陳衛(wèi)東，張玉霞,叢百明，孫明雪，夏全超，張慶昕，杜曉艷

(1內(nèi)蒙古民族大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 通遼 028041；2內(nèi)蒙古通遼市畜牧獸醫(yī)科學(xué)研究所，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

紫花苜蓿(MedicagosalivaL．)是豆科苜蓿屬多年生牧草，有“牧草之王”的美稱[1-2]，具有高產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等優(yōu)良特性及保持水土、改良土壤等作用，是目前世界各地廣泛種植的優(yōu)質(zhì)牧草[3]。近年來(lái)，在國(guó)家扶持政策和區(qū)域化農(nóng)業(yè)布局優(yōu)化調(diào)整的引導(dǎo)下，我國(guó)紫花苜蓿栽培面積突破歷史新高，達(dá)到377萬(wàn)hm2，其中科爾沁沙地的紫花苜蓿生產(chǎn)也得以快速發(fā)展，成為新興的紫花苜蓿優(yōu)勢(shì)生產(chǎn)區(qū)[4-5]。然而科爾沁沙地由于風(fēng)沙大、降水量小、冬季極端低溫、春季溫度低等因素，不能保證紫花苜蓿安全越冬[6]，這嚴(yán)重限制了紫花苜蓿在當(dāng)?shù)氐某掷m(xù)穩(wěn)定生產(chǎn)[7-9]。目前通過(guò)增施磷肥提高植物抗氧化特性使抗寒性增強(qiáng)的研究較多[10-11]，有關(guān)苜?？购芯慷嗉性诘厣喜糠值纳L(zhǎng)與生理研究方面[12-13]，而關(guān)于磷肥在低溫脅迫處理下對(duì)紫花苜蓿根頸抗氧化特性影響的報(bào)道較少[14-15]。為此，本試驗(yàn)采用大田試驗(yàn)對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行磷肥種類及其不同施用量處理，于越冬前期挖取紫花苜蓿越冬材料模擬低溫脅迫，檢測(cè)低溫脅迫下紫花苜蓿根頸的抗氧化特性及可溶性蛋白(SP)含量，分析不同磷肥處理下紫花苜蓿越冬材料在低溫脅迫下抗氧化特性的變化，明確在科爾沁沙地紫花苜蓿安全越冬的磷肥施用種類及施用量，為科爾沁沙地紫花苜?？购蕉峁├碚撘罁?jù)和技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于內(nèi)蒙古通遼市內(nèi)蒙古民族大學(xué)科技示范園區(qū)(43°36′N，122°22′E)，年平均氣溫 6.4 ℃，≥10 ℃年活動(dòng)積溫3 184 ℃，年平均日照時(shí)數(shù)3 000 h，無(wú)霜期150 d，年平均降水量379.1 mm，蒸發(fā)量是降水量的5倍，年平均風(fēng)速3～4 m/s，為典型的溫帶大陸性季風(fēng)氣候。試驗(yàn)田土壤為沙土，是新開(kāi)墾的沙化草地，0～20 cm土層土壤pH值為8.3，土壤有機(jī)質(zhì)含量6.4 g/kg，全氮含量0.36 g/kg，堿解氮含量35.37 mg/kg，速效鉀含量77.51 mg/kg，速效磷含量3.70 mg/kg。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

供試苜蓿材料為‘公農(nóng)1號(hào)’紫花苜蓿品種，種子購(gòu)自北京百斯特草業(yè)有限公司。試驗(yàn)材料于2018-07-17播種，播種量22.5 kg/hm2，條播行距15 cm，播種前撒施氯化鉀150 kg/hm2(K2O)，苜蓿生長(zhǎng)過(guò)程中適時(shí)進(jìn)行噴灌、除草、防治病蟲害等田間管理。8月20日采用溝施方式施用不同種類和不同施用量的磷肥，磷肥種類為重過(guò)磷酸鈣(P2O5含量為44%)和磷酸二銨(P2O5含量為46%)，施用量設(shè)0(對(duì)照，CK)，100，200，300，400 kg/hm25個(gè)磷肥(P2O5)施用水平。采用二因素隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)，共30個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積為4 m×5 m，四周設(shè)保護(hù)行。

