陳同睿 羅艷君 趙潘婷 賈海燕 馬正強

南京農業(yè)大學農學院 / 作物遺傳與種質創(chuàng)新國家重點實驗室 / 江蘇省現(xiàn)代作物生產協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇南京210095

植物在自然界生長過程中不斷受到各種病原物的侵襲。在長期的進化過程中, 植物與病原物之間互相適應、協(xié)同進化。植物通過一系列信號傳遞激發(fā)自身的防御體系, 從而產生抗病反應, 例如水楊酸、茉莉酸、乙烯、鈣離子等在抗病信號轉導途徑中扮演著至關重要的作用[1-2]。小麥, 作為世界三大糧食作物之一, 產量僅次于玉米和水稻。在過去的幾十年間, 在小麥種植面積沒有增加的前提下, 截至2017 年全球小麥總產量增長超過50%[3]。然而,它的生長過程受各種病原菌的侵害, 包括銹病、白粉病、赤霉病、紋枯病等。近年來, 隨著全球氣候變化、小麥耕作制度及農業(yè)生產技術變化的影響,小麥赤霉病的發(fā)生頻率越來越高, 病害發(fā)生的面積逐漸增加。在我國, 赤霉病主要發(fā)生在長江中下游麥區(qū)、華南冬麥區(qū)和川滇冬麥區(qū)等。小麥赤霉病的發(fā)生不僅僅降低小麥的產量和品質, 更為嚴重的是感赤霉病的籽粒含有赤霉菌分泌的多種毒素如脫氧雪腐鐮刀菌烯醇, 嚴重影響人畜健康[4-5]。鑒于赤霉病對小麥生產和糧食安全造成的嚴重威脅, 該病害引起了人們越來越多的關注。

凝集素是一類廣泛存在于生物體內的糖蛋白或糖特異結合蛋白, 與機體的多種生理功能密切相關[6]。植物凝集素按照同源性、種屬來源及進化關系的差異可分為12 個不同家族[7-8], Jacalin-related lectins (JRLs)是植物凝集素超家族中的一個新家族,因被發(fā)現(xiàn)于木菠蘿而被命名[9]。根據其糖結合特性被劃分為半乳糖特異性JRL (gJRLs)和甘露糖或葡萄糖特異性JRL (mJRLs), 前者是?？浦参锾禺惖? 主要儲存于液泡中[10]; 后者廣泛分布于單子葉植物、雙子葉植物、蘇鐵植物和蕨類植物, 大多數(shù)定位于細胞質和細胞核中。JRLs 蛋白結構具有多樣性, 可包含一個或多個Jacalin 結構域[8,11], 也可與其他結構域嵌合。其中與疾病響應元件Dirigent 嵌合的JRL是單子葉植物特有的類型, 在單子葉植物中廣泛存在, 又稱為單子葉嵌合凝集素[12]。

迄今為止, 在植物中已有功能研究報道的JRLs超過26 個[13], 它們大多數(shù)都與抗病、抗逆及脅迫壓力的響應相關, 但是它們抗病/逆的機制卻各不相同。比如, 從紅蕓豆中提取的一種同源二聚凝集素,通過其自身的有毒肽對真菌Fusarium oxysporum、Coprinus comatus和Rhizoctonia solani的生長產生抑制作用[14]。LecRK-V.5 通過負調控擬南芥的氣孔免疫, 從而對丁香假單胞菌和胡蘿卜軟腐菌的生長產生影響[15-16]。JAX1介導的免疫抗性不同于其他病毒抗性機制, 它獨立于傳統(tǒng)抗性(R)蛋白介導的抗性和植物防御激素信號傳導[17-18]。辣椒中的甘露糖結合凝集素基因CaMBL1 通過識別高甘露糖型N-聚糖調控PCD, 進而對微生物病原體的防御反應[19]。凝集素受體激酶ERK1 在LysM 區(qū)域抗真菌MAMP 信號感知中發(fā)揮重要作用[20-21]。RTM1 通過與自身或RTM3 相互作用來限制植物病毒的長距離移動[22-24]。PYK10 通過與不同的JRLs (JAL31 和JAL23)互作,控制PYK10 聚合物的尺寸, 從而在防御反應中發(fā)揮作用[25]。OsJAC1 具有對多種病原菌的廣譜抗性, 這種抗性是由自身的Jacalin 和Dirigent 兩個結構域相互作用提供[26],OsMBL1可增強對稻瘟病菌的抗性,其抗性的產生是由于與稻瘟病基因MoChi1競爭幾丁質, 從而觸發(fā)水稻細胞中的ROS 反應, 并且通過積極調控SA 和ABA 響應基因, 進而通過參與PTI途徑防御稻瘟病菌的侵染[27];LEM2參與了大麥系統(tǒng)獲得性抗性[20]。

