周維海 李煥華 梁子茂 潘韋情 梁江洪

1.廣西科康科技集團有限公司，廣西 南寧 530007；2.廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院,廣西 南寧 530001

水蛭，俗稱螞蟥，而螞蟥唾液腺分泌的水蛭素，則是當今世界上發(fā)現(xiàn)的抗凝血酶活性最高的天然物質(zhì)，從而注定了其與醫(yī)藥領(lǐng)域有著密切的淵源。

人類在醫(yī)療發(fā)展進程中應(yīng)用水蛭的歷史可追溯到古埃及、古羅馬和古希臘時期。法國外科醫(yī)生Francois Broussais(1772～1838)于19世紀初將水蛭吸血應(yīng)用于人體治療而引起轟動，2004年8月，法國Ricarimpex公司飼養(yǎng)的水蛭獲得美國FDA醫(yī)用許可證及國際ISO9001認證[1]。經(jīng)現(xiàn)代藥理學研究[2]表明，吸血水蛭在吸吮血液分泌的唾液里含有許多復(fù)合狀態(tài)的生物活性成份，主要為天然水蛭素，它是一種小分子單鏈多肽，是顯著并專一的凝血酶特異性抑制劑，也是迄今為止人類發(fā)現(xiàn)的最強的抗凝血天然物質(zhì)，且引起出血的副作用較小。另外還有抑菌成分、鎮(zhèn)痛成分、抗血栓、抗腫瘤等等。俄羅斯國家衛(wèi)生部也已正式批準部分水蛭類藥物可用于冠心病等的臨床治療[1]。

在中國，水蛭活體療法及入藥使用也見諸多部典籍，如《本草拾遺》、《神農(nóng)本草經(jīng)》、《千金方》等等均有外治癰疽痞腫，內(nèi)治血瘀經(jīng)閉的作用[3]。水蛭生物療法又稱“蜞針療法”，在廣西等壯民族地區(qū)，人們稱為“壯醫(yī)水蛭治療”或“壯醫(yī)水蛭活體療法”，主要是采用生長于本地、也是我國古代用于臨床治療主要品種之一的“金邊螞蟥”(菲牛蛭)在人體的特定穴位上進行叮咬吸血、并分泌水蛭素等活性物質(zhì)而達到治病的目的[7]。2011年，金邊螞蟥(菲牛蛭)作為廣西特色藥用動物資源被收錄于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標準》第二卷[8]；2013年被收錄于《云南省中藥材標準》[9]。近年來，由于“壯醫(yī)水蛭活體療法”簡、便、驗、廉的特點，其運用越來越廣泛，主要涉及痛癥、類風濕性關(guān)節(jié)炎、痛風急性發(fā)作、外科術(shù)后、皮膚病等，廣西壯族自治區(qū)已將其列入民族醫(yī)醫(yī)療服務(wù)項目[6]。因此，對于治療用的活體水蛭的需求量越來越大，質(zhì)量要求也越來越高。而在我國，該領(lǐng)域的相關(guān)標準尚屬空白，鑒于此，為了配合完成廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院承擔的“活體水蛭療法治療肌筋膜炎的臨床研究”(編號：Z20180119)課題，廣西科康科技集團有限公司在菲牛蛭養(yǎng)殖、凈化及天然水蛭素提取二十多年耕耘的基礎(chǔ)上，進一步從各階段梳理優(yōu)化菲牛蛭凈化流程，形成專供“壯醫(yī)水蛭活體療法”人體治療的菲牛蛭活體四級凈化相關(guān)標準或指標，填補國內(nèi)“醫(yī)用水蛭”標準的空白。

1 “壯醫(yī)水蛭活體療法”治療用水蛭四級凈化流程規(guī)范

在普通藥用水蛭養(yǎng)殖標準的基礎(chǔ)上，必須經(jīng)過一、二、三、四級凈化，經(jīng)第三方專業(yè)機構(gòu)對相關(guān)病原微生物的檢驗合格后，方能作為“醫(yī)用水蛭”用于患者身體進行活體治療。

本流程主要適用于廣西科康科技集團有限公司提供給廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院承擔的“活體水蛭療法治療肌筋膜炎的臨床研究”(編號：Z20180119)課題及所有使用于人體治療的活體菲牛蛭的凈化養(yǎng)殖過程。該公司生產(chǎn)的治療用活體菲牛蛭依次嚴格經(jīng)過以下4個等級的養(yǎng)殖周期總共4個月的凈化養(yǎng)殖，最后經(jīng)第三方檢測不含有特定的病原微生物和寄生蟲。