于封凍期前(11月15日)取樣，挖取苜蓿越冬器官，每小區(qū)取樣50株(粗細(xì)均勻一致)，平均分成2份，其中1份置于4 ℃冰箱低溫儲(chǔ)存，另 1 份于程序式低溫處理箱模擬低溫處理。低溫處理時(shí)采用脫脂棉包裹，加水適量，再用錫紙包裹，注明編號(hào)，以0 ℃為起點(diǎn)，以4 ℃/h 的速率降溫，到達(dá)設(shè)定溫度(-20 ℃)后保持6 h，然后按照4 ℃/h 的速率升溫至4 ℃，取出置于4 ℃下保持12 h，然后進(jìn)行抗氧化生理指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

參考文獻(xiàn)[16]的方法測(cè)定生理指標(biāo)，其中丙二醛(MDA)含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸比色法，過(guò)氧化物酶(POD)活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚比色法，超氧化物歧化酶(SOD)活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑比色法，過(guò)氧化氫酶(CAT)活性測(cè)定采用紫外吸收法，可溶性蛋白(SP)含量測(cè)定采用考馬斯亮藍(lán)比色法。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，用DPS軟件進(jìn)行二因素試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 磷肥對(duì)紫花苜蓿根頸MDA含量的影響

如表1所示，在低溫冷藏(4 ℃)條件下，隨著2種磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根頸MDA含量呈先降低后升高的趨勢(shì)，均在300 kg/hm2(P2O5)處理下MDA含量最低，且顯著低于不施磷肥和施用100 kg/hm2(P2O5)處理(P<0.05)；在100，200，300 kg/hm2(P2O5)處理下，施用重過(guò)磷酸鈣的紫花苜蓿根頸MDA含量顯著低于施用磷酸二銨(P<0.05)。

低溫冷凍(-20 ℃)條件下，施用0，100，200，300，400 kg/hm2重過(guò)磷酸鈣處理的紫花苜蓿根頸MDA含量，分別較低溫冷藏(4 ℃)條件下增加了104.67%，131.67%，143.64%，23.40%和56.86%；施用0，100，200，300，400 kg/hm2磷酸二銨處理的紫花苜蓿根頸MDA含量，分別較低溫冷藏(4 ℃)條件下增加了104.67%，51.04%，70.77%，47.92%和33.93%，說(shuō)明低溫冷凍導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化嚴(yán)重。

在低溫冷凍條件下，2種磷肥不施肥處理的紫花苜蓿MDA含量顯著高于各施肥處理(P<0.05)，施用300和400 kg/hm2(P2O5)處理的MDA含量顯著低于施用100和200 kg/hm2(P2O5)處理(P<0.05)，說(shuō)明秋季施用磷肥能夠提高紫花苜蓿的抗寒性，施用量以300～400 kg/hm2(P2O5)為宜。

表1 不同磷肥種類及施用量下紫花苜蓿根頸MDA含量的變化Table 1 Changes of MDA content in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers nmol/g

2.2 磷肥對(duì)紫花苜蓿根頸SOD活性的影響

表2顯示，在低溫冷藏(4 ℃)條件下，隨著2種磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根頸SOD活性呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，均在300 kg/hm2(P2O5)處理下達(dá)到最強(qiáng)，且顯著高于其他處理(P<0.05)；在100，200，300，400 kg/hm2(P2O5)處理下，施用重過(guò)磷酸鈣的紫花苜蓿根頸SOD活性顯著高于施用磷酸二銨(P<0.05)。

在低溫冷凍(-20 ℃)條件下，施用0，100，200，300，400 kg/hm2重過(guò)磷酸鈣處理的紫花苜蓿根頸SOD活性，分別較低溫冷藏(4 ℃)條件下增加了12.71%，8.99%，12.43%，29.26%和25.30%；施用0，100，200，300，400 kg/hm2磷酸二銨處理的紫花苜蓿根頸SOD活性，分別較低溫冷藏(4 ℃)條件下增加了12.71%，5.64%，9.07%，34.12%和73.69%，說(shuō)明低溫冷凍導(dǎo)致活性氧大量產(chǎn)生，紫花苜蓿根頸通過(guò)增強(qiáng)SOD活性清除活性氧。

