張 偉，范士龍，韋麗婷，蘆 星，王金明，李思媛，呼爾查， 馬 英，張夢圓，宋瑞其，張 楊，巴音查汗，劉丹丹

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830052)

馬泰勒蟲(Theileriaequi)是一種哺乳動物胞內(nèi)寄生的血液原蟲，屬于頂復(fù)門梨形蟲目(Piroplasmida)[1-2]，寄生于馬、驢、騾、斑馬等馬屬動物的紅細胞和單核巨噬系統(tǒng)的細胞內(nèi)，由蜱傳播[3-4]。該病以高熱稽留、貧血、黃疸、淋巴結(jié)腫大等為主要臨床癥狀，急性病例多導(dǎo)致流產(chǎn)和死亡[5]。由于媒介蜱的廣泛存在，馬泰勒蟲病的發(fā)病率不斷上升，流行區(qū)域也不斷擴大，嚴(yán)重制約了馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[6]。目前對于該病的防治，主要以藥物治療為主，但不能有效預(yù)防該病的感染。病原對宿主細胞的入侵是建立感染體系的重要步驟[7]，因此能否有效阻斷馬泰勒蟲對宿主細胞的入侵，是預(yù)防該病感染的關(guān)鍵。

關(guān)于馬泰勒蟲所屬頂復(fù)門原蟲入侵宿主細胞的機制，在對弓形蟲(Toxoplasma)和瘧原蟲(Plasmodium)棒狀體頸部蛋白(rhoptry neck proteins,RONs)的研究中，通過電鏡觀察、免疫熒光和免疫共沉淀等方法，證實了 RON2 蛋白能夠與其他入侵蛋白發(fā)生特異結(jié)合，進而參與蟲體入侵宿主細胞的過程[8]。RONs由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體加工合成后轉(zhuǎn)運至棒狀體內(nèi)儲存，受Ca2+信號刺激后，在棒狀體的頸部經(jīng)蛋白酶水解加工后分泌到細胞外，包括RON1～RON8[9-11]。其中RON2可與微線體分泌的頂膜抗原1(AMA1)共同作用形成“運動結(jié)合體(moving juction,MJ)”[12]，并與宿主細胞發(fā)生黏附作用，蟲體隨之進入宿主細胞后形成納蟲空泡，完成入侵過程[11,13]。在梨形蟲中，目前大部分研究只針對RON2基因進行序列分析[14]，僅在分歧巴貝斯蟲(Babesiadivergens)中驗證了RON2蛋白與AMA1蛋白互作，并參與了蟲體的入侵過程[15]；此外在東方巴貝斯蟲(Babesiaorientalis)中成功構(gòu)建了RON2重組蛋白，并通過Far-western 試驗，證明重組RON2 蛋白可以和全蟲抗原中天然狀態(tài)下的 AMA1蛋白相互作用[16]。但是，關(guān)于馬泰勒蟲RON2蛋白的研究目前尚未見報道。

為了探究馬泰勒蟲RON2基因編碼蛋白的功能和結(jié)構(gòu)，本試驗以馬泰勒蟲美國WA株基因組數(shù)據(jù)為模板，與頂復(fù)門原蟲RON2基因本地數(shù)據(jù)庫進行BLAST比對，設(shè)計特異引物分別從供試馬泰勒蟲新疆株基因組DNA和cDNA中擴增RON2基因序列，并以RON2基因序列為分子標(biāo)記對頂復(fù)門原蟲的遺傳進化關(guān)系進行分析，構(gòu)建原核重組質(zhì)粒，進行原核表達，最后利用生物信息學(xué)技術(shù)對其進行蛋白結(jié)構(gòu)分析及互作蛋白預(yù)測，以期為進一步研究新疆馬泰勒蟲RON2基因在蟲體入侵宿主細胞中的功能和作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

馬泰勒蟲(新疆塔城株)陽性馬匹抗凝全血，采集于新疆塔城地區(qū)。

pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、DL8000/2000 DNA Marker、Prime Script lst Strand cDNA Synthesis Kit、LA Taq、Trizol通用型RNA快速提取試劑盒，均購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒，均購自O(shè)mega Bio-Tek公司；基因組DNA提取試劑盒Gentra Puregene DNA Purification Kit，購自QIAGEN公司。