在小麥中, 目前為止僅有以下4 個JRL 基因被克隆并進行了功能及機制方面的探索:TaJRLL1與小麥白粉菌和赤霉菌抗性有關, 被認為是水楊酸和茉莉酸植物防御信號機制的組成部分[28];TaWC1-1基因響應白粉菌的侵染[29],TaHfr-1對黑森麥稈蟲幼蟲的發(fā)育有抑制作用[30];TaJA1是OsJAC1在小麥中的同源基因, 過量表達該基因可提高煙草對多種病害的抗性[31]。此外, 也有研究者在大麥、水稻、高粱、小麥和一些草屬的NBS-LRR 區(qū)域發(fā)現(xiàn)了整合的Jacalin 結構域, 這類整合結構域, 有些可以誘捕入侵的病原體, 啟動相應的防御響應[32-33]。我們前期研究從小麥基因組中鑒定獲得了67 個JRL 基因, 其中TaJRL53是一個單拷貝基因, 位于小麥4A 染色體長臂上, 屬于與Dirigent 結構域嵌合的mJRLs, 通過電子表達及RT-PCR 檢測到TaJRL53可對赤霉菌的侵染產生響應, 并在MeJA 和SA 激素處理后上調表達[6]。本研究擬通過VIGS 技術和基因槍介導的遺傳轉化技術進一步探究TaJRL53的生物學功能以及抗性機制。

1 材料與方法

1.1 植物材料

普通小麥中國春和望水白用于該基因的克隆,地方品種望水白用于基因的組織特異性表達分析;中抗赤霉病材料SSD006 用于VIGS 實驗; 感赤霉病材料Bobwhite 和PH691 用于穩(wěn)定遺傳轉化。組織特異性表達分析的材料: 取望水白正常生長季節(jié)苗期根、莖、葉和開花后5 d 的根、莖、葉、穗于液氮凍存。轉基因植株中TaJRL53的表達所用的材料: T0代轉基因植株成株期的葉片。亞細胞定位材料用新鮮的洋蔥。

1.2 基因的克隆

參照文獻[31]獲得的TaJRL53基因序列設計特異引物(F 引物: 5'-ATGGCCACAACCACCG-3'; R 引物: 5'-GATGGTATAAACACCAATCGAAG-3'), 從中國春的cDNA 中擴增TaJRL53的開放讀碼框。

1.3 總RNA 的提取、cDNA 的合成、半定量PCR和實時定量PCR

利用TRIzol 試劑(Invotrogen, Carlsbad, CA)按照操作說明提取總 RNA, 所有的 RNA 材料均用DNaseI (Fermentas, Canada)消化以確保完全去除DNA 污染。隨后用M-MLV 反轉錄酶(Promega, USA)按照操作說明合成cDNA。

半定量RT-PCR擴增體系為25 μL, 反應程序為94℃預變性3 min, 94℃變性30 s, 退火30 s (退火溫度視具體引物而定), 72oC延伸(延伸時間視擴增片段長度而定), 25～30 個循環(huán)(因基因的表達豐度不同而異), 最后72oC延伸5 min。擴增產物在2%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測。以小麥組成型表達基因TaActin作為內參。