在低溫冷凍條件下，施用100～300 kg/hm2重過(guò)磷酸鈣處理的紫花苜蓿根頸SOD活性，顯著高于對(duì)應(yīng)的磷酸二銨處理(P<0.05)；在2種磷肥處理下，200～400 kg/hm2(P2O5)處理紫花苜蓿根頸SOD活性顯著高于不施磷肥處理(P<0.05)。說(shuō)明秋季施用磷肥能夠提高低溫冷凍條件下紫花苜蓿的SOD活性，且重過(guò)磷酸鈣的作用強(qiáng)于磷酸二銨，施用量為300 kg/hm2(P2O5)時(shí)SOD活性最強(qiáng)。

表2 不同磷肥種類及施用量下紫花苜蓿根頸SOD活性的變化Table 2 Changes of SOD activity in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers U/g

2.3 磷肥對(duì)紫花苜蓿根頸POD活性的影響

表3顯示，在低溫冷藏(4 ℃)條件下，隨著2種磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根頸POD活性呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，均在300 kg/hm2(P2O5)處理下達(dá)到最強(qiáng)，且顯著高于其他處理(P<0.05)；在施用100，200，300，400 kg/hm2(P2O5)處理下，施用重過(guò)磷酸鈣的紫花苜蓿根頸SOD活性顯著高于施用磷酸二銨(P<0.05)。

表3 不同磷肥種類及施用量下紫花苜蓿根頸POD活性的變化Table 3 Changes of POD activity in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers U/(min·g)

在低溫冷凍(-20 ℃)條件下，各施肥處理的紫花苜蓿根頸POD活性較低溫冷藏處理增強(qiáng)，說(shuō)明低溫冷凍導(dǎo)致過(guò)氧化物大量產(chǎn)生，紫花苜蓿通過(guò)增強(qiáng)POD活性提高抗氧化特性。

在低溫冷凍條件下，施用200～400 kg/hm2重過(guò)磷酸鈣處理的紫花苜蓿根頸POD活性,顯著高于相同施用量的磷酸二銨處理(P<0.05)；在2種磷肥處理下，施用100，200，300，400 kg/hm2處理的紫花苜蓿根頸POD活性顯著高于不施肥處理(P<0.05)，施用300 kg/hm2(P2O5)處理的紫花苜蓿根頸POD活性顯著高于其他處理(P<0.05)。說(shuō)明秋季施用磷肥能夠提高苜蓿在低溫冷凍條件下的POD活性，且施用重過(guò)磷酸鈣的效果優(yōu)于磷酸二銨，施用量以300 kg/hm2(P2O5)下POD活性最強(qiáng)。

2.4 磷肥對(duì)紫花苜蓿根頸CAT活性的影響

由表4可見(jiàn)，在低溫冷藏(4 ℃)條件下，隨著2種磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根頸CAT活性呈先增強(qiáng)后減弱的趨勢(shì)，在300 kg/hm2(P2O5)處理下紫花苜蓿根頸CAT活性最強(qiáng)，且顯著高于除400 kg/hm2(P2O5)處理外的其他處理(P<0.05)；在施用300 和400 kg/hm2(P2O5)處理下，施用重過(guò)磷酸鈣的紫花苜蓿根頸CAT活性顯著高于施用磷酸二銨(P<0.05)。

在低溫冷凍(-20 ℃)條件下， 0，100，200，300 kg/hm2重過(guò)磷酸鈣處理紫花苜蓿根頸CAT活性，分別較低溫冷藏(4 ℃)條件下增加22.23%，23.78%，8.20%和8.16%；0，100，200，300，400 kg/hm2磷酸二銨處理紫花苜蓿根頸CAT活性，分別較低溫冷藏(4 ℃)條件下增加22.23%，27.18%，13.32%，11.50%和16.21%，說(shuō)明低溫冷凍導(dǎo)致CAT大量產(chǎn)生，苜蓿通過(guò)增強(qiáng)CAT活性來(lái)提高抗氧化能力。

在低溫冷凍條件下，100，200，300，400 kg/hm2磷肥處理的紫花苜蓿根頸CAT活性顯著高于不施肥處理(P<0.05)，施用300 kg/hm2處理顯著高于其他處理(除磷酸二銨的400 kg/hm2處理外)(P<0.05)，說(shuō)明秋季施用磷肥能夠提高苜蓿在低溫冷凍條件下的CAT活性，施用量以300 kg/hm2下CAT活性最強(qiáng)。

