周虹瑾,霍向東,趙丹,林青,婁愷,袁華偉*

1(新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,新疆 烏魯木齊,830000) 2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室,新疆 烏魯木齊,830091) 3(宜賓學(xué)院 質(zhì)量管理與檢驗(yàn)檢測學(xué)部/固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川 宜賓,644000)

酸乳在儲藏、運(yùn)輸、銷售和消費(fèi)過程中,pH值會持續(xù)降低,出現(xiàn)酸味過重、乳清分離等一系列感官品質(zhì)下降的問題,即后酸化現(xiàn)象[1],直接影響酸乳貨架期及乳酸菌的活菌數(shù)量。

對于抗后酸化的研究,目前主要集中在改變加工工藝、基因工程技術(shù)及誘變育種3個方面。通過調(diào)整發(fā)酵酸乳中球菌與桿菌的比例(1.5∶1),能有效地減輕酸乳的后酸化,但易受到其他條件影響,效果不穩(wěn)定[2]。巴氏殺菌或瞬時高溫滅菌技術(shù)是以降低乳酸菌的活菌數(shù)(<106CFU/mL)為代價(jià),抑制乳酸菌利用乳糖發(fā)酵產(chǎn)酸,極大地降低了酸乳的益生功能。研究人員利用載體 pGhost9:ISS1,經(jīng)復(fù)制型轉(zhuǎn)座構(gòu)建保加利亞乳桿菌突變體,得到3株具有抗后酸化能力的保加利亞乳桿菌菌株[3-4],其生物學(xué)性狀穩(wěn)定,回復(fù)突變率低,但外源DNA轉(zhuǎn)化困難且存在應(yīng)用困境。

誘變育種是目前選育抗后酸化菌株最為有效的途徑,包括物理誘變、化學(xué)誘變、原生質(zhì)體融合等。韓雪等[5]采用紫外線對保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌進(jìn)行誘變處理,得到低溫敏感型突變菌株,能有效抑制酸乳的后酸化,但存在可見光修復(fù)問題,最適條件有待進(jìn)一步研究。羅紅霞等[6]對乳酸菌進(jìn)行原生質(zhì)體融合,利用青霉素進(jìn)行篩選,獲得2株在貯藏過程中后酸化程度明顯減弱的菌株,但融合子的不穩(wěn)定性、雜種細(xì)胞間的異源基因相互排斥等問題仍有待解決。利用新霉素對保加利亞乳桿菌進(jìn)行誘變,可篩選出H+-ATPase弱化菌株,當(dāng)酸度超過閾值時,乳酸菌產(chǎn)酸能力顯著下降[7]。此外,將紫外線誘變和1.5%硫酸二乙酯復(fù)合誘變結(jié)合,突變菌株能抗酸乳后酸化[8]。

研究認(rèn)為,H+-ATP酶活性與轉(zhuǎn)運(yùn)H+能力有關(guān),H+-ATPase弱化菌株的本質(zhì)是酸敏菌株[7],即在正常的酸度下H+-ATPase正常行使其功能,保持乳酸菌的耐酸性；當(dāng)酸度超過閾值時H+-ATPase酶活性顯著弱化,乳酸菌產(chǎn)酸能力則顯著下降。

本研究采用常壓室溫等離子體(atmospheric and room temperature plasma,ARTP)[9]對菌株進(jìn)行誘變處理,結(jié)合新霉素篩選得到低H+-ATP酶活性突變株,測定突變菌生長特性并進(jìn)行酸奶發(fā)酵實(shí)驗(yàn),以期得到具有抗后酸化能力的菌株。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei) B15由新疆特殊環(huán)境微生物實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保藏。

1.1.2 試劑與培養(yǎng)基

新霉素、PCR Master Mix擴(kuò)增試劑盒、Bradford蛋白檢測試劑盒、溶菌酶、Na2ATP、HCl、鉬酸銨、H2SO4、甲苯、Na2SO3、對甲基氨基苯酚,生工生物工程(上海)股份有限公司；MRS瓊脂、MRS肉湯,青島海博生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ARTP-II誘變系統(tǒng),無錫源清天木生物科技有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PCR儀,美國Bio-Rad；pH計(jì),德國Sartoris；Fresco17離心機(jī),Thermo Fisher Scientific Inc.；電泳儀、凝膠成像系統(tǒng),北京六一生物科技有限公司；分光光度計(jì),上海科華生物工程有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 ARTP誘變