參照THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (Toyoba,Japan)使用說明, 實時定量 RT-PCR 反應體系為20 μL, 包括約5 ng 模板、10 μL SYBR-Green PCR Mastermix (Toyoba, Japan)和各8 pmol 的正反向引物。以TaActin作為參照, 每個目標基因3 個重復, 相對表達量2?ΔΔCT方法計算[32], 用StepOnePlus Realtime PCR Systems (Applied Biosystems)進行反應。按[33]中所用引物對信號通路中的標志基因的表達進行檢測, 檢測TaJRL53表達的正向引物為5'-GTTGC CAAAACGCACGGTA-3', 反向引物為5'-CCCAGTC ATTATCTGCTTCATCCTC-3'。

1.4 載體構建

1.4.1 瞬時表達載體的構建 用KOD FX DNA聚合酶從望水白穗部cDNA 中擴增TaJRL53的編碼區(qū)(不含終止子), 正向引物為5'-CTAGTCTAGA AT GGCCACAACCAC-3' (下畫線表示XbaI 酶切位點),反向引物為5'-CGCGGATCC GATGGTATAAACA-3'(下畫線表示BamHI 酶切位點)。擴增產物在1%瓊脂糖凝膠上電泳分離檢測后, 用DNA 凝膠回收試劑盒回收, 將回收到的擴增產物用XbaI 和BamHI 酶切, 回收定量后與經過XbaI 和BamHI 酶切過的pEGFP 表達載體按3∶1 摩爾比混合, 在4°C 條件下用T4-DNA 連接酶(Promega, USA)連接過夜, 連接產物用熱擊法轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α。陽性克隆送上海華大公司測序驗證。

1.4.2 BSMV 沉默載體的構建 本實驗室內野生型BSMV ND18 α、β 及γ 載體引自美國堪薩斯州立大學Scofield 實驗室。利用DNA 聚合酶從中國春的cDNA中擴增TaJRL53, 上游引物 5'-CCCGTTAATTAA GCCACAACCACCGAAGAACC-3' (下畫線表示PacI 酶切位點), 下游引物為5'-TATAGCGGCCGC CAG CACCGTCATAGACACCCC-3' (下畫線表示NotI 的酶切位點), 將PCR 產物和野生型BSMV ND18 γ 用PacI 和NotI (Promega, USA)雙酶切, 將載體去磷酸化, 分別回收酶切后的PCR 產物和質粒, 并按3∶1的摩爾比混合, 在4°C 條件下用T4-DNA 連接酶(Promega, USA)連接過夜。用熱擊轉化法將連接產物轉入大腸桿菌感受態(tài)細胞DH5α。挑取陽性克隆送上海華大基因科技股份有限公司測序, 測序結果正確,獲得可用于VIGS 轉化的載體。

1.4.3 穩(wěn)定表達載體的構建 用TaJRL53的特異引物從中國春的cDNA 中擴增TaJRL53的開放讀碼框, 正向引物為5'-TACGCTGCAG ATGGCCACAAC CACCG-3', 反向引物為5'-ATGCCTGCAG GATGGTA TAAACACCAATCGAAG-3' (下畫線為PstI 的酶切位點)。將擴增片段插入到中間載體pUT (pTA2-Ubi-Ter)中構建Ubi驅動的表達盒, 然后將Ubi::TaJRL53-Ter表達盒用HindIII 切下, 再插入到表達載體pUCBS 中, 構成用于基因槍轉化的TaJRL53穩(wěn)定表達載體(圖1)。

1.5 亞細胞定位

剝去新鮮洋蔥最外的兩層鱗莖, 用尖嘴鑷子小心撕取完好鱗莖的內表皮, 平鋪于1/2 MS 固體培養(yǎng)基上, 注意要將內表面朝上, 且要平鋪于培養(yǎng)皿中心位置。蓋上培養(yǎng)皿, 黑暗中 25oC 恒溫預培養(yǎng)2～4 h。參照文獻[34]進行質粒包裹和基因槍轟擊。將洋蔥表皮細胞置于 25°C 恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)16～18 h, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光并照相記錄。

