯉2n=92。

圖1 尖裸鯉染色體數(shù)統(tǒng)計(jì)Fig.1 Chromosome number of O. stewartii

2.2 尖裸鯉的染色體核型

對尖裸鯉染色體核型進(jìn)行比較分析，未見性別差異。選取5個清晰的染色體中期分裂相(圖2)，依據(jù)標(biāo)尺使用E-ruler軟件進(jìn)行測量后，統(tǒng)計(jì)每條染色體的絕對長度和臂比，并根據(jù)染色體絕對長度和形態(tài)特征等對其進(jìn)行同源染色體配對，配對結(jié)果如圖3所示。依據(jù)臂比結(jié)果將尖裸鯉染色體分為中部著絲粒染色體(m)、亞中部著絲粒染色體(sm)、亞端部著絲粒染色體(st)和端部著絲粒染色體(t)4組，每組所包含的染色體數(shù)目分別為26,28,20和18條，因此得出尖裸鯉核型公式為：26m+28sm+20st+18t，臂數(shù)(NF)=146。由表1統(tǒng)計(jì)結(jié)果可知，尖裸鯉染色體平均長度表現(xiàn)為m型>sm型>st型>t型，分別為(2.988 3±1.160 5),(2.553 9±0.542 4),(2.024 9±0.286 7)和(1.809 3±0.370 6) μm，m和sm型染色體中分別有2對及1對長度較大的染色體。

圖2 尖裸鯉染色體中期分裂相Fig.2 Metaphase chromosome of O. stewartii

表1 尖裸鯉染色體類型、絕對長度和臂比Table 1 Type,absolute length and arm ratio of O. stewartii

表1(續(xù)) ContinuedTable 1

2.3 尖裸鯉的進(jìn)化地位

統(tǒng)計(jì)已經(jīng)發(fā)表的19種(或亞種)裂腹魚亞科魚類染色體核型(表2)發(fā)現(xiàn)，尖裸鯉亞端部和端部著絲粒染色體數(shù)目平均占比為40.22%，低于齊口裂腹魚(Schizothoraxprenanti)[15]和巨須裂腹魚(Schizothoraxmacropogon)[16]等，高于骨唇黃河魚(Chuanchialabiosa)[10]、佩枯湖裸鯉(Gymnocyprisdobula)[17]和黃河裸裂尻魚(Schizopygopsispylzovi)[10]等，進(jìn)化地位在裂腹魚亞科中處于中等水平。

表2 19種(亞種)裂腹魚亞科魚類的染色體核型Table 2 Karyotypes of 19 species (subspecies) of Schizothoracinae

表2(續(xù)) ContinuedTable 2

3 討 論

3.1 尖裸鯉的染色體核型

染色體多樣性在魚類中比較常見，如分布于西遼河和洞庭湖的鯰(Silurusasotus)[20-21]，分布于洞庭湖和鄱陽湖的黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[22-23]及分布于洞庭湖和嘉陵江的大鰭鳠(Mystusmacropterus)[24-25]，在長期的地理隔離中，不同群體的遺傳信息發(fā)生改變，進(jìn)而產(chǎn)生染色體多樣性。裂腹魚亞科魚類常生存于條件惡劣、多變的高原地區(qū)，拉薩裂腹魚(Schizothoraxwaltoni)、異齒裂腹魚(Schizothoraxoconnori)以及拉薩裸裂尻魚指名亞種(Schizothoraxyounghusbandiiyounghusban-dii)[9,16]的不同群體也存在染色體多樣性，以便更好地適應(yīng)各自不同的生存環(huán)境。迄今為止，只有兩位學(xué)者對尖裸鯉核型有過報道，余先覺等[9]于1989年首先報道了尖裸鯉2n=92，臂數(shù)(NF)=148，核型為26m+30sm+22st+14t；余祥勇等[10]于1990年發(fā)表了該結(jié)果的核型圖譜。本研究得出的尖裸鯉染色體數(shù)目與兩位學(xué)者所報道的結(jié)果契合，均為2n=92，但染色體分組結(jié)果和臂數(shù)略有差異。原因可能是由于早期拍照圖片不清晰導(dǎo)致的測量誤差，使臂比的統(tǒng)計(jì)結(jié)果出現(xiàn)偏差，從而影響了染色體的分組結(jié)果；也可能是本研究采集的尖裸鯉親本在地域或遺傳因素的影響下，染色體核型發(fā)生了改變。

3.2 尖裸鯉的進(jìn)化地位

染色體與魚類的演化程度具有一致性[23]，小島吉雄[14]認(rèn)為魚類進(jìn)化越高等，其染色體越收斂，表現(xiàn)為中部和亞中部著絲粒染色體數(shù)目趨于減少，而亞端部和端部著絲粒染色體數(shù)目趨于增多，比較顯示尖裸鯉進(jìn)化地位處于裂腹魚亞科中等水平。李樹深等[26]研究認(rèn)為，不同魚類在同一分類階元下，具有較多中部和亞中部著絲粒染色體的種類是特化類群；具有較多亞端部和端部著絲粒染色體的種類是原始類群。在分類階元限定為裂腹魚亞科的情況下，尖裸鯉中部和亞中部著絲粒染色體平均占比較高，與裸鯉屬4種魚類處于同一水平，高于裂腹魚屬的8種魚類，表明其與裸鯉屬魚類相同，均屬于高度特化等級，這與曹文宣等[3]通過表觀形態(tài)劃分的特化等級結(jié)果相符，也從細(xì)胞遺傳學(xué)角度為其論斷提供了依據(jù)。根據(jù)尖裸鯉的染色體核型，推測其進(jìn)化過程可能是裂腹魚亞科中某一原始類群在演化過程中端部和亞端部著絲粒染色體通過著絲點(diǎn)融合方式[27]，導(dǎo)致中部和亞中部著絲粒染色體占比增加，進(jìn)而演化形成現(xiàn)存的尖裸鯉，這一演化機(jī)制也在對大鱗鲃(Barbuscapito)[12]和何氏細(xì)鲃(Leptobarbushoeveni)[28]的研究中得到了證實(shí)。