將L.paracaseiB15接種至MRS肉湯中進(jìn)行活化與擴(kuò)大培養(yǎng),離心收集對數(shù)生長期的菌體,根據(jù)已有研究[10-11],將菌體稀釋為5×106CFU/mL后進(jìn)行ARTP誘變。將10 μL菌懸液均勻涂布于金屬板上,放置在ARTP誘變系統(tǒng)樣品處理室,與氣流端口間距調(diào)整到2 mm[12]。ARTP的工作參數(shù)如下：射頻功率輸入100 W；工作氣體純氦的流量10 L/min[13]。在控制上述條件的情況下,設(shè)置對照組,將涂有菌懸液的金屬板以不同處理時間(0、10、15、20、30、45、60、90 s)暴露在處理端口下。結(jié)束誘變后,用無菌生理鹽水洗脫樣品,再以梯度稀釋方法將不同濃度的懸液涂布于MRS瓊脂平板上,從而測定ARTP誘變劑量。對照組和實(shí)驗(yàn)組均將在37 ℃培養(yǎng)48 h,致死率按公式(1)計(jì)算:

(1)

式中：S,對照培養(yǎng)基上的單菌落數(shù)；M,每個處理組培養(yǎng)基上的菌落數(shù),單位均為菌落形成單位(colony formal units,CFUs)[14]。

1.3.2 突變菌株的篩選

選擇85%致死率對應(yīng)的時間(30 s)作為ARTP誘變處理時間[15],將處理后的菌株同樣使用梯度稀釋法進(jìn)行稀釋。將稀釋后的懸液(100 μL)涂布在添加了不同質(zhì)量濃度新霉素(100、200、300、400、500 mg/L)MRS瓊脂平板上,而未添加新霉素MRS瓊脂平板則作為空白對照。在相同條件下(37 ℃,48 h)培養(yǎng),記錄單菌落數(shù),陽性篩選率按公式(2)計(jì)算:

(2)

式中：S′,不含新霉素的對照組MRS瓊脂平板菌落計(jì)數(shù)；M′,不同濃度新霉素MRS瓊脂平板單菌落數(shù)。

選擇陽性篩選率50%以上的平板所對應(yīng)的新霉素濃度作為突變菌株的篩選條件,將從MRS瓊脂平板上獲得的突變菌株接種于MRS肉湯(3 mL)中,進(jìn)行下一步的篩選和驗(yàn)證。通過篩選獲得的菌株在-80 ℃超低溫冰箱進(jìn)行保存。

1.3.3 初步篩選具有抗后酸化潛力的突變株

1.3.3.1 生長狀況和pH值測定

將篩選得到的突變株和對照組均接種于同樣培養(yǎng)條件下的MRS肉湯中,接種量3%,37 ℃培養(yǎng)24 h,每隔2 h取樣1次,測定OD660 nm與pH值的變化。

1.3.3.2 H+-ATP酶的提取與活性測定

將對照組與突變株均接種到MRS肉湯(3 mL)中進(jìn)行活化,37 ℃下培養(yǎng)48 h,將菌液(10 mL)離心(8 000 r/min,10 min,4 ℃)后棄上清液,加入50 μL甲苯和500 μL含10 mmol/L MgSO4溶液的Tris-HCl緩沖液,37 ℃靜置5 min后在-80 ℃冷凍2 h。重復(fù)完成凍融操作后9 000 r/min離心10 min,重懸溶液后再次加入400 μL Tris-HCl緩沖液[16]。

按照H+-ATP酶活性檢測試劑盒測定方法,將50 μL Na2ATP(0.1 mol/L)加入酶提取液中開始反應(yīng),37 ℃條件下,靜置20 min,加入600 μL HCl(0.1 mol/L)終止反應(yīng)。將溶液置于冰浴中進(jìn)行冷卻,離心(6 000 r/min,4 ℃,10 min)后收集上清液。加入2.0 mL著色劑30 min后測定OD660 nm,得到磷含量[17]。本實(shí)驗(yàn)中蛋白定量測定采用Bradford蛋白檢測試劑盒進(jìn)行檢測。H+-ATP酶活性以U/mg表示,即每個活性單位U定義為1 mg H+-ATP酶粗提物在1 min內(nèi)將ATP分解成1 mol無機(jī)磷酸鹽[18-19]。