1.6 VIGS

1.6.1 體外轉錄物的合成 提取野生型 BSMV ND18 α、β、γ 及BSMV:TaJRL53的質粒, 分別用MluI 線性化BSMV ND18 α、γ 及BSMV:TaJRL53質粒DNA,SpeI 線性化BSMV ND18 β 質粒DNA,用1%的凝膠電泳檢測線性化水平。待線性化完全后用酚、氯仿抽提、純化, 用RNase-free 水溶解, 調整濃度為0.2～1.0 μg μL–1。以抽提純化的質粒為模板,用 T7-DNA 依賴的 RNA 聚合酶(mMessage mMachine T7 Kit; Ambion) 進行體外轉錄。轉錄產物用1% RNA-free 的凝膠電泳跑膠, EB 染色后在紫外燈下拍照檢測RNA 質量。

野生型BSMV ND18 α、β 及γ 為模板的體外轉錄物與FES 按1∶1∶1∶25 的比例混合為空BMSV病毒對照, 同樣以野生型 BSMV ND18 α、β 及BSMV:TaJRL53為模板的體外轉錄物與FES 也按1∶1∶1∶25 的比例混合, 取8 μL 上述兩種混合液均勻液涂于穗部, 同時單獨涂抹FES 緩沖液做空白對照。

1.6.2 體外涂抹 在抽穗期選取長勢良好且大小一致的穗子, 分別涂抹FES 緩沖液、FES 緩沖液和BSMV 病毒混合液, FES 緩沖液和BSMV:TaJRL53病毒混合液, 以只涂抹FES 緩沖液和涂抹FES 緩沖液、BSMV 病毒混合液的植株作為對照組, 涂抹FES緩沖液和BSMV:TaJRL53病毒混合液的植株作為實驗組, 每種病毒混合液至少接種10 株, 3 次重復。

1.7 小麥的遺傳轉化及轉基因植株的檢測

取開花后14 d 左右的小麥種子脫粒。在無菌條件下將脫粒的種子置于滅菌小罐中, 用70%乙醇浸泡5 min, 無菌水沖洗2～3 次; 2%的NaClO 浸泡8 min, 無菌水沖洗3～4 次。于2 mg L–12,4-D 的MS培養(yǎng)基上, 25℃暗培養(yǎng)3～5 d 后, 幼胚經過脫分化形成愈傷組織。參照文獻[34]的方法基因槍轟擊, 轟擊后的小麥愈傷繼續(xù)在25oC 黑暗培養(yǎng)箱培養(yǎng)16～18 h,然后轉移至誘導培養(yǎng)基上進行暗培養(yǎng)14 d。將愈傷組織轉移到1 mg L–1KT 和20 mg L–1篩選劑G418的分化篩選培養(yǎng)基上, 在25oC、12 h 光照條件下培養(yǎng), 待愈傷分化出綠點后進行繼代培養(yǎng), 篩選4 周后將綠苗進行生根培養(yǎng), 2 周后移栽到土壤中。

采用SDS 法提取受體材料和小麥再生植株的DNA[35], DNA 稀釋后跑電泳檢測質量和濃度, 用Ubiquitin 的正向引物 5'-ATCTCCCCCAAATCC ACCCG-3'和TaJRL53基因的反向引物5'-ATGCCTG CAGGATGGTATAAACACCAATCGAAG-3' 進 行PCR 檢測, 同時以含有TaJRL53ORF 的載體質粒為陽性對照, 未轉化的野生型植株DNA 為非轉基因對照, 水為空白對照。PCR 總體積為25 μL, 包含模板、正反引物、r-TaqDNA 聚合酶和10×PCR 緩沖液。PCR 程序包括: 94oC 預變性5 min, 94oC 變性40 s, 60oC 退火30 s, 72oC 延伸2 min, 36 個循環(huán), 最后72oC 延伸5 min。PCR 產物在1%的瓊脂糖凝膠電泳分離檢測, 用EB 染色后在紫外燈下觀察結果并照相。

