崔 靜 王志城 張新雨 柯會鋒 吳立強 王省芬 張桂寅 馬峙英 張 艷

華北作物改良與調(diào)控國家重點實驗室 / 河北省棉花產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 / 河北農(nóng)業(yè)大學, 河北保定 071001

棉花(Gossypiumspp.)是世界上重要的經(jīng)濟作物,我國是棉花生產(chǎn)、消費、紡織品出口大國, 然而我國棉花生產(chǎn)面臨黃萎病危害依然嚴重, 近年來新疆棉區(qū)發(fā)病面積迅速擴大, 危害日益加重, 因此對抗病品種的需求是生產(chǎn)上解決棉花抗黃萎病的根本。為了提升我國棉花在國際市場的競爭力, 棉花機械化的不斷推進以促進植棉節(jié)本增效, 然而棉花播種覆蓋的地膜成為機采過程中的嚴重白色污染, 造成棉花品質(zhì)大幅下降, 為了從根本上緩解這一矛盾,早熟棉的培育與應(yīng)用顯得尤為重要。因此, 抗病、早熟性研究是棉花要解決的重大生產(chǎn)和科學問題。

早熟性是作物重要的優(yōu)良性狀之一, 棉花的生育期包括營養(yǎng)生長(播種到現(xiàn)蕾)和生殖生長(開花到吐絮) 2 個階段?，F(xiàn)有的棉花資源中發(fā)現(xiàn)早熟品種多抗性差、抗病品種多貪青晚熟; 并且植物本身也存在抗病–發(fā)育的調(diào)節(jié)平衡, 逆境條件下, 多數(shù)植株也會以暫?；驕p緩生長發(fā)育為代價而抵御逆境。建立抗病與早熟之間的聯(lián)系、打破早熟與抗病的負相關(guān)、發(fā)掘同時控制開花與抗病的遺傳因子對培育早熟抗病的品種具有重要意義。

蛋白磷酸化是真核生物中普遍存在的細胞調(diào)節(jié)機制[1]。絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serine/threonine protein kinase, STK)是蛋白磷酸化過程中一類重要的蛋白因子[2], 在細胞信號傳導中起著重要作用[3-4]。目前, STK 在番茄[5-6]、水稻[7-8]、番木瓜[9]、擬南芥[10]、小麥[11-12]、煙草[13]、百合[14]等植物中均有發(fā)現(xiàn), 研究表明STK 參與植物抗病、干旱、光照等多個信號傳導途徑。本課題組前期鑒定了一個棉花絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因(GbSTK), 該基因受黃萎病菌和多種信號分子誘導, 轉(zhuǎn)GbSTK基因的擬南芥顯著提高了植株黃萎病抗性, 有趣的是發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因擬南芥與對照相比, 開花期明顯提前, 因此, 本研究進一步研究STK基因在棉花抗黃萎病和調(diào)控植株開花的功能, 以期為深入揭示棉花STK基因的分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉(zhuǎn)GbSTK基因擬南芥純合株系[15]、黃萎病不同抗性棉花品種均由河北農(nóng)業(yè)大學棉花遺傳育種創(chuàng)新團隊提供。強致病力黃萎病菌系LX2-1[16]由本實驗室分離保存。EASYspin Plus 植物RNA 提取試劑盒購自北京艾德萊生物科技有限公司; PrimeScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程有限公司;2×Phanta Master Mix 購自南京諾唯贊生物科技有限公司; 限制性內(nèi)切酶購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司; T4 DNA 連接酶購自普洛麥格公司;pMD19-T 載體、大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司; Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System、誘餌表達載體pGBKT7、Aureobasidin A (AbA)、X-α-Gal 購自Clontech 公司; Y2HGold 感受態(tài)細胞購自上海唯地生物技術(shù)有限公司。引物合成和測序由生工生物工程股份有限公司完成。