本流程主要對菲牛蛭的成蟲選擇、場地、環(huán)境、包括溫度、空氣、水質(zhì)以及凈化養(yǎng)殖的技術(shù)要求、養(yǎng)殖周期、質(zhì)量控制、衛(wèi)生檢測等方面進行規(guī)范化、標準化認定。分階段描述如下。

1.1 一級凈化 只經(jīng)過一級凈化養(yǎng)殖的活體水蛭還不能用于水蛭活體治療，必須輸送到第二級凈化養(yǎng)殖室繼續(xù)進行凈化養(yǎng)殖。

1.1.1 活體成蟲選擇 挑選本公司陸川養(yǎng)殖場按“廣西菲牛蛭規(guī)范化養(yǎng)殖標準操作規(guī)程(sop)”[4]養(yǎng)殖、繁育二代以上的菲牛蛭(金邊螞蟥)健康成蟲，體重4～8 g。

1.1.2 養(yǎng)殖環(huán)境 場地： 符合養(yǎng)殖環(huán)保要求的室內(nèi)飼養(yǎng)池。單池內(nèi)空：2 m(長)×1 m(寬)×0.15 m(深)， 貼白色瓷磚，設(shè)獨立給排水和防逃設(shè)施；室內(nèi)門窗完好，有防蟲紗網(wǎng)，有強制通風設(shè)施； 溫度：室內(nèi)溫度控制在17～32 ℃； 空氣：保持空氣自然流通、無污染，室內(nèi)無異常臭味；水質(zhì)：100 m深以下地下水源，PH值6～8(呈中性)，含鹽量小于4%，溶氧量 1 mL/L以上；噪音：養(yǎng)殖場地禁止高聲喧嘩、機車馬達等噪音；光線： 避免陽光直射，盡量創(chuàng)造黑暗環(huán)境。

1.1.3 養(yǎng)殖技術(shù)要求 放養(yǎng)前準備： 放養(yǎng)前5～10 d干池并進行消毒處理，用20～40 ppm漂白粉或7～13 ppm強氯精消毒養(yǎng)殖池及其周圍環(huán)境。放養(yǎng)前2天水池先注水；養(yǎng)殖密度： 500～600條/平米；換水頻率： 溫度不同可以分為幾種情況如表1。

表1 一級凈化不同環(huán)境溫度換水頻率

換水之前應(yīng)將水蛭和飼養(yǎng)池里面的排泄物用水清洗干凈，避免雜質(zhì)的殘留；投喂：整個養(yǎng)殖周期不喂食，待其體內(nèi)雜物自然排泄凈化；監(jiān)察：養(yǎng)殖周期中每天至少進行2次巡檢，發(fā)現(xiàn)有病、死或體型不符合4～8 g范圍者要及時檢出并妥善處理。本養(yǎng)殖周期內(nèi)不能中途補充新的水蛭到養(yǎng)殖池內(nèi)；養(yǎng)殖周期：30 d；質(zhì)控檢測：外觀性狀健康正常，體長直，體長8～16 cm。進入下一環(huán)節(jié)凈化養(yǎng)殖；記錄表：做臺賬記錄，分工作記錄和工作報表(報表另印)。內(nèi)容包括巡回檢查、清洗換水、生長情況、病死情況、現(xiàn)場環(huán)境狀況(溫度、濕度、空氣質(zhì)量等)，所飼養(yǎng)的水蛭做到分批登記，可追溯來源去向。

1.1.4 飼養(yǎng)員要求 飼養(yǎng)員要求身體健康，無傳染性疾病，無外傷，注意個人衛(wèi)生，進入養(yǎng)殖區(qū)域必須穿戴統(tǒng)一的工作服裝。飼養(yǎng)周期內(nèi)采取飼養(yǎng)員負責制，即養(yǎng)殖周期內(nèi)不能換人，飼養(yǎng)員要對本批次養(yǎng)殖負責，是本批次產(chǎn)品質(zhì)量問題的直接追責者。

1.2 二級凈化養(yǎng)殖 經(jīng)過二級凈化養(yǎng)殖的活體水蛭還不能用于水蛭活體治療，必須輸送到第三級凈化養(yǎng)殖室繼續(xù)進行凈化養(yǎng)殖。