1.8 赤霉病抗性鑒定

1.8.1 小麥葉片的赤霉病抗性鑒定 取T1代轉基因株系返青至拔節(jié)期的小麥葉片接種赤霉菌孢子液, 孢子液為F15、F609、F7136 及F. grminearumtri5-GFP 菌株的分生孢子混合液, 接種時在葉片表面用槍頭輕輕劃傷, 懸空放置在培養(yǎng)基中間, 然后接種6 μL 濃度為1×106個 mL–1赤霉菌分生孢子的菌液。接種36 h 后觀察赤霉菌菌絲的侵染情況。實驗設置3 個重復, 每個重復中各接種5 個葉片, 差異顯著性用t-test 進行檢驗。

1.8.2 小麥穗部的赤霉病抗性鑒定 采用單花滴注法對實驗組和對照組長勢一致的穗子接種赤霉菌,具體方法參照文獻[36], 每個處理至少接種15 個穗子, 接種后7 d 和14 d 調查并記錄病小穗數(shù)和病軸長, 每個轉基因株系至少接種10 個穗子, 差異顯著性用t-test 進行檢驗。21 d 時對接種的穗子進行拍照。

2 結果與分析

2.1 TaJRL53 的克隆和組織表達特異性

利用TaJRL53特異引物從普通小麥中國春穗部cDNA 中克隆獲得了1056 bp 的全長序列,該序列與抗赤霉病種質望水白中的序列信息一致, 說明該基因序列在抗感材料中沒有差異。對TaJRL53基因在苗期和開花期各組織中的表達進行分析, 以TaActin作為參照, 結果如圖2 所示, 苗期主要在莖和葉片中表達(圖2-A), 開花期的根莖葉穗4 個組織中, 穗部表達量最高(圖2-B)。

2.2 TaJRL53 的亞細胞定位

為了研究TaJRL53蛋白在細胞中的表達部位,以PMD19-EGFP (35S::GFP)作為對照, 將TaJRL53的GFP 瞬時表達載體(35S::TaJRL53-GFP)轉入洋蔥表皮細胞后, 在激光共聚焦顯微鏡下觀察,TaJRL53與GFP 均在整個細胞中發(fā)出綠色熒光, 尤其在細胞核上的熒光更為明顯, 表明TaJRL53 分布于細胞質及細胞核上(圖3), 是一個核-質蛋白, 與mJRLs 的亞細胞定位特點一致。

2.3 VIGS 介導TaJRL53 沉默后降低了植株赤霉病的抗性

接種 10 d 后, 涂抹 BSMV 病毒和 BSMV:TaJRL53病毒的麥穗出現(xiàn)病毒侵染后的表型。采用RT-PCR 法檢測TaJRL53在籽粒中的表達水平, 與接種FES 緩沖液和BSMV 病毒的對照植株相比, 接種BSMV:TaJRL53病毒的植株中的TaJRL53的表達量顯著降低, 表明TaJRL53的表達被成功抑制(圖4-A)。各挑選長勢一致的15 個植株用單花滴注法接種赤霉菌。接種3 d 后, 所有接種小穗可見明顯的接種點。第7 d, 涂抹BSMV:TaJRL53病毒的植株, 其接種小穗上的赤霉菌由接種點擴展到鄰近小穗, 穗軸呈褐色。至接種15 d, 只涂抹FES 緩沖液、涂抹FES 緩沖液和BSMV 空載病毒混合液及FES 緩沖液和BSMV:TaJRL53病毒混合液的植株病小穗數(shù)的平均值分別為1.3 個、1.3 個、2.4 個(圖4-B), 差異達顯著水平(P< 0.05); 病軸長分別為0.2、0.3、1.3 cm(圖4-C), 差異達極顯著水平。接種21 d 后, 涂抹FES緩沖液、FES 緩沖液和BSMV 病毒的混合液及FES緩沖液和BSMV:TaJRL53病毒混合液的植株病小穗數(shù)和病軸長差異最為顯著(圖4-D), 平均病小穗數(shù)分別為1.6 個、1.5 個和4.6 個(圖4-B); 平均病軸長分別為0.3、0.3 和2.1 cm (圖4-C)。