1.2 引物合成與設(shè)計

以GenBank中公布的馬泰勒蟲美國WA株(Theileriaequistrain WA，XM004830215.1)RON2基因序列為模板，BLAST比對東方泰勒蟲(Theileriaorientalis，XM009690549.1)、環(huán)形泰勒蟲(Theileriaannulata,XM949595.1)、小泰勒蟲 (Theileriaparva,XM760448.1)RON2基因組數(shù)據(jù)，以獲得的RON2保守基因序列為模板，用Pri-mer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物(表1)，送武漢生工生物工程公司合成。

表1 本研究所用引物信息Table 1 Information of primers used in this study

1.3 RON2基因的克隆

按試劑盒說明從馬泰勒蟲陽性全血中分別提取基因組DNA和RNA，以提取的總RNA為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA。以基因組DNA和cDNA為模板，進行PCR擴增；將PCR產(chǎn)物純化回收后按試劑盒說明連接至pMD19-T載體，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。挑取陽性菌落，經(jīng)PCR鑒定，將陽性轉(zhuǎn)化子送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 RON2基因序列比對和系統(tǒng)發(fā)生樹的構(gòu)建

利用MEGA 7.0軟件分析RON2基因的核苷酸序列和氨基酸序列，構(gòu)建Maximum Parsimany(MP)系統(tǒng)發(fā)生樹，分析頂復(fù)門寄生蟲的分類進化關(guān)系。運用DNAStar Lasergene v7.1中Megalign軟件的Clustal W算法，分別對頂復(fù)門原蟲RON2基因的核苷酸和氨基酸序列進行相似性分析。

1.5 RON2基因截短重組蛋白的表達與純化

分別提取陽性克隆和表達載體pET-32a質(zhì)粒DNA，用EcoR Ⅰ和XhoⅠ對pET-32a質(zhì)粒和目的基因DNA進行雙酶切，將酶切后產(chǎn)物連接，轉(zhuǎn)化到E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細胞內(nèi)，進行PCR和酶切鑒定。將鑒定為陽性的菌液送往生工生物工程(上海)股份公司測序。將測序正確的重組菌100 μL接種到10 mL Amp/LB培養(yǎng)基內(nèi)于37 ℃培養(yǎng)，待細菌OD值達到0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進行誘導(dǎo)表達，分別在誘導(dǎo)0，1，2，3，4，5，6 h取1 mL菌液留樣；將經(jīng)誘導(dǎo)表達的菌液12 000 r/min離心2 min，棄上清液，制樣進行SDS-PAGE分析。

將測序正確的重組菌1 mL接種到100 mL Amp/LB培養(yǎng)基內(nèi)于37 ℃ 培養(yǎng)，待細菌OD值達到0.6時，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體并超聲破碎，取包涵體沉淀，使用 His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化His-RON2融合蛋白，操作步驟按照試劑盒說明書進行，最后收集流穿液、洗滌液、洗脫液進行 SDS-PAGE，分析純化效果。

1.6 RON2蛋白編碼蛋白的預(yù)測與分析

利用ProtParam(http://au.expasy.org)在線分析RON2蛋白的物理和化學(xué)性質(zhì)(包括相對分子質(zhì)量、等電點等)，利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)程序分析RON2的親疏水性，運用SOSUI(http://bp.nuap.nagoya-u.ac.jp/sosui/)程序分析RON2蛋白的可溶性，使用TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)軟件分析RON2蛋白跨膜區(qū)，使用Bcepred軟件和DNASTAR的Protean分析RON2蛋白的親疏水性、柔韌性和表面可及性，用SOPMA(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/)和PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)分析二級結(jié)構(gòu)，利用SSWISS-MODEL(https://swissmode-l.ex-pasy.org/interactive)分析RON2的三級結(jié)構(gòu)，利用CLUSTAL W和Jalview 2.0軟件分析三級結(jié)構(gòu)的氨基酸序列，運用DNASTAR軟件中的Jameson-Wolf方法預(yù)測RON2蛋白的B細胞抗原表位，利用Net-Phose3.1 Server和Net-NGIyc1.0 Server在線軟件預(yù)測RON2蛋白的磷酸化位點和糖基化位點，利用STRING(https://string-db.org/cgi/network)數(shù)據(jù)庫分析RON2蛋白的相互作用關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬泰勒蟲新疆株RON2基因的克隆結(jié)果

