任維維，吳燁婷，梁宗瑤，李珉夢，魏園園，段旭昌

（西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 陜西楊凌712100）

柿子（Diospyros kakiThunb.）是柿科（Ebenaceae）柿屬（DiospyrosL.）植物，為世界五大重要經(jīng)濟果之一[1]。我國是柿子大國，柿子資源尤為豐富，據(jù)不完全統(tǒng)計，目前約有1 058 個柿子品種，栽培面積占世界的91.15%，產(chǎn)量占世界的73.46%[2-4]。柿子果形多樣，風(fēng)味獨特，成熟柿果香氣馥郁，口感甘甜。柿子作為一種藥食同源的果品，素有潤肺止咳、化瘀止血、清熱敗火、健脾化痰等作用，深受大眾喜愛[5-7]。研究表明，柿果還含有許多營養(yǎng)物質(zhì)，包括多酚類、維生素類、類胡蘿卜素以及膳食纖維等，這些物質(zhì)賦予其一定的藥用和保健功效[8-9]。

青柿子，即未成熟的柿子，其果實中富含可溶性單寧類成分，是柿子中可以開發(fā)利用的重要物質(zhì)。目前，單寧在食品工業(yè)、日用化妝品、制革、醫(yī)療保健、化工等領(lǐng)域廣為應(yīng)用，具有多重開發(fā)價值，已有關(guān)于柿子單寧具有清除自由基、抑制細胞毒性、抗炎、降血脂、降血壓、降血糖等的報道[10-14]。柿子在生長過程中會產(chǎn)生大量生理落果，約占總量的百分之十，若不充分利用，則對柿子資源造成不必要的浪費，同時引起一系列生態(tài)環(huán)境問題[15]。目前，國內(nèi)外對于青柿子的加工利用研究較少。本文研究青柿子提取分離物的成分及功能性，為青柿子單寧的綜合開發(fā)提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

青柿子，品種為火柿子，于2017年8月上旬采摘于西北農(nóng)林科技大學(xué)樹木園。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）（分析純級）、2'-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS·+）（分析純級），美國Sigma-Aldrich 公司；沙門氏菌ATCC29212、大腸桿菌ATCC25922、志賀氏菌SHIELLA、阪崎桿菌ATCC25944、金黃色葡萄球菌ATCC29213，食品學(xué)院微生物實驗室提供；人肝癌HepG2 細胞、人胃癌MKN-45 細胞，動物科技學(xué)院提供；明膠（分析純級），天津市天力化學(xué)試劑有限公司、丙酮、乙酸乙酯等（分析純級），天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2550 紫外分光光度計、高效液相色譜儀，日本島津公司；Vertex70 傅里葉變換紅外光譜儀，德國布魯克公司；Bio-Rad 680 型全波長酶標儀，上海富眾生物科學(xué)有限公司；Y1-050ST 超聲清洗機，河北德科機械科技有限公司；LGJ-100 冷凍干燥機，北京四環(huán)儀器公司；DZF6092 生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；CO2細胞培養(yǎng)箱，美國熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 青柿子提取物的制備 將青柿子清洗，去蒂、核，破碎成泥。稱取350 g 柿泥，按料液質(zhì)量體積比為1 g∶5 mL 加蒸餾水，于30 ℃超聲水提取80 min，抽濾，濾渣以同樣方式再提取2 次，合并濾液，濃縮至1/2 體積，分次向濃縮液中加入100 mL 質(zhì)量濃度為80 g/L 的明膠溶液，充分攪拌產(chǎn)生沉淀，至上清液澄清，抽濾，分別收集上清液和明膠沉淀物。將上清液濃縮成膏體（可溶性固形物含量為55%），用相同體積的乙酸乙酯充分萃取后，合并萃取相，40 ℃回收乙酸乙酯，凍干得分離組分F1。明膠沉淀用質(zhì)量體積比為1 g∶5 mL 的丙酮溶液于50 ℃超聲提取30 min，共提取3 次，收集提取液，在50 ℃條件下回收丙酮，凍干得分離組分F2。用丙酮提取的明膠沉淀再用質(zhì)量體積比1 g∶5 mL 的酸性丙酮（每升丙酮中加入體積分數(shù)為2%的1 mol/L HCl）于50 ℃超聲輔助提取30 min，重復(fù)提取3 次，收集酸性丙酮提取液，用NaOH 調(diào)pH 值至中性，50 ℃回收丙酮，用無乙醇溶解脫鹽，凍干得分離組分F3。