綜上所述, VIGS 介導中抗赤霉病小麥SSD006中的TaJRL53沉默后, 小麥植株對赤霉病的抗性明顯降低, 認為TaJRL53對小麥赤霉病抗性有重要影響。

2.4 小麥穩(wěn)定轉化及陽性植株的基因型和表型鑒定

采用基因槍法將TaJRL53過量表達載體導入到感赤霉病小麥品種Bobwhite 和PH691 中, 經愈傷誘導和連續(xù)的G418 篩選后, 對T0代抗性植株進行分子檢測, 結果共獲得6 株以Bobwhite 為受體的轉基因植株, 1 株以PH691 為受體的轉基因植株(圖5-A)。利用RT-PCR 分析TaJRL53在各轉基因植株中的表達水平, 結果表明7 個轉基因植株的表達都明顯高于受體, 以Bobwhite 為受體的轉基因植株中編號為1 和2 的轉基因植株表達量最高, 6 最低, 以PH691 為受體的轉基因植株7 中的表達水平低于以Bobwhite 為受體的1～5 號植株), 略高于6 號植株(圖5-B)。

為探究TaJRL53過量表達植株對赤霉病的抗性,取純合轉基因T1代株系六葉一心期的葉片在離體條件下接種含GFP 基因的赤霉菌, 36 h 后在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn), 非轉基因對照Bobwhite 與以其為受體的轉基因植株葉片均能觀察到綠色熒光, 但轉基因植株葉片上的熒光與對照相比明顯弱(圖6-A)。與對照菌絲完全遮蓋接種點相比, 轉基因株系僅能看見接種點, 其中Bobwhite 為受體的1、2 和4 號株系病斑面積顯著減小, 差異在P<0.01 水平顯著; 編號為3和5 的株系病斑面積在P<0.05 水平顯著(圖6-B)。陰性對照PH691 和以其為受體的7 號轉基因植株在接菌之后菌絲均沿接種點向四周擴散, 但轉基因植株菌絲擴散程度與對照相比較輕, 其病斑面積的平均值與對照相比小20%, 差異在P< 0.01 水平顯著(圖6-A, B)。

對純合T1代轉基因株系穗部采用單花滴注法接種赤霉菌, 接種10 d 后, 未轉基因對照穗部的赤霉菌由接種點開始向臨近小穗蔓延, 但轉基因株系并未出現(xiàn)明顯的赤霉菌擴展現(xiàn)象。接種14 d 后, 轉基因株系與非轉基因對照的病小穗數(shù)和病軸長差異顯著(圖6-C, D, E), 其中非轉基因的Bobwhite 病小穗數(shù)平均為4.2 個, 病軸長平均為3.0 cm, 轉基因株系的病小穗數(shù)平均值在1.7～2.0 個之間, 病軸長在1.4～2.5 cm 之間; 對照PH691 的病小穗數(shù)與病軸長的平均值分別為5.9 個和4.7 cm, 但以PH691 為受體的轉基因植株的病小穗數(shù)和病軸長的平均值分別為1.0 個和1.6 cm, 與對照相比, 轉基因植株的病小穗數(shù)與病軸長差異均在P< 0.001 水平極顯著(圖6-D, E)。