1.2 黃萎病菌誘導下不同抗、感棉花品種STK 基因的表達

采用水培法種植棉花不同抗、感品種, 每2 d 更換1 次Hoagland 營養(yǎng)液。待棉苗二葉一心時, 將棉苗輕輕拿出, 將根部浸泡在黃萎病菌孢子懸浮液(1×107spores mL-1)中3 min, 然后再將棉苗小心栽入上口直徑6 cm 的營養(yǎng)缽, 并從營養(yǎng)缽的底部再次注射10 mL 的黃萎病菌孢子懸浮液, 以保證每棵棉苗成功接菌(附圖1)。根據(jù)實驗室前期構(gòu)建的全長黃萎病菌誘導下cDNA 文庫中篩選的抗病相關(guān)基因的表達中發(fā)現(xiàn), 參與防衛(wèi)反應(yīng)的基因一般在抗/耐病品種較感病品種的表達高峰出現(xiàn)早或表達水平高, 而前期我們對棉花STK受黃萎病菌誘導的熒光定量PCR 顯示, 在接菌后8～12 h, 其表達顯著升高[15],考慮到STK基因主要在參與信號轉(zhuǎn)導方面起作用,其發(fā)揮作用一般在接菌后的早期階段, 因此本研究取接菌后12 h 的根并提取其RNA, 用于研究多個抗感品種中STK基因的表達。根據(jù)GbSTK基因序列設(shè)計實時定量引物STK-F2 和STK-R2 (表1), 片段大小為200 bp 左右。根據(jù)PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real-time)反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。以棉花GhUBQ14[17]為內(nèi)參基因(表 1),qRT-PCR 反應(yīng)體系為10.0 μL, 包含1.0 μL cDNA、5.0 μL 2×SYBR、0.5 μLSTK-F2 primer、0.5 μLSTK-R2 primer、2.8 μL RNase-Free H2O、0.2 μL ROX校正液。反應(yīng)程序為94℃預變性30 s; 95℃變性5 s,57℃退火5 s, 72℃延伸34 s, 40 個循環(huán)。試驗設(shè)置3個生物學重復, 采用2–ΔΔCt方法[18]計算STK基因的相對表達量。

1.3 棉花中病毒誘導的STK 基因的沉默

根據(jù)GbSTK基因的序列信息, 設(shè)計病毒誘導的基因沉默載體(VIGS)引物VF/VR (表1), 并克隆目的片段。將目的基因片段和pTRV2 載體分別用SpeI和AscI 進行雙酶切, 分別膠回收基因條帶和pTRV2載體, 用T4 連接酶在16℃過夜連接, 構(gòu)建成沉默載體pTRV2-GbSTK(TRV::GbSTK)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞, 通過PCR 檢測和陽性克隆測序鑒定得到序列正確的克隆。

將構(gòu)建好的pTRV2-GbSTK質(zhì)粒和pTRV1 分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101, 保存?zhèn)溆?。種植抗病農(nóng)大棉601, 待棉苗2 片子葉平展但第1 片真葉未長出時,分別沉默TRV::GbSTK(試驗組)、TRV::00(空載體對照組)和TRV::CLA1(環(huán)境對照組), 具體操作參照Zhang 等[19]方法。待沉默TRV::CLA1的植株新生葉片出現(xiàn)白化, 說明目的基因被有效沉默, 此時, 進一步通過qPCR 確定試驗組植株的沉默效率。分別選取沉默效果好、長勢整齊一致的植株, 按照Zhang等[20]的方法對GbSTK沉默植株和對照植株接種黃萎病菌孢子懸浮液(×107spores mL-1), 在接菌20 d和25 d 后觀察植株發(fā)病情況并計算病情指數(shù)。