1.3.4 突變株的抗后酸化特性驗(yàn)證

將篩選得到的具有抗后酸化潛力的突變株活化后接種于MRS肉湯(3 mL)中,37 ℃培養(yǎng)24 h。將1 mL菌液接種于相同條件下的MRS肉湯(300 mL)中,擴(kuò)增培養(yǎng)48 h。取30 mL培養(yǎng)液,5 000 r/min離心10 min后棄上清液,重懸于30 mL磷酸緩沖溶液(PBS,pH 7.4)。菌體和PBS以1∶1的比例制備菌懸液,放入4 ℃環(huán)境下進(jìn)行保存。

全脂牛奶(100 mL)在42 ℃下預(yù)熱,加入制備好的菌懸液(5×106CFU/mL)進(jìn)行接種,攪拌均勻后42 ℃培養(yǎng)至完全凝乳。發(fā)酵完成后4 ℃進(jìn)行貯藏。

測定發(fā)酵0、1、5、10、15、20 d的發(fā)酵乳pH值和酸度的變化[20]。pH的變化將直接使用精密pH計(jì)(±0.01)在室溫條件下進(jìn)行測定。酸度則選擇國標(biāo)法(GB 5009.239—2016)進(jìn)行檢測：將10.0 g的發(fā)酵乳樣品與20.0 mL蒸餾水和2.0 mL的酚酞乙醇(0.5%)混合均勻,使用NaOH(0.100 mol/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定,指示反應(yīng)終點(diǎn)為微紅并30 s內(nèi)不褪色[21]。記錄整個反應(yīng)過程中NaOH標(biāo)準(zhǔn)滴定液的消耗量(mL)。發(fā)酵乳的酸度計(jì)算如公式(3)所示:

(3)

式中：c,NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度,mol/L；V1,滴定過程中消耗的NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL；V0,空白實(shí)驗(yàn)所消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積,mL；m,發(fā)酵乳樣品的質(zhì)量,g。常數(shù)0.1為酸度理論定義的NaOH摩爾濃度,單位為mol/L[22-23],即滴定酸度(°T)為發(fā)酵牛奶消耗的0.100 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積。

1.3.5 突變株遺傳穩(wěn)定性

將突變株接種至MRS肉湯(5 mL)中,于37 ℃下培養(yǎng)18 h進(jìn)行活化。將活化菌株在MRS肉湯中連續(xù)傳代9次,37 ℃下培養(yǎng)24 h。12 ℃下儲藏6 d,檢測pH值和酸度兩項(xiàng)指標(biāo)的變化以確定突變株是否具有遺傳穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP誘變處理時間的確定

根據(jù)ARTP誘變的操作原理,處理時間是達(dá)到劑量依賴性致死率的關(guān)鍵因素[24]。L.paracaseiB15致死率如圖1所示,當(dāng)輻照時間達(dá)到45 s時,菌株的致死率為96%；當(dāng)ARTP誘變時間延長至60 s以上后,細(xì)胞的致死率約為99%。

圖1 L.paracasei B15在ARTP不同處理時間下的致死率Fig.1 Lethality rate of L.paracasei B15 under different mutagenic time of atmospheric and room temperature plasma treatment(ARTP)

根據(jù)已有的研究,當(dāng)ARTP誘變的致死率在90%左右時,陽性誘變率較之其他致死率對應(yīng)的處理時間下明顯更高[25-26]。因此,選擇87%致死率對應(yīng)的30 s作為ARTP誘變的最佳處理時間。

2.2 抗后酸化突變菌株的篩選

2.2.1 新霉素篩選突變菌株

基于新霉素對高H+-ATP酶活性菌株的抑制作用,本實(shí)驗(yàn)將不同濃度的新霉素溶液加入MRS瓊脂平板作為選擇培養(yǎng)基。將可在平板上生長的菌株記錄為陽性菌株,通過設(shè)置不添加新霉素的空白對照組進(jìn)行陽性篩選和概率計(jì)算。當(dāng)新霉素質(zhì)量濃度為300 mg/L時,陽性率最高可達(dá)62%(圖2)。以往的研究表明,聯(lián)合誘變處理的突變率和陽性突變率高于單處理誘變[27]。因此,在ARTP誘變的基礎(chǔ)上,向MRS瓊脂平板中添加300 mg/L新霉素可以認(rèn)定是篩選H+-ATP酶活性較低的突變菌株的合適方法。

圖2 不同濃度新霉素下陽性突變株篩選率Fig.2 Effects of mutagenesis on positive survival rate in candidate strains with different concentration of neomycin