2.5 TaJRL53 過量表達的轉基因植株中抗病信號途徑相關基因的表達

為探究TaJRL53過量表達的轉基因植株提高赤霉病抗性的分子機制, 對主要抗病信號途徑SA、JA、ROS、Ca2+轉運信號通路和木質素合成途徑的標志基因進行了赤霉菌誘導后的表達分析。如圖7所示, 當赤霉菌侵染TaJRL53過表達的轉基因植株24 h 時, JA 信號轉導途徑中的基因12-OPR3、ACO以及效應基因ERF1、病程相關蛋白基因PR-3的表達均顯著提高(圖7-A～D)。對ROS 生成途徑中的兩個關鍵酶SAMDC、PAO 及與活性氧運輸相關的Ca2+轉運信號通路相關基因calcium-transporting ase1的表達進行檢測, 發(fā)現(xiàn)這3 個基因在轉基因株系中的表達量都顯著高于非轉基因對照植株(圖7-E～G)。在SA 信號轉導途徑中除了病程相關蛋白基因PR1、PR2表達量顯著提高外(圖7-H, I), 效應基因Glu2、NPR1、EDS1(圖7-J～L),SA合成相關基因ICS1和PAL等的表達都無顯著差異(圖7-M, N); 轉基因植株與非轉基因植株的木質素合成基因CCOMT表達水平無顯著差異(圖7-O)。由此初步推測TaJRL53提高小麥赤霉病抗性與JA 和ROS 信號途徑以及病程相關蛋白有關。

3 討論

盡管目前發(fā)現(xiàn)的JRL 凝集素存在于植物的多種組織, 但對于某一個特定的JRL 凝集素而言, 其在植物體內的表達往往僅限于某一個或少數(shù)幾個組織,具有一定的組織特異性。Song 等[6]和Jiang 等[7]對JRL 基因在不同組織中的表達譜進行統(tǒng)計分析后發(fā)現(xiàn), 21.4%的JRL 基因都具有組織表達特異性。例如Lem2在內外稃及胚芽中表達[40],MRL-1和MRL-2都在根中表達[41],TaJA1在葉鞘中表達[31]。本研究對TaJRL53的組織特異性表達進行分析, 發(fā)現(xiàn)TaJRL53苗期主要在莖和葉片中表達, 開花期在莖、葉、穗部都有表達, 但主要在穗部表達。

根據糖基結合的特異性可以將JRLs 劃分為兩類: 一類是半乳糖特異的jacalin 凝集素(galactosespecific jacalin-related lectins, gJRLs), 另一類是甘露糖或葡萄糖特異的jacalin 凝集素(mannose-specific jacalinrelated lectins, mJRLs)?，F(xiàn)階段所鑒定的JRLs 大多數(shù)屬于mJRLs, 少數(shù)屬于gJRLs。對水稻、擬南芥和小麥中的mJRLs 亞細胞定位結果顯示大多數(shù)位于核/質間[39-41]。本研究通過洋蔥表皮細胞亞細胞定位, 發(fā)現(xiàn)TaJRL53蛋白分布在細胞核/質中, 表明TaJRL53具有mJRLs 亞家族成員典型的蛋白定位特征, 初步推測TaJRL53屬于mJRLs 亞家族成員。特異糖基結合試驗有助于進一步確定該凝集素本身的性質。