1.3.2 成分鑒定

1.3.2.1 紫外光譜分析 將組分F1、F2、F3分別用乙醇配制成一定濃度的溶液，測定波長190～800 nm 范圍的紫外光譜，以溶劑作為空白對照，分析各分離組分的成分結(jié)構(gòu)[16]。

1.3.2.2 紅外光譜分析 將組分F1、F2、F3凍干粉分別與干燥的KBr 按質(zhì)量比1∶100 充分混勻，研磨壓片，在4 000～400 cm-1范圍掃描各分離組分的紅外光譜圖，分析其分子結(jié)構(gòu)組成[17]。

1.3.2.3 HPLC 分析 以15 種已知物質(zhì)為對照標準品，采用HPLC 分析成分組成。分析條件：反相C18 柱（4.6 mm×250 mm，粒徑5 μm），檢測條件：波長280 nm，柱溫30 ℃，用0.1%乙酸溶液作流動相A，甲醇作流動相B，流速0.2 mL/min，進樣量20 μL，采用0～10 min 5%～14% B，10～25 min 14%～40% B，25～32 min 40%～50% B，32～35 min 50%～80% B，35～55 min 80% B，55～65 min 80%～5% B，65～70 min 5% B 梯度洗脫[18-19]。F1、F3為1 mg/mL 水溶液，F(xiàn)2為2 mg/mL 丙酮溶液，進樣前過0.45 μm 濾膜，在上述色譜條件下分析樣品。

1.3.3 體外抗氧化活性 將F1、F2、F3及VC 配制成2 mg/mL 乙醇溶液，根據(jù)需要稀釋成不同質(zhì)量濃度，備用。根據(jù)Lee 等[20]和Chang 等[21]的方法測定組分F1、F2、F3的DPPH·清除能力；參考Kim等[22]的方法測定ABTS·+清除能力；參考Tsai 等[23]和Liu 等[24]的方法測定·OH 清除能力；參考齊巖[25]的方法測定組分的總還原能力。以VC 作陽性對照，分析青柿子分離組分的體外抗氧化活性。

1.3.4 抑菌活性

1.3.4.1 菌懸液制備 將沙門氏菌ATCC29212、大腸桿菌ATCC25922、志賀氏菌SHIELLA、阪崎桿菌ATCC25944、金黃色葡萄球菌ATCC29213 5種供試菌活化后，分別挑取單菌落于LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床培養(yǎng)18 h 后，4 ℃、4 000 r/min 離心10 min，用生理鹽水清洗定容至菌懸液菌落總數(shù)約為106CFU/mL[26]。

1.3.4.2 最小抑菌濃度（MIC）試驗 參考徐云鳳等[27]的二倍稀釋法，將F1、F2、F3樣品及對照苯甲酸鈉溶液分別加入LB 培養(yǎng)基中，調(diào)整培養(yǎng)基中的樣品質(zhì)量濃度分別為20 000，10 000，5 000，2 500，1 250，625，312，156，78 μg/mL，倒平板，每個平板分為5 個區(qū)，每區(qū)接種2 μL 不同菌種的菌懸液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，以純培養(yǎng)基的平板為陰性對照，以苯甲酸鈉的平板為陽性對照，檢測各樣品無菌落生長的最低稀釋濃度，即最小抑菌濃度。