PCR結(jié)果顯示，從馬泰勒蟲新疆株基因組DNA中均擴增出一條約3 920 bp的目的片段(圖1-A)。用3對引物分段擴增馬泰勒蟲新疆株基因組cDNA，分別獲得約為1 500，1 400和2 000 bp的3個目的片段(圖1-B)。將3個片段測序并拼接，發(fā)現(xiàn)與基因組DNA擴增獲得的序列相一致，表明馬泰勒蟲新疆株RON2基因具有完整的開放閱讀框(3 920 bp)。pMD19-T-RON2菌液PCR結(jié)果顯示，在3 920 bp處出現(xiàn)了目的片段(圖1-C)。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析顯示，基因序列與基因組DNA和cDNA的PCR擴增結(jié)果一致，表明成功構(gòu)建了pMD19-T-RON2克隆載體，序列信息已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫，NCBI基因登錄號為MT939257。

A.基因組DNA的PCR擴增；B.RON2基因組cDNA的PCR擴增:3-4.RON2基因5′端， 5-6.中段擴增，7-8.RON2基因3′端；C.pMD-19-T-RON2菌液PCR擴增結(jié)果；M.DNA MarkerA.PCR amplification of genomic DNA;B.PCR amplification of RON2 genomic cDNA:3-4.The 5′ end of RON2 gene， 5-6.Midcourse amplification，7-8.The 3′end of RON2 gene;C.PCR amplification of pMD19-T-RON2 bacterial fluid；M.DNA Marker

2.2 RON2基因序列比對及系統(tǒng)發(fā)生樹

利用MEGA 7.0軟件，以頂復(fù)門原蟲RON2基因為分子標(biāo)記，分別以核苷酸序列和氨基酸序列構(gòu)建MP系統(tǒng)發(fā)生樹，結(jié)果(圖2和圖3)均顯示，不同屬原蟲被分為5個分支；在進化關(guān)系上，巴貝斯蟲屬和泰勒蟲屬較為接近，同屬于梨形蟲范疇，馬泰勒蟲新疆株屬于泰勒蟲屬，與馬泰勒蟲美國WA株位于同一分支。

圖2 基于RON2核苷酸序列構(gòu)建的頂復(fù)門原蟲系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.2 Phylogenetic tree of apolitophyta based on RON2 nucleotide sequences

圖3 基于RON2氨基酸序列構(gòu)建的頂復(fù)門原蟲系統(tǒng)發(fā)生樹Fig.3 Phylogenetic tree of apolitophyta based on RON2 amino acid sequences

對馬泰勒蟲新疆株RON2基因及GenBank中公布的頂復(fù)門原蟲RON2同源基因序列進行相似性分析，結(jié)果(表2)顯示，馬泰勒蟲新疆株與13種頂復(fù)門原蟲RON2基因的核苷酸和氨基酸序列相似性分別為31.2%～82.7%和23.8%～79.5%，與泰勒蟲屬中的環(huán)形泰勒蟲、小泰勒蟲、東方泰勒蟲、馬泰勒蟲美國WA株RON2基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為63.5%～82.7%和48.9%～79.5%，與巴貝斯蟲屬中的分歧巴貝斯蟲、牛巴貝斯蟲、莫氏巴貝斯蟲、羊巴貝斯蟲未定種RON2基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別為57.6%～66.3%和44.8%～54.1%。其中與馬泰勒蟲美國WA株核苷酸、氨基酸序列的相似性最高，分別為82.7%和79.5%；與約氏瘧原蟲(Plasmodiumyoelii)核苷酸、氨基酸相似性最低，分別為31.2%和23.8%。

表2 14種頂復(fù)門原蟲RON2基因核苷酸和氨基酸序列的相似性分析Table 2 Similarity analysis of nucleotide and amino acid sequences of RON2 gene of 14 protozoa %

2.3 RON2融合蛋白的表達與純化

SDS-PAGE 分析結(jié)果(圖4-A)顯示，以終濃度1 mmol/L IPTG于37 ℃誘導(dǎo)重組菌液4 h時，蛋白表達量最高，誘導(dǎo)后的表達產(chǎn)物大小約26 ku。經(jīng)過超聲破碎、離心后分別收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE檢測，結(jié)果(圖4-B)顯示重組蛋白主要存在于沉淀中，為包涵體蛋白，使用His標(biāo)簽試劑盒對包涵體純化的效果良好。