表4 不同磷肥種類及施用量下紫花苜蓿根頸CAT活性的變化Table 4 Changes of POD activity in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers U/(min·g)

2.5 磷肥對(duì)紫花苜蓿根頸SP含量的影響

表5顯示，在低溫冷藏(4 ℃)條件下，隨著2種磷肥施用量的增加，紫花苜蓿根頸SP含量呈先升高后降低的趨勢(shì)，均以300 kg/hm2(P2O5)處理紫花苜蓿根頸SP含量最高，且顯著高于其他處理(P<0.05)；在施用300和400 kg/hm2(P2O5)處理下，施用重過(guò)磷酸鈣的紫花苜蓿根頸SP含量顯著高于施用磷酸二銨處理(P<0.05)。

在低溫冷凍(-20 ℃)條件下，0，100，200，300，400 kg/hm2重過(guò)磷酸鈣處理紫花苜蓿根頸SP含量,分別較低溫冷藏(4 ℃)條件下增加20.91%，2.97%，20.12%，6.56%和12.84%;0，100，200，300，400 kg/hm2磷酸二銨處理紫花苜蓿根頸SP含量,分別較低溫冷藏(4 ℃)條件下增加20.91%，16.44%，27.75%，7.38%和20.11%，說(shuō)明低溫冷凍下苜蓿通過(guò)提高SP含量增強(qiáng)抗寒性。

在冷凍條件下，施用100，200，300，400 kg/hm2(P2O5)處理(除100 kg/hm2重過(guò)磷酸鈣處理外)的紫花苜蓿根頸SP含量顯著高于不施肥處理(P<0.05)，且2種肥料均以300 kg/hm2(P2O5)處理的SP含量最高，說(shuō)明秋季施用磷肥能夠提高苜蓿在低溫冷凍條件下的SP含量，施用量以300 kg/hm2(P2O5)效果最好。

表5 不同磷肥種類及施用量下紫花苜蓿根頸SP含量的變化Table 5 Changes of SP content in alfalfa rhizomes under different types and application rates of phosphate fertilizers mg/g

2.6 紫花苜蓿根頸MDA含量與抗氧化酶活性及SP含量的相關(guān)性

表6顯示，在低溫冷藏(4 ℃)條件下，重過(guò)磷酸鈣處理的紫花苜蓿根頸MDA含量與POD活性、SP含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)；磷酸二銨處理的紫花苜蓿根頸MDA含量與CAT活性、SP含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與POD、SOD活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。在-20 ℃低溫冷凍條件下，重過(guò)磷酸鈣處理的紫花苜蓿根頸MDA含量與CAT活性、SP含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與POD、SOD活性呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)；磷酸二銨處理的紫花苜蓿根頸MDA含量與POD、SOD活性呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與CAT活性、SP含量呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)。表明POD、SOD、CAT活性及SP含量越高，MDA含量越低，紫花苜蓿根頸受傷程度越輕，磷肥能夠提高苜蓿在低溫冷凍條件下的抗氧化酶活性，抑制膜脂過(guò)氧化，提高苜蓿抗寒性。

表6 紫花苜蓿根頸中MDA含量與抗氧化酶活性及SP含量的相關(guān)性Table 6 Correlation between MDA and antioxidant enzyme activities and SP content in alfalfa root neck

3 討 論

苜蓿根頸是豆科牧草重要的營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸器官，其受傷害程度直接影響牧草抗寒能力的強(qiáng)弱[17-18]。MDA是膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物之一，其含量反映了脂質(zhì)過(guò)氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)受傷害程度及對(duì)逆境環(huán)境的響應(yīng)程度，是逆境生理中的一個(gè)重要指標(biāo)[19-20]。李婷等[15]研究表明，隨著低溫脅迫的逐漸增強(qiáng)，紫花苜蓿根頸中的MDA含量有增加趨勢(shì)，導(dǎo)致其含量增加的最主要原因是：隨著溫度的下降，紫花苜蓿根頸受到傷害，導(dǎo)致膜脂過(guò)氧化加重，細(xì)胞膜受到損傷，膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量升高。本研究結(jié)果表明，與低溫冷藏相比，低溫冷凍條件下紫花苜蓿MDA含量升高，施磷肥處理紫花苜蓿根頸MDA含量顯著低于不施磷肥處理(P<0.05)，且在300 kg/hm2(P2O5)處理下MDA含量最低。說(shuō)明在科爾沁地區(qū)秋季施用磷肥有利于降低苜蓿根頸受傷害程度，對(duì)苜蓿安全越冬起到促進(jìn)作用。