1.2.1 活體成蟲選擇 經(jīng)第一級凈化飼養(yǎng)后合格健康的金邊螞蟥(菲牛蛭) ，體重在3～6 g之間。

1.2.2 養(yǎng)殖環(huán)境 同第一級凈化養(yǎng)殖要求。

1.2.3 養(yǎng)殖技術(shù)要求 放養(yǎng)前準備：同第一級凈化養(yǎng)殖；養(yǎng)殖密度：每平方米水面放養(yǎng)400～500條；換水頻率： 溫度不同可以分為幾種情況如下表2。

表2 二級凈化不同環(huán)境溫度換水頻率

投喂 ：整個養(yǎng)殖周期不喂食；監(jiān)察：養(yǎng)殖周期中每天至少進行2次巡檢，發(fā)現(xiàn)有病、死或體型不符合3～6 g范圍者要及時檢出并妥善處理，本養(yǎng)殖周期內(nèi)不能中途補充新的水蛭到養(yǎng)殖池內(nèi)；養(yǎng)殖周期：30 d；質(zhì)控檢測：外觀性狀健康正常，體長直，活力好；記錄表：同第一級養(yǎng)殖凈化要求。

1.2.4 飼養(yǎng)員要求 同第一級養(yǎng)殖凈化要求。

1.3 三級凈化養(yǎng)殖 只經(jīng)過三級凈化養(yǎng)殖的活體水蛭還不能用于水蛭活體治療，必須輸送到第四級凈化養(yǎng)殖室繼續(xù)進行凈化養(yǎng)殖。

1.3.1 活體成蟲選擇 經(jīng)第二級凈化飼養(yǎng)后合格健康的金邊螞蟥(菲牛蛭)，體重2～6 g。

1.3.2 養(yǎng)殖環(huán)境 場所：選擇符合養(yǎng)殖環(huán)保要求的養(yǎng)殖室，安裝冷暖空調(diào)，防蟲、通風設(shè)施等。統(tǒng)一使用5000 mL的專用玻璃凈化養(yǎng)殖瓶飼養(yǎng)。養(yǎng)殖瓶按要求做好標簽統(tǒng)一整齊擺放在專用貨架上； 空氣：保持空氣自然流通、無污染，室內(nèi)無異常臭味；溫度：室溫20～30 ℃；水質(zhì)：同第一級凈化要求；噪音：養(yǎng)殖場地禁止高聲喧嘩、機車馬達等噪音；光線：避免陽光直射，盡量創(chuàng)造黑暗環(huán)境。

1.3.3 養(yǎng)殖技術(shù)要求 養(yǎng)殖容器：5000 mL玻璃瓶，提前5 d用20～40 ppm漂白粉或7～13 ppm強氯消毒，并清洗干凈。放養(yǎng)前2 d養(yǎng)殖瓶先注水；養(yǎng)殖密度：30～50條/瓶；換水頻率：溫度不同可以分為幾種情況如下表3。

表3 三級凈化不同環(huán)境溫度換水頻率

投喂 ：整個養(yǎng)殖周期不喂食；監(jiān)察：養(yǎng)殖周期中每天至少進行2次巡檢，發(fā)現(xiàn)有病、殘及過大過小的應(yīng)檢出妥善處理，中途不能補充新的水蛭到養(yǎng)殖瓶內(nèi)。周期內(nèi)發(fā)現(xiàn)有病死水蛭的，該養(yǎng)殖瓶的水蛭終止凈化養(yǎng)殖并妥善處理；養(yǎng)殖周期：30 d；質(zhì)控檢測：外觀性狀健康正常，體長直，活力好；記錄表：同第一級養(yǎng)殖凈化要求。

1.3.4 飼養(yǎng)員要求 同第一級養(yǎng)殖凈化要求。

1.4 四級凈化養(yǎng)殖 只有經(jīng)過第四級凈化養(yǎng)殖并檢驗合格的活體水蛭才是合格的醫(yī)用水蛭，可以安全用于水蛭活體治療。

1.4.1 活體成蟲選擇 經(jīng)第三級凈化飼養(yǎng)后合格健康的金邊螞蟥(菲牛蛭) ，體重2～5 g。

1.4.2 凈化養(yǎng)殖環(huán)境 場所：選擇符合養(yǎng)殖環(huán)保要求的類GMP實驗生產(chǎn)場所，空氣：潔凈程度達10萬級以上，統(tǒng)一使用5000 mL的專用玻璃凈化養(yǎng)殖瓶飼養(yǎng)。養(yǎng)殖瓶按要求做好標簽統(tǒng)一整齊擺放在專用貨架上；溫度：室溫20～30 ℃；水質(zhì)：100 m深以下地下水源，經(jīng)過RO膜凈化處理，達飲用純凈水要求,PH值呈中性，溶氧量為1 mL/L以上；噪音：養(yǎng)殖場地禁止高聲喧嘩、機車馬達等噪音，室內(nèi)禁用電子電器設(shè)備；光線：避免陽光直射，盡量創(chuàng)造黑暗環(huán)境。