A.His-RON2誘導(dǎo)時間優(yōu)化：1.未誘導(dǎo),2～7.分別為誘導(dǎo)1，2，3，4，5，6 h； B.His-RON2可溶性與純化：1.未誘導(dǎo)，2.破碎后沉淀，3.破碎后上清，4.沉淀純化，M.120 ku 蛋白 MarkerA.Induction time of His-RON2 was optimized：1.No induction,2-7.Induced for 1,2,3,4,5 and 6 h,respectively; B.His-RON2 solubility and purification:1.No induction,2.Precipitation after crushing,3.Supernatant after crushing, 4.Precipitation purification,M.120 ku protein Marker

2.4 RON2基因編碼蛋白的生物信息學(xué)分析

2.4.1 理化性質(zhì) 利用在線軟件ProtParam對馬泰勒蟲RON2蛋白的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明RON2蛋白由1 305個氨基酸組成，包含20種氨基酸，分子式為C6637H10423N1807O1944S49，分子質(zhì)量為148 206.65 u。RON2蛋白含有負電荷氨基酸殘基數(shù)(Asp+Glu) 144個，正電荷氨基酸殘基 (Arg+Lys) 177個(表3)，理論等電點為9.27，脂肪族氨基酸指數(shù)為81.10，總平均親水性為-0.403(負值代表親水性，正值代表疏水性)，不穩(wěn)定指數(shù)為41.08，屬于不穩(wěn)定蛋白。

表3 RON2蛋白的氨基酸分析Table 3 Amino acid analysis of RON2 protein

2.4.2 疏水性和可溶性 利用ProtScale在線工具使用Hphob./Kyte & Doolittle算法預(yù)測表明，在RON2蛋白中，親水性氨基酸均有分布，在第1 090位氨基酸處疏水值最大，為2.333；第31-32位氨基酸處疏水值最小，為-3.811(圖5)。利用SOSUI在線軟件，預(yù)測RON2蛋白的平均疏水性為-0.402，與ProtParam的預(yù)測結(jié)果一致，顯示該蛋白屬于可溶性蛋白。

圖5 RON2蛋白親疏水性分析Fig.5 Hydrophilic and hydrophobic analysis of RON2

2.4.3 跨膜區(qū) 利用TMHMM程序分析可知，RON2蛋白有1個跨膜區(qū)，位于1 201-1 223氨基酸處，與該蛋白的ProtScale疏水性區(qū)域預(yù)測結(jié)果基本一致，表明RON2蛋白可能屬于跨膜蛋白。

2.4.4 親疏水性、表面可及性和柔韌性 利用Bcepred程序分析發(fā)現(xiàn)，RON2蛋白共含有27個親水性參數(shù)得分1.5以上的區(qū)域，35個柔韌性參數(shù)得分1.2以上的區(qū)域，26個表面可及性參數(shù)得分1.4以上的區(qū)域。與采用DNASTAR的Protean對RON2親疏水性、柔韌性和表面可及性的分析結(jié)果一致。

2.4.5 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用SOPMA程序分析發(fā)現(xiàn)，RON2蛋白的α螺旋有761個氨基酸(占58.31%)，延伸鏈有115個氨基酸(占8.81%)，β轉(zhuǎn)角有58個氨基酸(占4.4%)，無規(guī)則卷曲有371個氨基酸(占28.43%)。用PSIPRED在線軟件分析的結(jié)果與SOPMA一致。

2.4.6 三級結(jié)構(gòu)預(yù)測 利用ExPASY提供的SWISS-MODEL軟件預(yù)測馬泰勒蟲RON2蛋白的三級結(jié)構(gòu)，同源建模結(jié)果表明，該蛋白的部分三級結(jié)構(gòu)與其他頂復(fù)門原蟲RON2蛋白的部分三級結(jié)構(gòu)相似，其中與惡性瘧原蟲相似性最高，具有類似的空間結(jié)構(gòu)[17](圖6-A)。對預(yù)測出的部分三級結(jié)構(gòu)氨基酸序列，利用CLUSTAL W和Jalview 2.0軟件對其同源序列進行進一步分析，結(jié)果表明馬泰勒蟲RON2蛋白該部分不僅在三級結(jié)構(gòu)與其他頂復(fù)門原蟲具有相似性，在氨基酸一級結(jié)構(gòu)上也具有高度的保守性，均含有1對半胱氨酸(圖6-B)。