1.4 轉(zhuǎn)STK 基因擬南芥早花性狀的鑒定

分別種植轉(zhuǎn)STK基因擬南芥純合株系和空載體對照擬南芥, 定期觀察擬南芥的長勢, 記錄擬南芥蓮座葉的數(shù)目和開花時間。用EASYspin Plus 植物RNA 提取試劑盒提取轉(zhuǎn)基因株系和空載體對照擬南芥的總 RNA, 以TUB2為內(nèi)參基因(表 1), 利用qRT-PCR 檢測擬南芥中開花相關(guān)標志基因FT和SOC1的表達量, 比較轉(zhuǎn)基因植株和對照擬南芥開花途徑標志基因的表達量。

1.5 STK 酵母雙雜交載體的構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

將含有正確GbSTK序列信息的質(zhì)粒和pGBKT7載體分別用NdeI 和PstI 進行雙酶切, 膠回收GbSTK基因條帶和pGBKT7 空載體條帶, 借助于T4連接酶在16℃過夜連接, 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞。利用pGBKT7 載體的通用引物BD-F/BD-R (表1)檢測陽性克隆, 并對PCR 陽性克隆提取質(zhì)粒DNA 進一步測序驗證。挑選測序正確的克隆, pGBKT7-GbSTK提取質(zhì)粒DNA, 按照說明書轉(zhuǎn)化Y2HGold 感受態(tài)細胞。

1.6 誘餌蛋白毒性和自激活檢測

參照Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System操作手冊, 以共轉(zhuǎn)pGBKT7-53+pGADT7-T 酵母菌作為陽性對照, 共轉(zhuǎn)化pGBKT7-Lam+pGADT7-T 酵母菌作為陰性對照。將空載體 pGBKT7 和pGBKT7-GbSTK分別轉(zhuǎn)入Y2HGold 酵母菌株中, 涂于SD/-Trp 平板上, 置于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d,檢測誘餌載體pGBKT7-GbSTK有無毒性[21]。

挑取平板上生長狀態(tài)良好的pGBKT7-GbSTK單克隆, 在 SD/-Trp 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng), 涂布于SD/-Trp、SD/-Trp/X-α-Gal、SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 平板上, 置于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d, 檢測誘餌載體pGBKT7-GbSTK有無自激活活性[21]。

參照Clontech 公司酵母雙雜交操作指南, 將攜帶pGBKT7-GbSTK誘餌載體的Y2HGold 與黃萎病菌誘導海島棉酵母雙雜交cDNA 文庫進行雜交, 依次涂布于DDO (SD/-Leu/-Trp)、TDO (SD/-His-/Leu/-Trp or SD/-Ade/-Leu/-Trp)、QDO/X/A (SD/-His-/Ade/-Leu/-Trp/X-α-Gal/AbA)平板上, 置于30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d, 觀察菌落生長情況和菌落顏色變化。

利用pGADT7 通用載體引物T7/3′AD (表1)對所篩選到的單克隆進行PCR 鑒定, 對獲得的PCR 陽性克隆進行測序, 測序結(jié)果在Cotton FGD (https://cottonfgd.org/)數(shù)據(jù)庫中進行BLAST比對, 初步確定互作蛋白的基因及蛋白信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗性棉花品種中STK 基因的表達

選取不同抗性棉花品種, 根據(jù)STK在接菌后12 h 出現(xiàn)表達峰值[15], 對根中STK基因的表達檢測結(jié)果表明,STK基因在不同抗性品種中均有表達, 在感病品種邯208 中表達量最低, 不同抗性的棉花品種中STK基因表達量不同程度的明顯高于邯208,其中抗病品種農(nóng)大棉8 號表達量最高, 其次是抗病品種農(nóng)大601 (ND601), 在農(nóng)大棉7 號(NDM7)、農(nóng)大棉10 號(NDM10)、農(nóng)大棉13 號(NDM13)、國欣棉9 號(GXM9)、寧棉9 號(NM9)、冀棉169 (JM169)共6 個耐病品種中的表達也呈現(xiàn)較高的表達水平(圖1)。黃萎病菌誘導下,STK基因的表達水平在抗性好的棉花品種顯著高于感病品種, 說明STK基因的轉(zhuǎn)錄水平與棉花抗黃萎病反應(yīng)呈正相關(guān)關(guān)系。