1.4.3 養(yǎng)殖技術(shù)要求 養(yǎng)殖容器：5000 mL玻璃瓶，提前5 d用20～40 ppm漂白粉或7～13 ppm強氯精消毒，并清洗干凈。放養(yǎng)前2天養(yǎng)殖瓶先注水；養(yǎng)殖密度：20～30條/瓶；換水頻率：溫度不同可以分為幾種情況如下表4。

表4 四級凈化不同環(huán)境溫度換水頻率

投喂：同第一級養(yǎng)殖凈化要求，整個周期不投喂；監(jiān)察：每天至少進行2次巡檢，發(fā)現(xiàn)有病、殘及過大過小的應(yīng)檢出妥善處理，中途不能補充新的水蛭到養(yǎng)殖瓶內(nèi)。周期內(nèi)發(fā)現(xiàn)有病死水蛭的，該養(yǎng)殖瓶的水蛭終止凈化養(yǎng)殖并妥善處理；養(yǎng)殖周期 ：30 d；質(zhì)控檢測：外觀性狀健康正常，體長直，體長7～15 cm；記錄表：同第一級養(yǎng)殖凈化要求。

1.4.4 飼養(yǎng)員要求 同第一級養(yǎng)殖凈化要求。

2 病原菌及微生物檢測

廣西科康科技集團有限公司出品的活體治療用菲牛蛭是委托第三方微生物權(quán)威檢測機構(gòu)，對活體進行“沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、大腸埃希氏菌、溶血性鏈球菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特氏菌、致瀉大腸埃希氏菌、銅綠假單胞菌”等九項專業(yè)級檢測，以確保每條菲牛蛭均達到人體治療級別。

3 “治療用菲牛蛭”四級凈化流程簡圖

二代以上人工繁育健康菲牛蛭成蟲→一級凈化養(yǎng)殖(無喂食，500～600條/平方米池養(yǎng)30 d)→二級凈化養(yǎng)殖(無喂食，400～500條/平方米池養(yǎng)30 d)→三級凈化養(yǎng)殖(無喂食，30～50條/5000 mL凈化養(yǎng)殖瓶相對恒溫環(huán)境養(yǎng)30 d)→四級凈化養(yǎng)殖(無喂食，20～30條/5000 mL凈化養(yǎng)殖瓶相對恒溫，10萬級無菌環(huán)境下養(yǎng)殖30 d)→按要求檢驗合格→出品。

4 結(jié)語

“壯醫(yī)水蛭活體療法”是一種外治療法，作為一種侵入性外治療法，其安全性及可操作性是醫(yī)生和患者關(guān)注的重點之一，特別是部分患者在生活過程中曾經(jīng)有過活體水蛭叮咬的經(jīng)歷，會產(chǎn)生比較大的心理恐懼。如何消除患者的心理影響并切實保護患者的生命安全，是治療必須要首先解決的問題。廣西科康科技集團有限公司長期致力于活體水蛭等的研究，而水蛭的凈化養(yǎng)殖是保證臨床活體治療安全的關(guān)鍵所在，所以一定要有科學、規(guī)范的操作規(guī)程。本流程于2016年修訂執(zhí)行，至2018年1月為配合提供給廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院承擔的“活體水蛭療法治療肌筋膜炎的臨床研究”(編號：Z20180119)課題[5]用的菲牛蛭活體而進一步優(yōu)化，并沿用至今，共為廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院、百色市中醫(yī)醫(yī)院、桂林市南溪山醫(yī)院及各級各類診所、中醫(yī)館、工作室等提供科研及治療用菲牛蛭活體約127011條，參與體驗“壯醫(yī)水蛭活體療法”約21168人次，未出現(xiàn)出血、感染、嚴重過敏等不良反應(yīng)?！皦厌t(yī)水蛭治療”等民間療法，綠色環(huán)保、安全可靠，“簡、便、廉、驗”，值得進一步研究推廣。