Dirigent 蛋白通常被認為在木質素和木脂素的生物合成中起重要作用, 與Dirigent 結構域嵌合的JRLs 基因在植物的應激反應和發(fā)育中扮演著重要角色[12], 例如TaJA1, 及其在水稻和大麥中的同源基因OsJAC1、HvJAC1均具有廣譜抗性[31,45]。TaJRL53的蛋白編碼結構與TaJA1相似, 都具有 N 端的Dirigent 結構域和C 端的Jacalin 結構域[6]。本研究對TaJRL53的功能進行探究, 認為該基因參與對赤霉菌的防御過程, 對赤霉菌的侵染具有抗性。本研究首先采用BSMV 的方法降低TaJRL53在中抗赤霉病品種SSD006 中的表達, 發(fā)現(xiàn)植株對赤霉病的抗性降低。然后采用基因槍介導的遺傳轉化技術, 將TaJRL53過量表達載體轉入感赤霉病品種Bobwhite和PH691 中, 分別獲得6 株和1 株TaJRL53的過量表達植株。對T1代轉基因植株采用離體葉片法和穗部單花滴注法接種赤霉菌鑒定轉基因株系對赤霉菌的抗性, 離體葉片法接菌結果顯示: 以Bobwhite 為受體的轉基因株系其葉片上的熒光與對照相比明顯減弱, 菌斑面積顯著減小。陰性對照PH691 和以其為受體的轉基因植株在接菌之后菌絲均沿接種點向四周擴散, 但轉基因植株菌絲擴散程度與對照相比較輕。單花滴注法接種T1代小穗后, 結果顯示轉基因株系與對照均出現(xiàn)赤霉病的典型癥狀, 但轉基因株系與受體親本相比病害較輕。對T2代轉基因株系的穗部接菌進行抗性鑒定, 各轉基因株系與T1代的抗病趨勢一致, 表明TaJRL53的轉基因株系可以減輕由禾谷鐮刀菌引起的病害。同時, 本研究發(fā)現(xiàn)兩個不同背景的轉基因株系抗病性存在差異, 這可能是因為兩個受體材料對赤霉病的抗性和自身的組培性能存在差異, 轉基因植株中TaJRL53的拷貝數(shù)不同造成的。

SA 和JA 介導的信號傳導途徑是植物在應對病原菌侵染時被激活的防衛(wèi)途徑, JA 在死體寄生和兼性寄生型病原菌侵染過程中起重要作用, SA 在活體寄生型病原菌的侵染過程中起重要作用, SA 和JA 途徑均參與兼性寄生型真菌赤霉菌的侵染反應[46-47]。TaJRLL1是mJRLs 亞家族中的一員, 該基因通過參與SA 和JA 的植物防御信號機制的組成部分, 實現(xiàn)小麥植株對死體寄生的灰霉菌, 活體寄生的白粉菌以及兼性寄生的赤霉菌的抗性[28]。本研究對接種赤霉菌后的TaJRL53轉基因植株的SA 和JA 信號轉導途徑相關基因的表達進行檢測, 發(fā)現(xiàn)JA 信號轉導途徑主要標志基因的表達量與對照相比有所提高, 但SA 信號轉導途徑相關基因的表達并無明顯變化。ROS 的產生是植物最早期的防御反應途徑, ROS 的積累一方面可誘導防御基因的表達, 另一方面通過胼胝質沉積增加植物細胞壁的厚度[48]。在TaJRL53過量表達的轉基因植株中ROS 生成途徑的關鍵基因SAMDC和PAO的表達上調, 但是細胞壁合成相關的酶基因CCOMT并無表達變化, 說明TaJRL53過量表達只是改變了植株體內ROS 的產生水平, 并不影響細胞壁的合成。

綜上所述,TaJRL53可能通過調控植物體內活性氧產生、JA 信號途徑、誘導病程相關蛋白基因的表達水平, 從而提高植株對赤霉菌的抗性。但該基因的赤霉病抗病機制還不清楚, 其發(fā)揮作用的結構域是Dirigent 還是Jacalin 或是共同作用還不得而知,碳水化合物結合蛋白作為mJRLs 細胞活動中的關鍵物質, 其結合特異性在植物防御機制中的作用今后還有待闡明。

4 結論

通過VIGS 技術和基因槍介導的遺傳轉化技術證明TaJRL53與赤霉病的抗性呈正相關, 赤霉菌侵染轉基因株系后, ROS 和JA 信號途徑相關基因表現(xiàn)出上調趨勢, 說明TaJRL53可能是通過參與ROS 合成途徑和JA 信號轉導途徑來提高轉基因植株對赤霉病的抗性。