郝莉花,賈利平

1(河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗院,河南 鄭州,450047) 2(河南省食品安全數(shù)據(jù)智能重點實驗室,河南 鄭州,450047)

氟蟲腈是一種高活性的苯基吡唑類殺蟲劑[1]。氟蟲腈在雞蛋中殘留可能的原因主要是在家禽飼養(yǎng)過程中,飼養(yǎng)人員違規(guī)使用了氟蟲腈來防治跳蚤、虱子等有害生物[2],或使用了受氟蟲腈污染的飼料,導致氟蟲腈通過母體遷移并蓄積在雞蛋中。

氟蟲腈是目前水稻上使用的主要殺蟲劑之一,具有良好的殺蟲效果。但該農(nóng)藥及其代謝物在水和土壤中降解緩慢[3-4],對水生生物、家蠶、蜜蜂等都具有較強的毒性,對生態(tài)環(huán)境造成一定的影響。動物研究表明,氟蟲腈在生殖發(fā)育毒性、慢性毒性、神經(jīng)毒性和致癌性實驗方面均有一定的不良作用[5]。各國陸續(xù)限制其使用,并規(guī)定了氟蟲腈在食品中的最大殘留量[6-7],其中歐盟規(guī)定氟蟲腈和氟蟲腈砜總計的最大殘留限量值僅為0.005 mg/kg[8]；國際食品法典委員會(Codex Alimentarius Commission,CAC)規(guī)定禽蛋中氟蟲腈的最大殘留限量值為0.02 mg/kg,禽肉中則為0.01 mg/kg[8]。2009年我國農(nóng)業(yè)部公告第1157號[9]規(guī)定自2009年10月1日起,除衛(wèi)生用殺蟲劑、玉米等部分旱田種子包衣劑外,在我國境內(nèi)停止銷售和使用用于其他方面的含氟蟲腈成分的農(nóng)藥制劑。GB 2763—2021[10]《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定：氟蟲腈在玉米及鮮食玉米中最大殘留量不得超過0.1 mg/kg,在谷物、油料和油脂、蔬菜、水果、糖類和食用菌中最大殘留限量不得超過0.02 mg/kg；但對雞蛋中氟蟲腈最大殘留限量沒有規(guī)定。

2017年7月，比利時食品安全監(jiān)管部門在雞蛋中檢出氟蟲腈及其代謝產(chǎn)物，成為第一個向歐盟食品安全警戒系統(tǒng)通報“毒雞蛋”事件的歐洲國家。同年8月，荷蘭、德國等歐洲16國及韓國等地更是爆出大規(guī)模氟蟲腈污染雞蛋的食品安全事件，造成惡劣影響。自此，有關雞蛋中氟蟲腈再次引起人們的高度關注。GB 2763—2021[11]《食品安全國家標準 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了氟蟲腈在蛋類中的最大殘留量殘留限量為 0.02 mg/kg，標志殘留物為氟蟲腈、氟甲腈、氟蟲腈亞砜和氟蟲腈砜。指定檢驗方法為GB 23200.115—2018[12]《食品安全國家標準 雞蛋中氟蟲腈及其代謝物殘留量的測定 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法》，因其使用的儀器為液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，對儀器設備的要求比較高，不利于方法在基層檢驗機構的廣泛推廣。近年來，關于雞蛋中的氟蟲腈的方法研究，大多采用質(zhì)譜分析上，如采用氣相色譜-質(zhì)譜法[13-14]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[15-16]，對于采用成本較低的氣相色譜儀的研究較少。

在前處理方法上，由于雞蛋基質(zhì)本身成分復雜，含有多種雜質(zhì)而不能直接檢測氟蟲腈及其代謝物[17-18]，QuEChERS凈化具有快速(Quick)、簡單(Easy)、廉價(Cheap)、有效(Effective)、可靠(Rugged)及安全(Safe)的優(yōu)點，是目前大部分農(nóng)獸藥殘留量常用的前處理方法之一[19]，該法可較好地應用于零脂肪或低脂肪樣品(如：牛奶、雞蛋、蔬菜和水果等)的農(nóng)獸藥殘留檢測。

本研究通過對分散固相萃取凈化材料及其配比的優(yōu)化，采用氣相色譜法檢測，以期得到一種有效降低或消除雞蛋中蛋白、脂肪等基質(zhì)干擾，并具有分析速度快、檢測成本較低、對儀器要求較低等優(yōu)勢的雞蛋中氟蟲腈及其代謝物測定的方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與設備

7890A氣相色譜儀(配有ECD檢測器)、HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),安捷倫科技有限公司；FA2004 N電子天平,上海箐海儀器有限公司；B-400均質(zhì)機,瑞士步琪有限公司；QL-866渦旋混合器,Vortex Mixer公司。

1.2 試劑與材料

氟蟲腈標準物質(zhì)(純度均≥99%),德國Dr·Ehrenstorfer公司；乙腈(色譜純),德國Merck公司；氯化鈉、無水硫酸鈉(分析純),天津市永大化學試劑有限公司。