表1 試驗中所用引物Table 1 Primers used in the study

2.2 沉默棉花內(nèi)源STK 基因顯著增強了植株感病性

以抗病農(nóng)大601 為材料, 待兩片子葉完全展平且第1 片真葉未長出時進行VIGS 處理, 以沉默CLA1為可視化對照。VIGS 處理7 d 后, 注射CLA1的棉苗第1 片真葉出現(xiàn)網(wǎng)格狀的白化現(xiàn)象(圖2-a),說明基因被VIGS 體系有效沉默。此時取沉默棉株及對照棉株的第1 片真葉提取RNA, qRT-PCR 檢測結(jié)果表明, 沉默棉株中GbSTK基因的表達量明顯低于對照(圖2-b), 說明GbSTK在棉株中被沉默。對沉默棉株及對照棉株進行黃萎病菌脅迫處理。在接菌處理25 d 的病情指數(shù)調(diào)查結(jié)果表明, 沉默棉株比對照植株表現(xiàn)出明顯的葉片黃化、植株萎蔫的典型黃萎病癥狀(圖2-c), 2 次獨立的基因沉默試驗中對照棉株的病情指數(shù)分別為25.7 和29.3 (平均27.5), 而沉默STK基因的棉株的病情指數(shù)分別65.3 和61.1 (平均63.2) (圖2-d～e)。表明棉花STK正向調(diào)控了棉花對黃萎病的抗性。

2.3 GbSTK 促進轉(zhuǎn)基因擬南芥提早開花

相同生長條件下, 定期觀察STK基因擬南芥純合株系和空載體對照擬南芥的長勢, 記錄擬南芥蓮座葉的數(shù)目和開花時間。結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)基因擬南芥比對照提早開花5～7 d (圖3-a～c)。開花時統(tǒng)計轉(zhuǎn)基因株系和野生型擬南芥的蓮座葉數(shù)目發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因擬南芥葉片數(shù)平均為7.5 片, 明顯少于野生型的蓮座葉片數(shù)(11.9 片) (圖3-d), 表明轉(zhuǎn)GbSTK基因可顯著提早擬南芥的開花時間。進一步利用qRT-PCR 檢測擬南芥開花標志基因FT、SOC1和LFY基因的表達量發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)基因不同株系中FT和SOC1基因的表達水平顯著高于對照植株, 而LFY基因的表達受影響較小(圖3-e～g), 表明STK基因可以影響開花關(guān)鍵基因FT和SOC1的表達水平, 進而在調(diào)控植株開花時間中發(fā)揮作用。

2.4 pGBKT7-GbSTK 毒性和自激活檢測

利用pGBKT7 載體的通用引物BD-F/BD-R (表1)檢測獲得誘餌載體陽性克隆(圖4-a～c), 提取陽性克隆質(zhì)粒DNA 測序驗證, 測序結(jié)果與預期結(jié)果大小一致。將空載體對照pGBKT7 與誘餌載體pGBKT7-GbSTK分別轉(zhuǎn)化Y2HGold 感受態(tài), 涂布于SD/-Trp平板上。在30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d 后發(fā)現(xiàn), 誘餌載體的平板與空載體的平板菌落生長狀態(tài)基本一致(圖4-d), 表明誘餌載體pGBKT7-GbSTK沒有毒性。

自激活試驗表明, 陽性對照 p G B K T 7-5 3/pGADT7-T 在SD/-Leu/-Trp 平板上可以長出白色菌落(圖5-a), 在SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal 長出藍色菌落( 圖 5-b), 陰性對照 pGBKT7-Lam/pGADT7-T 只能在 SD/-Leu/-Trp 平板上生長,pGBKT7-GbSTK與陰性對照一致。而且誘餌載體pGBKT7-GbSTK在SD/-Trp/X-α-Gal 上正常生長且不顯示藍色, 在SD/-Trp/X-α-Gal/AbA 上不能生長(圖5-c), 表明pGBKT7-GbSTK沒有自激活活性。