A.馬泰勒蟲與惡性瘧原蟲RON2蛋白部分三級結(jié)構(gòu)的比較，馬泰勒蟲新疆株RON2為淺藍色，惡性瘧原蟲RON2為綠色； B.頂復(fù)門原蟲RON2蛋白部分氨基酸序列對比A.Comparison of tertiary structure of RON2 protein between Theileria equi Xinjiang strain (light blue) and Plasmodium falciparum (green);B.Amino acid sequence analysis of RON2 protein of protozoan acromion圖6 馬泰勒蟲新疆株RON2蛋白部分三級結(jié)構(gòu)及其三級結(jié)構(gòu)氨基酸序列對比Fig.6 Comparison of partial tertiary structure and amino acid sequence of RON2 protein of Theileria equi Xinjiang strain

2.4.7 B細胞抗原表位預(yù)測 利用DNASTAR軟件中的Jameson-Wolf抗原指數(shù)算法預(yù)測結(jié)果顯示，RON2含有38個B細胞抗原表位，其中平均值為0.479，最小值0.175，最大值0.672，預(yù)測得分0.6以上的有7個氨基酸區(qū)域(5-95，138-178，188-245，377-397，360-393，417-434，463-503)。

2.4.8 磷酸化位點和糖基化位點預(yù)測 利用Net-Phose3.1 Server在線軟件預(yù)測RON2蛋白的磷酸化位點，結(jié)果顯示,當(dāng)潛在磷酸化位點閾值為0.5時，RON2蛋白存在132個潛在的磷酸化位點，包括78個絲氨酸(Ser)位點、20個蘇氨酸(Thr)位點和34個酪氨酸(Tyr)位點。采用Net-NGIyc1.0 Ser-ver預(yù)測RON2蛋白的糖基化位點，發(fā)現(xiàn)其含有6個糖基化位點。

2.4.9 相互作用關(guān)系預(yù)測 利用STRING在線軟件預(yù)測RON2蛋白的相互作用關(guān)系，結(jié)果(圖7)顯示該蛋白與AMA1、RON1、RON2、RON4和RON6等蛋白存在相互作用關(guān)系，說明可能與這些蛋白共同發(fā)揮著類似的功能。

圖7 RON2蛋白相互作用關(guān)系預(yù)測Fig.7 Prediction of RON2 protein interactions

3 討 論

瘧原蟲(Plasmodium)、隱孢子蟲(Cryptosporidium)、弓形蟲(Toxoplasma)、艾美耳球蟲(Eimeria)、新孢子蟲(Neospora)、泰勒蟲(Theileria)和巴貝斯蟲(Babesia)等均屬于頂復(fù)門原蟲，寄生于人與動物的組織器官中，對宿主的生命健康有巨大的威脅[17]。頂復(fù)門原蟲具有相似的分泌細胞器，棒狀體是頂復(fù)門原蟲最為重要的分泌細胞器之一[18]。Cao等[19]首次在弓形蟲和瘧原蟲中發(fā)現(xiàn)，RON2參與了蟲體對宿主的入侵過程。戚南山[20]最早在柔嫩艾美耳球蟲中發(fā)現(xiàn)了RON2基因，且EtRON2在未孢子化卵囊中轉(zhuǎn)錄水平最高，其功能可能是為子孢子階段的入侵分泌蛋白。王旭[21]利用酵母雙雜交、免疫共沉淀、GST-pull down、雙分子熒光等技術(shù)驗證了EtRON2與EtAMA1之間的相互作用，證明阻斷兩者相互作用后，可以對子孢子的入侵有一定抑制作用。研究人員通過小鼠和山羊免疫試驗，證明新孢子蟲AMA1與RON2蛋白具有較好的免疫保護性，可有效降低感染率[22]。但是對于馬泰勒蟲RON2蛋白是否參與入侵過程尚未見報道。