1.3.5 體外抑制癌細胞增殖活性 參照田程飄等[28]和胡澤成[29]的研究方法。將保存的HepG2、MKN-45 細胞復(fù)蘇培養(yǎng)，收集對數(shù)期傳代細胞，用100 μL 含10%胎牛血清培養(yǎng)液重懸細胞，細胞密度調(diào)整至2.4×104個/mL。取3 塊96 孔板，向每塊板的每小孔接種200 μL 細胞懸浮液，于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，棄每孔培養(yǎng)液，在每塊板的對應(yīng)孔中依次添加200 μL 的F1質(zhì)量濃度分別為0，50，100，125，150，175，200，250，300，400，500，600 μg/mL 的DMEM 高糖培養(yǎng)液，設(shè)置空白對照，3 塊板分別培養(yǎng)24，48，72 h，棄小孔培養(yǎng)液，每孔加10 μL 質(zhì)量濃度為5 mg/mL的MTT 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，在每孔中添加200 μL DMSO，搖床振蕩10 min，于波長490 nm 處測定各孔OD 值，計算細胞增殖抑制率：

細胞增殖抑制率（%）=[1－（OD空白－OD樣品）/OD空白]×100

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有試驗均重復(fù)3 次，結(jié)果采用Origin 8.0和SPSS 22.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 青柿子提取物的分離結(jié)果

經(jīng)試驗，從350 g 青柿子中分離得到分離組分F1為63.30 mg，F(xiàn)2為32.50 mg，F(xiàn)3為8.06 mg，合計103.86 mg。

2.2 青柿子分離組分的成分鑒定

2.2.1 紫外光譜分析 青柿子分離組分的紫外吸收光譜分析結(jié)果見圖1。F1在波長198 nm 和266 nm 處有兩個特征吸收峰，F(xiàn)2在波長204 nm 和280 nm 處有兩個特征吸收，F(xiàn)3在波長204 nm 和274 nm 有兩個特征吸收，均位于波長190～300 nm 范圍，且與沒食子酸單寧（216 nm 和272 nm）和鞣酸單寧（212 nm 和276 nm）吸收譜圖極為相似，說明3 種分離組分可能是間苯三酚類單寧。

圖1 青柿子分離組分的紫外吸收光譜圖Fig.1 UV spectrum of immature persimmon extracts

2.2.2 紅外光譜分析 青柿子分離組分的紅外光譜測定結(jié)果見圖2 和表1。F1、F2、F3的紅外吸收光譜圖極其相似，說明其分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)高度相似。三者在波數(shù)3 400 cm-1附近有強寬吸收峰，為-OH收縮振動吸收，在1 600～1 400 cm-1處為芳香族環(huán)特征吸收，1 709～1 545 cm-1處為C=C 伸縮振動，1 404～1 339 cm-1處為C-H 彎曲振動，這說明它們的分子中都含有-OH、芳環(huán)骨架、C=C、C-H 結(jié)構(gòu)，具有明顯的多酚特征。

圖2 青柿子分離組分的紅外吸收光譜圖Fig.2 IR spectrum of immature persimmon extracts

表1 青柿子分離組分紅外光譜振動峰波數(shù)Table 1 Absorption peak wave numbers of infrared spectrum of immature persimmon extracts