2.2.2 抗后酸化突變菌株生長特性和H+-ATP酶活性

通過ARTP誘變結(jié)合300 mg/L新霉素篩選,共獲得7株突變株,其對數(shù)生長期均出現(xiàn)在培養(yǎng)8 h后,晚于對照組2 h左右(圖3)。突變株BJT-5、BJT-6和BJT-7的生長速率明顯降低,穩(wěn)定期的生物量是其他菌株的1/2左右。

圖3 B15及突變株的生長曲線Fig.3 Growth curves of B15 and mutants during culture period

突變菌株培養(yǎng)8 h后,培養(yǎng)基pH值出現(xiàn)快速下降(圖4),與圖3中菌株對數(shù)生長期的時間一致,即菌體的代謝旺盛時期,代謝產(chǎn)物產(chǎn)物的迅速積累造成pH值的快速下降。突變株BJT-7在培養(yǎng)10 h后,pH值趨于穩(wěn)定,最低為4.74,pH值變化最小,有較強(qiáng)的抗后酸化能力。

圖4 B15及突變株在培養(yǎng)階段pH的變化Fig.4 pH of B15 and the mutants during culture period

如圖5所示,突變菌株的H+-ATP酶活性均低于對照組的原始菌株。突變菌株BJT-7的H+-ATP酶活性最低,為0.57 U/mg,對照組原始菌株的H+-ATP酶活性是BJT-7的3.09倍。由此推測,菌株生長能力可能與H+-ATP酶活性有關(guān),突變株H+-ATP酶活性的降低,降低了菌株底物的磷酸化水平,導(dǎo)致ATP產(chǎn)量下降,生長速率降低,產(chǎn)酸能力降低,這與已有研究結(jié)果一致[28]。結(jié)果表明,ARTP聯(lián)合新霉素的篩選方法能夠有效篩選出H+-ATP酶活性較低的菌株。

圖5 突變株與B15的H+-ATP酶活性Fig.5 The H+-ATPase activity of the mutants and B15

2.3 突變菌株抗后酸化能力的驗(yàn)證

在全脂牛乳中接種菌懸液進(jìn)行發(fā)酵(37 ℃,48 h),待完全凝乳后測定4 ℃冷藏下發(fā)酵乳的pH值及酸度。圖6表明,各突變株處理組1 d內(nèi)pH變化均不明顯,對照組稍有下降。

圖6 發(fā)酵乳pH變化曲線Fig.6 pH of fermented milk during storage

1～10 d,均為各處理pH值下降最快的時期,其中對照組變化幅度達(dá)到0.67,BJT-7變化幅度最小,為0.23。20 d時,對照組pH最低,為3.79,BJT-7的pH值最高,為4.27。

由圖7可知,對照組的酸度在儲存期間始終在上升,至20 d達(dá)到88 °T左右。突變株BJT-5和BJT-6在0～5 d期間酸度變化較小,5～10 d出現(xiàn)酸度增長的對數(shù)期,但后續(xù)酸度增加趨緩。突變株BJT-7在整個存儲過程中酸度變化幅度最小,20 d時酸度為73 °T。隨著各處理組pH值的下降,其酸度相應(yīng)上升。

圖7 發(fā)酵乳酸度變化曲線Fig.7 The acidity curve of fermented milk during storage

通過ARTP結(jié)合新霉素篩選能夠得到儲藏期間無明顯酸度上升或延遲出現(xiàn)較大酸度變化的菌株,即能夠得到具有抗后酸化特性的菌株。

2.4 突變菌株遺傳穩(wěn)定性

將突變株BJT-7在MRS培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)9代,在12 ℃條件下儲藏6 d,測定其pH和滴定酸度,結(jié)果表明菌株BJT-7具有較好的穩(wěn)定遺傳性(表1)。

表1 BJT-7菌株遺傳穩(wěn)定性Table 1 Genetic stability of BJT-7

3 結(jié)論

本文采用ARTP誘變處理結(jié)合新霉素篩選,獲得7株L.paracasei突變菌株,其中菌株BJT-7經(jīng)全脂牛乳發(fā)酵在20 d儲藏期間幾乎無明顯酸度上升,且酸度低于70 °T,具有較好的遺傳穩(wěn)定性,為獲得抗后酸化能力強(qiáng)的酸乳發(fā)酵菌株提供了新方法。