為了了解馬泰勒蟲RON2蛋白在入侵過程中的作用，本試驗以馬泰勒蟲新疆株RON2基因序列(NCBI基因登錄號MT939257)為材料進行分析，由于該基因無內(nèi)含子，因此截取跨膜區(qū)胞內(nèi)部分序列構(gòu)建pET-32a-RON2融合重組蛋白，最終成功得到分子質(zhì)量約為26 ku的重組蛋白，為包涵體蛋白，該蛋白與Malobi等[23]在東方巴貝斯蟲中構(gòu)建的His-RON2融合重組蛋白可溶性相似。但黃源[16]構(gòu)建的GST-RON2融合重組蛋白在上清中表達明顯，說明融合重組蛋白的標(biāo)簽不同，可能會對RON2重組蛋白的表達有較大影響。頂復(fù)門原蟲RON2基因核苷酸和氨基酸多序列比對及MP系統(tǒng)發(fā)生樹結(jié)果顯示，馬泰勒蟲新疆株與馬泰勒蟲美國WA株同源性最高，核苷酸與氨基酸序列相似度分別高達82.7%和79.5%，與泰勒蟲屬、巴貝斯蟲屬RON2基因核苷酸和氨基酸序列相似性分別高于63.5%，48.9%和57.6%，44.8%，該結(jié)果與徐建林等[14]對羊巴貝斯蟲RON2基因的研究結(jié)果基本一致。由此可見，RON2基因在頂復(fù)門原蟲中具有高度保守性，在相近種屬之間保守性更高，且蛋白結(jié)構(gòu)也具有保守性[24]，可以作為種屬鑒定的分子特征。據(jù)此推測與其他頂復(fù)門原蟲一樣，RON2蛋白在馬泰勒蟲入侵宿主細胞過程中發(fā)揮著重要作用。

馬泰勒蟲RON2蛋白是一種堿性、不穩(wěn)定親水性跨膜蛋白。在預(yù)測B細胞抗原線性表位的重要參數(shù)中，親水性被認為是抗原表位形成的重要因素[25]?？杉靶院腿犴g性反映了蛋白質(zhì)的彎曲和折疊能力，與二級結(jié)構(gòu)的形成有密切的關(guān)系[26]。本研究發(fā)現(xiàn)，RON2蛋白具有多個親水性與柔韌性區(qū)域，表明RON2蛋白具有形成抗原表位的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。通常α螺旋、β折疊因其結(jié)構(gòu)規(guī)則限制，多位于蛋白質(zhì)內(nèi)部，不易與抗體結(jié)合，而β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲多暴露在球蛋白表面，易與抗體結(jié)合，因而成為抗原表位的可能性較大[27]。本研究發(fā)現(xiàn)，RON2蛋白二級結(jié)構(gòu)中α螺旋占比較大，β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲占比較小，說明其抗原表位分布較少；RON2含有38個B細胞表位，但大多參數(shù)得分較低，表明RON2蛋白整體抗原效果較弱；RON2蛋白具有132個潛在磷酸化修飾位點，還具有跨膜功能，表明該蛋白在參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達和細胞周期的生命調(diào)節(jié)過程中有巨大的潛力。

馬泰勒蟲RON2蛋白與其他頂復(fù)門原蟲相同，都有1對半胱氨酸，并且空間結(jié)構(gòu)為“發(fā)卡樣”，在瘧原蟲和弓形蟲上均有此發(fā)現(xiàn)[17,28]。對瘧原蟲和弓形蟲的RON2蛋白研究表明，在該蛋白跨膜區(qū)有高度保守的氨基酸序列，包含1對半胱氨酸，半胱氨酸之間會形成二硫鍵，并且形成發(fā)卡樣折疊，嵌插在宿主細胞膜表面，是RON2與AMA1發(fā)生相互作用形成移動連接體的重要結(jié)構(gòu)，也是蟲體入侵宿主細胞的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[29-30]。本研究發(fā)現(xiàn)，RON2與其他入侵相關(guān)蛋白存在著相互作用關(guān)系，表明RON2可能與這些蛋白發(fā)揮類似作用，參與了蟲體對宿主細胞的侵襲[7]。上述結(jié)果表明，馬泰勒蟲RON2蛋白與瘧原蟲和弓形蟲具有相似的蛋白結(jié)構(gòu)，但在入侵宿主細胞的過程中，馬泰勒蟲RON2蛋白是否與AMA1產(chǎn)生相互作用，進而形成入侵關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，還有待驗證。

本研究獲得馬泰勒蟲新疆株棒狀體頸部蛋白RON2基因序列，并成功獲得分子質(zhì)量為26 ku的RON2融合重組蛋白。RON2基因具有較高的保守性，可以作為鑒定頂復(fù)門原蟲種屬的分子標(biāo)記；其編碼蛋白是一種堿性、不穩(wěn)定親水性跨膜蛋白，二級結(jié)構(gòu)以α螺旋為主，親水性較低，抗原性較弱，三級結(jié)構(gòu)與其他頂復(fù)門原蟲具有類似的特殊空間結(jié)構(gòu)和氨基酸序列，并與其他入侵蛋白存在相互作用關(guān)系。