2.2.3 HPLC 分析 15 種標準品及F1、F2、F3的HPLC 分析結(jié)果分別見表2、圖3、圖4。由圖4a 可知，F(xiàn)1分別在18.204，19.876，27.597，39.869，46.345 min 出現(xiàn)較明顯的5 個分離峰，說明F1中至少含有5 種物質(zhì)。經(jīng)與標準品保留時間比對，F(xiàn)1的19.876 min 峰與沒食子酸出峰時間最接近，含量為240.9 mg/g，其它4 個小峰是未知成分，從峰型和各峰面積分析可知，F(xiàn)1的主要成分為沒食子酸，同時含有少量4 種未知成分。由圖4b 可知，F(xiàn)2在18.659，30.102，45.407 min 出現(xiàn)3 個分離峰，30.102 min 的峰既高又大，其它兩個峰均較小。經(jīng)與標準品比對，發(fā)現(xiàn)F2的保留時間30.102 min 與原兒茶酸的保留時間30.050 min 最接近，說明F2的主要成分為原兒茶酸，含量為270 mg/g，同時還含有少量的兩種未知成分。由圖4c 可知，F(xiàn)3在18.883 和44.741 min 出現(xiàn)兩個較大的分離峰，在24.816，29.389，32.990 min 均出現(xiàn)較小的分離峰，表明F3至少含有5 種成分，其中有兩種成分含量較高，經(jīng)與標準品保留時間比對，44.741 min 與阿魏酸保留時間一致，含量達37.8 mg/g，表明F3的主要成分為阿魏酸，同時含有少量的4 種未知成分。

圖3 15 種單寧標準品的HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC profiles of 15 kinds of tannin standard solutions

圖4 F1（a）、F2（b）、F3（c）的HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC profiles of F1（a），F(xiàn)2（b）and F3（c）

表2 15 種單寧標準品溶液測定結(jié)果Table 2 Results of 15 kinds of tannin standard solutions

（續(xù)表2）

2.3 抗氧化活性分析

青柿子提取分離物的抗氧化試驗測定結(jié)果見表3。由表3 可知，F(xiàn)1、F3清除DPPH·能力強于VC，F(xiàn)2弱于VC，僅有VC 的一半清除效果；F1清除ABTS·+能力強于VC，F(xiàn)2、F3弱于VC，F(xiàn)2的清除能力約是VC 的1/4，F(xiàn)3的清除能力約為VC 的一半；F1、F2、F3清除·OH 自由基能力均不如VC；F1、F2、F3對Fe3+的總還原能力也均弱于VC，說明青柿子分離組分F1、F2、F3對不同的自由基有不同的清除能力，具有一定抗氧化活性。

表3 F1、F2、F3 抗氧化活性的IC50 值Table 3 IC50 values of antioxidative activities of F1，F(xiàn)2 and F3

2.4 抑菌活性分析

組分F1、F2、F3及對照苯甲酸鈉最小抑菌濃度試驗結(jié)果見表4。F1對大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、阪崎桿菌的最小抑菌濃度分別為1.250，0.156，0.156，0.625，1.250 mg/mL，其抑菌活性依次為志賀氏菌和金黃色葡萄球菌＞沙門氏菌＞阪崎桿菌和大腸桿菌，F(xiàn)2對5 種菌的最小抑菌濃度分別為5.000，0.312，0.312，2.500，5.000 mg/mL，其抑菌活性依次為志賀氏菌和金黃色葡萄球菌＞沙門氏菌＞阪崎桿菌和大腸桿菌，F(xiàn)3對5 種菌的最小抑菌濃度分別為5.000，1.250，0.625，2.500，5.000 mg/mL，其抑菌活性依次為金黃色葡萄球菌＞志賀氏菌＞沙門氏菌＞阪崎桿菌和大腸桿菌。與陽性對照相比，青柿子分離組分F1、F2、F3對5 種供試菌株均具有較強的抑菌活性，抑菌能力為F1＞苯甲酸鈉＞F3＞F2。