SOD、POD、CAT是植物體內(nèi)重要的抗氧化酶和細(xì)胞膜保護(hù)酶系統(tǒng)，逆境條件下這些保護(hù)酶能夠及時(shí)清除植物體內(nèi)多余的氧自由基，保護(hù)細(xì)胞膜盡可能少受外界低溫破壞，從而增強(qiáng)植物的抗寒性[21]。李婷等[15]研究表明，在封凍期(11月20日以后)隨著磷肥用量增加，紫花苜蓿根頸抗氧化酶活性呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，認(rèn)為秋季施用過(guò)量磷肥會(huì)降低紫花苜蓿根頸的抗寒能力，在施用重過(guò)磷酸鈣159.1 kg/hm2(P2O5)時(shí)抗氧化酶活性最強(qiáng)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著磷肥用量的增加，低溫冷藏與低溫冷凍條件下紫花苜蓿根頸抗氧化酶活性均呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在施用重過(guò)磷酸鈣300 kg/hm2(P2O5)時(shí)抗氧化酶活性最強(qiáng)，這與李婷等[15]所得結(jié)果不同，出現(xiàn)這種差異的原因是本試驗(yàn)沒(méi)有將磷肥作為種肥施入。侯立剛等[22]研究表明，低溫脅迫下，水稻葉片抗氧化酶活性明顯升高，適當(dāng)增磷后，水稻葉片的抗氧化酶活性均高于未施磷處理；隨著施磷量增加，水稻葉片抗氧化酶活性上升幅度明顯增加，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同，說(shuō)明施磷可以增強(qiáng)苜蓿低溫脅迫下清除活性氧的能力。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紫花苜蓿秋季施用300 kg/hm2磷肥的處理，在低溫脅迫下根頸SOD、POD和CAT活性最高，清除活性氧能力最強(qiáng)，且施用重過(guò)磷酸鈣的效果優(yōu)于施用磷酸二銨。

可溶性蛋白(SP)是重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物通過(guò)滲透調(diào)節(jié)作用積累有機(jī)酸、糖類和蛋白等小分子有機(jī)物，使低溫條件下細(xì)胞維持一定的膨壓，減少細(xì)胞水分的流失, 避免因結(jié)冰引起的傷害[23-25]?？乱暗萚26]研究表明，隨著施磷量的增加，甘蔗葉片中SP含量呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，導(dǎo)致這種變化的原因是，適當(dāng)使用磷肥可以促進(jìn)甘蔗葉片保持良好的滲透調(diào)節(jié)作用，而過(guò)量施用磷肥會(huì)對(duì)SP含量產(chǎn)生抑制作用，前人在對(duì)馬尾松[27]、小麥[28]、大蒜[29]的研究中也得到了同樣的結(jié)果，這與本試驗(yàn)結(jié)果相同，即在低溫冷藏與低溫冷凍條件下，增施磷肥的各處理紫花苜蓿根頸SP含量均升高，在施用重過(guò)磷酸鈣300 kg/hm2(P2O5)時(shí)SP含量最高。

4 結(jié) 論

重過(guò)磷酸鈣通過(guò)增強(qiáng)低溫馴化期紫花苜蓿根頸POD活性和SP含量，極顯著提高冷凍處理下紫花苜蓿根頸的SOD、POD活性及顯著提高CAT活性和SP含量，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)活性氧的清除，提高紫花苜蓿的抗氧化和滲透調(diào)節(jié)能力；磷酸二銨則通過(guò)極顯著提高低溫馴化期及冷凍期紫花苜蓿根頸CAT活性和SP含量、顯著提高SOD和POD活性，從而提高紫花苜蓿的抗氧化能力，降低MDA含量，增強(qiáng)滲透調(diào)節(jié)能力，提高苜蓿抗寒性。增施磷肥可提高苜蓿的抗寒性，其中重過(guò)磷酸鈣對(duì)苜?？购缘脑鰪?qiáng)效果優(yōu)于磷酸二銨，以300 kg/hm2(P2O5)處理效果最佳。