雞蛋：市售。

1.3 儀器參數(shù)

HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm,Agilent,美國)；進樣口溫度280 ℃；進樣方式：不分流進樣；升溫程序：初始溫度60 ℃,保持2 min,以10 ℃/min升溫至240 ℃,保持2 min；進樣量1 μL；載氣：氮氣；載氣流速1 mL/min(恒流)。

1.4 標準溶液的配制

1.4.1 標準儲備溶液

取100 mg/L的氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標準物質(zhì)溶液,用乙腈做溶劑配制成質(zhì)量濃度均為10 mg/L的氟甲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈、氟蟲腈亞砜標準儲備液,儲存于-18 ℃冰箱待用。

1.4.2 標準使用溶液

分別準確吸取氟甲腈、氟蟲腈、氟蟲腈砜、氟蟲腈亞砜標準儲備溶液50、100、200、500、800 μL以及1、2 mL至100 mL容量瓶中,用溶劑定容,配制成質(zhì)量濃度0.005、0.01、0.02、0.05、0.08、0.1、0.2 g/L的混合標準溶液。

1.5 樣品制備與前處理

1.5.1 樣品制備

空白樣品：取獸殘陰性樣品雞蛋約1 000 g,洗凈去殼,用組織均漿機充分攪拌均勻,置于聚乙烯瓶中備用。

0.5 mg/kg加標樣品：稱取空白樣品100 g,準確加入1.4.1中配制的10 mg/L混合標準儲備液5 mL,均質(zhì),配制成0.5 mg/kg的加標樣品。

1.5.2 樣品前處理

方法1(不凈化)：稱取2 g樣品于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,加入2 g NaCl,渦旋振蕩1 min,在6 000 r/min條件下離心5 min,上清液過0.22 μm有機膜,待測。

方法2(Prime HLB凈化)：稱取2 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入8 mL含0.2%甲酸的80∶20(mL∶mL)乙腈/水溶液,渦旋振蕩2 min,超聲10 min,在12 000 r/min條件下冷凍離心5 min,取3 mL上清液過Prime HLB柱子,然后收集1 mL濾液過0.22 μm有機膜,待測。

方法3(QuEChERS凈化)：稱取2 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL乙腈,渦旋振蕩2 min,超聲10 min,再加入2 g NaCl,6 g Na2SO4,渦旋振蕩1 min,在6 000 r/min條件下離心3 min,取1 mL上清液在2 mL離心管中,并加入50 mg的乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(ethylenediamine-N-propylsilylated silica gel，PSA),50 mg的C18,150 mg的MgSO4,渦旋振蕩1 min,6 000 r/min條件下離心3 min,上清液過0.22 μm有機膜,待測。

方法4(HLB凈化)：稱取2 g均質(zhì)樣品于50 mL離心管中,加入10 mL(0.1 mL/L)的EDTA-MCLLVAINE緩沖液,渦旋振蕩2 min,超聲10 min,在10 000 r/min條件下冷凍離心5 min,取上清液備用,再加入10 mL(0.1 mL/L)的EDTA-MCLLVAINE緩沖液,渦旋振蕩2 min,超聲10 min,在10 000 r/min條件下冷凍離心5 min,合并2次提取液,取2 mL提取液過HLB柱子(預先用6 mL甲醇6 mL水活化),然后加入2 mL的5%甲醇淋洗液淋洗,2 mL甲醇溶液洗脫,氮吹吹干后用乙腈定容到1 mL,過0.22 μm有機膜,待測。

1.6 基質(zhì)效應計算

方法基質(zhì)效應按照公式(1)[20]計算：

(1)

式中：ME,前處理過程總基質(zhì)效應,%；SA,目標化合物在純?nèi)軇┗|(zhì)中檢測的峰面積；SB,目標化合物經(jīng)過前處理后處理液基質(zhì)中檢測的峰面積。

2 結果與分析

2.1 色譜柱選擇

目前,在國內(nèi)市場上銷售的商品GC毛細管色譜柱的生產(chǎn)廠家主要有安捷倫公司(Agilent)、奧泰公司(Alltech)、瑞斯泰克公司(Restek)、SGE公司、薩帕克公司(Supelco)等。在這些廠家生產(chǎn)的毛細管色譜柱中以含5%苯基和95%二甲基聚硅氧烷固定相的中等極性色譜柱(HP-5、HP-5MS、DB-5、DB-5MS等)較為常見,其次是100%二甲基聚硅氧烷的固定相的弱極性色譜柱(HP-1、HP-1MS、DB-1、DB-1MS、Rtx-1MS等)和聚乙二醇固定相的極性色譜柱,這些色譜柱的尺寸多為標準型(30 m×0.25 mm×0.25 μm)[27-28]。本實驗根據(jù)氟蟲腈的結構和化學性質(zhì)選取實驗室常用的4種色譜柱,即HP-5、DB-5、DB-1701、DB-1進行上機測定實驗,進樣質(zhì)量濃度為0.000 5 μg/mL的氟蟲腈工作液,通過比較氟蟲腈色譜峰對稱因子、信噪比和保留時間確定最佳色譜柱,結果詳見表1。