（續(xù)表4）

2.5 體外抑制癌細胞增殖活性分析

預(yù)試驗表明F2、F3組分對人肝癌HepG2 細胞和人胃癌MKN-45 細胞的體外生長無明顯抑制效果。F1對HepG2 和MKN-45 細胞體外增殖抑制試驗結(jié)果見圖5。隨著F1質(zhì)量濃度的增加，對HepG2、MKN-45 細胞增殖抑制率明顯增強，當(dāng)F1質(zhì)量濃度分別大于200 μg/mL 和300 μg/mL 時，明顯抑制HepG2、MKN-45 細胞的體外增殖，在質(zhì)量濃度0～200，0～300 μg/mL 范圍，F(xiàn)1對HepG2、MKN-45 細胞的體外增殖抑制率呈明顯的劑量依賴性。當(dāng)F1質(zhì)量濃度為200 μg/mL 時，處理HepG2 細胞24，48，72 h 后的抑制率分別達到64.83%，77.96%，82.09%；當(dāng)F1質(zhì)量濃度大于300 μg/mL 時，抑制率不再呈劑量依賴性，培養(yǎng)24，48，72 h 后的抑制率分別為77.96%，88.24%，92.93%。同樣，質(zhì)量濃度為300 μg/mL 的F1處理MKN-45細胞24，48，72 h 后的抑制率分別達80.51%，80.64%，84.37%，抑制率隨培養(yǎng)時間的延長而增強。由此可知，F(xiàn)1具有明顯的體外抑制HepG2、MKN-45 細胞增殖作用，且能促進HepG2、MKN-45 細胞凋亡，說明青柿子中分離的F1組分具有良好的抗癌活性。從上述分析可知，F(xiàn)1主要含沒食子酸和4 種未知成分，沒食子酸被證明具有抑制癌細胞生長的特性[30]，可能是抑制癌細胞的主要物質(zhì)，其它4 種未知成分也可能具有抑制癌細胞生長功能，尚需研究證實。

圖5 F1 對人肝癌HepG2 細胞（a）、人胃癌MKN-45細胞（b）增殖抑制試驗Fig.5 Inhibitory effects of F1 on the proliferation of lung cancer HepG2 cells（a）and gastric cancer MKN-45 cells（b）

2.6 討論

研究發(fā)現(xiàn)，柿子中含有豐富的多酚類物質(zhì)，其中最常見的成分包括沒食子酸、阿魏酸、咖啡酸、香草酸、對香豆酸、表兒茶素、原兒茶酸、原花青素等[31]，其中也包括本文對青柿子分離組分的HPLC鑒定結(jié)果。Sentandreu 等[32]通過HPLC-MS 法分析得出沒食子酸及其衍生物是柿子中主要的酚類物質(zhì)。柿子中的生物活性物質(zhì)，尤其是類胡蘿卜素和單寧酸類成分，能預(yù)防癌癥，清除自由基，降低糖尿病和心腦血管疾病的發(fā)病風(fēng)險，此外，柿子中的酚酸，如沒食子酸等，還表現(xiàn)出較強的抗氧化活性和潛在的抗菌、抗炎及抗癌能力[33-34]。研究青柿子的分離組分對于開發(fā)青柿子功能性成分及其應(yīng)用具有十分重要的參考價值。

3 結(jié)論

1）青柿子分離組分F1、F2、F3的主要成分可能為間苯三酚類單寧，均含有-OH、芳環(huán)骨架、C=C、C-H 結(jié)構(gòu)，其中F1的主要成分為沒食子酸，含量240.9 mg/g 和少量4 種未知成分；F2主要成分是原兒茶素，含量270 mg/g 和少量兩種未知成分；F3主要成分為阿魏酸，含量37.8 mg/g 和少量4 種未知成分。

2）青柿子分離組分F1、F2、F3均對DPPH、ABTS 和OH 自由基表現(xiàn)出良好的清除能力及較強的還原能力，具有一定的抗氧化活性。

3）青柿子分離組分F1、F2、F3均有一定廣譜抑菌性，抑菌能力為F1＞苯甲酸鈉＞F3＞F2。

4）青柿子分離組分F2、F3無明顯的抑癌特性，而組分F1能明顯抑制人肝癌HepG2 細胞和胃癌MKN-45 細胞的體外增殖，在一定質(zhì)量濃度范圍呈劑量依賴性。