2.5 pGBKT7-GbSTK 互作蛋白篩選與分析

將攜帶誘餌載體pGBKT7-GbSTK的酵母菌液和黃萎病菌誘導的海島棉Pima90-53 cDNA 文庫雜交,將菌液依次涂布于DDO、TDO、QDO/X/A 平板上,在30℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)3～5 d, 最終挑選生長良好的藍色菌落(圖6: 部分篩選結(jié)果), 進行菌落PCR 鑒定, 獲得105 個陽性克隆, 對105 個克隆進行測序,序列信息通過棉花Cotton FGD (https://cottonfgd.org/)數(shù)據(jù)庫比對分析, 篩選到30 個可能與GbSTK 互作的蛋白(表2)。通過NCBI 比對, 根據(jù)同源蛋白功能類似的特點發(fā)現(xiàn), 這30 個蛋白可以大體上分為6 類:第1 類包括細胞色素氧化酶(cytochrome C oxidase)和蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase), 它們在ROS 的產(chǎn)生中具有明確的功能報道; 第2 類主要是參與防衛(wèi)反應(yīng)或應(yīng)對生物/非生物脅迫的成員; 第3類主要為參與此生代謝合成的基因; 第4 類蛋白在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育和脅迫相應(yīng)均具有功能; 第5 類蛋白在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中有功能報道; 第6 類是目前沒有明確的功能報道的一類。這些蛋白為深入揭示GbSTK 的蛋白調(diào)控網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。

3 討論

自然條件下, 植物生長發(fā)育面臨生物和非生物脅迫等復雜的環(huán)境, 植株為了增強生存能力, 在長期的植物進化過程中形成了一套成熟的適應(yīng)機制,即通過能量和物質(zhì)的重新分配來有效調(diào)控生長與發(fā)育的平衡。傳統(tǒng)觀點認為, 植株抗病性與品種早熟性存在此消彼長的關(guān)系, 認為抗病植株易貪青晚熟,早熟性好的品種抗性比較差, 猶如魚和熊掌不可兼得[47]。隨著人們對基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的不斷建立和深入,一些突破性研究進展正在沖擊人們的傳統(tǒng)認識, 正如普遍認為植物抗病與產(chǎn)量之間呈現(xiàn)難以打破的負相關(guān), 最新發(fā)表在Science的研究報道表明[48], 水稻IPA1基因既能提高水稻產(chǎn)量又能增強對稻瘟病的抗性, 打破了不可能同時實現(xiàn)增產(chǎn)和抗病的傳統(tǒng)觀點, 這也為育種家突破傳統(tǒng)認識, 將之前多年來育種上的不可能逐漸變?yōu)榭赡芴峁┝藛l(fā)。本研究發(fā)現(xiàn), 棉花絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶(GbSTK)具有調(diào)節(jié)黃萎病抗性和植株早花的雙重功能, 為從理論上打破抗病性與品種早熟性負相關(guān)提供了有潛力的基因資源。