表1 氟蟲腈色譜峰參數(shù)Table 1 Chromatographic peak parameters of fipronil

由表1可知,HP-5的對稱因子為0.88,說明氟蟲腈標準品在色譜柱HP-5的峰形較其他3種色譜柱好,其信噪比為7,儀器檢出限為0.000 2 μg/mL,說明氟蟲腈標準品在色譜柱HP-5上通量高,能夠獲得最低的檢出限；在相同進樣濃度條件下,氟蟲腈在HP-5上有較長的保留時間,可降低低沸點雜質(zhì)的干擾。綜上分析,本實驗采用HP-5彈性石英柱。

配制0.2 μg/mL氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜標準品,采用HP-5彈性石英柱分離檢測,4種化合物在色譜柱上基線分離,出峰效果好,色譜圖見圖1。

圖1 氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜色譜圖Fig.1 Chromatograms of fluorocarbonitrile,fipronil sulfoxide,fipronil and fipronil sulfone

2.2 凈化方式選擇

有關凈化方式已有較多的文獻研究[21]。本研究比較QuEChERS凈化、Prime HLB固相萃取柱凈化和HLB固相萃取柱凈化方式,以確定一種更合適的凈化方式。稱取1.5.1中0.5 mg/kg加標樣品,按照1.5.2所述4種方法處理,經(jīng)1.3條件檢測,數(shù)據(jù)按照1.6分析,每組實驗重復2次,以平均值計,結果見表2。

表2 三種凈化方法的總基質(zhì)效應 單位：%

由表2可以看出,未凈化的基質(zhì)產(chǎn)生基質(zhì)效應顯著,4種化合物ME為68.0%～92.3%,發(fā)生了“基質(zhì)誘導色譜響應減弱現(xiàn)象”[29]。經(jīng)過凈化后ME升高并接近100%,Prime HLB凈化后ME為82.8%～120.1%,平均值102.8%,差值37.3%,QuEChERS凈化后ME為76.6%～111.9%,平均值94.1%,差值35.3%,HLB凈化后ME為102.2%～143.5%,平均值125.0%,差值41.3%。QuEChERS凈化后4種化合物ME差值最小,結果集中,平均值94.1%,接近100%。此外,QuEChERS操作步驟簡單,容易獲得較高回收率和較好重現(xiàn)性,因此本研究采用QuEChERS凈化方法。

2.3 線性范圍、檢出限

本研究在優(yōu)化氣相色譜條件下,能較好地分離樣品中的氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜。采用HP-5色譜柱分離,QuEChERS凈化,外標法定量。結果表明,氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜分別在線性范圍0.005～0.2 μg/mL內(nèi),回歸方程的相關系數(shù)R2均>0.999,線性較好。4種化合物的標準曲線圖見圖2。

a-氟甲腈;b-氟蟲腈亞砜;c-氟蟲腈;d-氟蟲腈砜圖2 四種化合物的標準曲線圖Fig.2 Standard curves of four compounds

以氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜呈陰性的雞蛋為樣品在定量限、標準曲線中點和標準曲線最高點進行加標回收實驗,即樣品加標濃度0.025、0.4、1.0水平下進行加標回收實驗,進行準確度和精密度測試,每個水平平行實驗6次(n=6),準確度以回收率表示,精密度以相對標準偏差(relative standard deviation,RSD)表示。

表3 三種加標濃度下氟甲腈、氟蟲腈亞砜、氟蟲腈和氟蟲腈砜的回收率及相對標準偏差Table 3 Recoveries and relative standard deviations of fluorocarbonitrile,fipronil sulfoxide,fipronil and fipronil sulfone at the three spiked concentrations

從表3中可知,氟甲腈加標回收率為88.8%～99.3%,RSD在1.22%～4.04%,氟蟲腈亞砜加標回收率為96.8%～104.7%,RSD在0.86%～4.71%,氟蟲腈加標回收率為91.5%～115.1%,RSD在3.09%～5.22%,氟蟲腈砜加標回收率為100.1%～106.1%,RSD在0.93%～2.04%,氟蟲腈及其代謝物的總加標回收率為88.8%～115.1%,RSD在0.86%～5.22%。本研究采用的方法其精密度和準確度滿足雞蛋中氟蟲腈及代謝物殘留檢測的要求。

3 結論

本研究通過對3種常見的凈化方式進行對比選擇后,采用氣相色譜法檢測,試樣經(jīng)QuEChERS凈化,有效降低或消除雞蛋中蛋白質(zhì)、脂肪等基質(zhì)干擾,采用該方法4種氟蟲腈及其代謝物的檢出限均為0.01 mg/kg,平均回收率為88.8%～115.1%,RSD為0.86%～5.22%。與其他方法相比,該研究具有操作簡單、分析速度快、經(jīng)濟成本低等優(yōu)勢,可應用于雞蛋中氟蟲腈的檢測分析,并適合廣泛推廣。