本課題組前期基于SSH 文庫篩選到GbSTK基因, 該基因可以顯著提高擬南芥的黃萎病抗性[15]。本研究在此基礎(chǔ)上進一步研究發(fā)現(xiàn), 抗性較好的多個棉花品種中STK基因表達水平均不同程度高于感病對照, VIGS 試驗進一步證明, 沉默棉花內(nèi)源STK基因顯著降低了植株的抗病性, 表明GbSTK正調(diào)控棉花黃萎病抗性。酵母雙雜交互作蛋白篩選試驗初步篩選到30 個與GbSTK 存在互作關(guān)系的蛋白, 大多數(shù)蛋白的功能尚未報道。其中, 我們篩選到的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(S-adenosylmethionine synthase,SAMS)目前已有研究。SAMS 是植物代謝中的關(guān)鍵酶, 催化甲硫氨酸和 ATP 合成S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine, SAM)[49]。SAM 不僅為DNA、RNA、蛋白質(zhì)提供了甲基, 而且還是多胺、乙烯、生物素等物質(zhì)合成的前體物質(zhì)[50-51]。表明SAMS基因參與植物響應(yīng)生物與非生物脅迫。在擬南芥中,FER 通過與SAM1 和SAM2 酶相互作用, 抑制了SAM 的合成, 降低了乙烯水平, 從而控制了植物的發(fā)育[52]。大豆在水分和干旱脅迫下,SAMS參與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)控, 3 種S-腺苷甲硫氨酸合成酶蛋白在水分和干旱脅迫下表達分別下降、增加[53]。張悅等[54]研究表明, 剛毛檉柳S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因ThSAMS參與了對鹽和干旱的脅迫應(yīng)答。董先娟等[55]發(fā)現(xiàn), 鹽、干旱、低溫以及重金屬脅迫均能夠提高AsSAMS1的表達和SAM 的積累; 茉莉酸甲酯、水楊酸、脫落酸、赤霉素信號均可誘導白木香愈傷組織中AsSAMS1基因的表達。本課題組也發(fā)現(xiàn), 陸地棉GhSAMS基因在棉花抗黃萎病反應(yīng)中起著重要作用[35]。本研究基于酵母雙雜交篩選的與 GbSTK 互作的SAMS 蛋白和GhSAMS 蛋白的同源性為99.28%推測(附圖2), GbSTK 蛋白可能通過與SAMS 蛋白互作,從而起到抗黃萎病作用, 也為深入研究GbSTK 蛋白的抗病機制奠定了基礎(chǔ)。

表2 與GbSTK 互作的候選蛋白Table 2 Candidate proteins interacting with GbSTK

FLOWERING LOCUS T(FT)基因在植物中廣泛存在, 作用于多種調(diào)控途徑的下游, 包括CONSTANS(CO)光周期誘導途徑, 是促進開花的所必需的信號整合因子[56]。CO 蛋白在長日光條件下激活FT基因表達, FT 蛋白被運送到篩管中, 最終通過韌皮部運輸?shù)角o尖分生組織和FD 蛋白結(jié)合, 共同作用調(diào)控下游花器官相關(guān)基因AP1、SOC1等基因的表達, 從而促進擬南芥開花[57]。本研究發(fā)現(xiàn), 轉(zhuǎn)GbSTK基因的擬南芥比對照提早開花5～7 d, qRT-PCR 分析擬南芥開花關(guān)鍵基因的表達水平發(fā)現(xiàn),GbSTK基因可以顯著提高擬南芥FT和SOC1基因的轉(zhuǎn)錄水平, 促使植株提早開花, 這也首次揭示了一個具有抗病功能的棉花基因具有提早植株開花的功能。

本研究初步證明了棉花GbSTK基因具有同時提高抗性和提早開花的功能, 并為進一步研究該基因的分子機制提供了初步線索, 深入研究GbSTK基因的功能和分子機制, 將為抗病早熟育種提供重要理論基礎(chǔ)和實際應(yīng)用新途徑。

4 結(jié)論

GbSTK基因正向調(diào)控棉花黃萎病抗性, 沉默棉花內(nèi)源STK基因可顯著降低植株抗病性; 超表達GbSTK可以增強開花關(guān)鍵基因FT和SOC1的表達,進而調(diào)控植株提早開花。酵母雙雜交初步篩選出30個與GbSTK 互作的候選蛋白, 主要涉及參與ROS合成、生物非生物脅迫、次生代謝、生長發(fā)育等幾類功能蛋白。