于 敏，范 斌，袁奇軍，侯 劍，于淑華，韓曉陽*，黃曉琴*

1. 山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝科學(xué)與工程學(xué)院/作物生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000；2. 山東捷晶集團(tuán)公司，山東 日照 276800；3. 日照市豫園春茶業(yè)有限責(zé)任公司，山東 日照 276813；4. 日照市嵐山區(qū)茶技術(shù)推廣服務(wù)中心，山東 日照 276807

茶樹是多年生、木本、常綠植物，對寒冷的耐受性較低。在中國長江以北茶區(qū)，冬季和春季低溫時(shí)間很長，暴露于低溫脅迫下的茶樹會導(dǎo)致氧化脅迫[1]，這大大增加了活性氧（ROS）的產(chǎn)生。 低溫和光照會增加茶樹中ROS的水平[2]。ROS與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞損傷并影響茶樹的生長和生產(chǎn)[3]。

低溫逆境下，采用由一種或多種物質(zhì)組成的生物刺激劑可刺激植物的生長發(fā)育過程，從而提高對非生物脅迫的耐受性，提高植物生長和養(yǎng)分的利用效率[4]。海藻和海藻提取物（SWE）已被證明可用于生產(chǎn)各種類別的植物生長生物刺激劑[5-6]。海藻提取物包含許多生物活性物質(zhì)，包括碳水化合物、脂質(zhì)、糖、維生素、多酚、礦物質(zhì)和各種植物激素，它們通常被用作植物生長促進(jìn)劑[7-8]。海藻提取物可直接刺激植物生長并改善作物生長的環(huán)境條件，如促進(jìn)有益土壤微生物的生長、誘導(dǎo)結(jié)瘤和提高對非生物脅迫（如干旱或鹽堿度）的抵抗力[9-11]。海藻的種類和含量因種類不同而有所不同[12]。大約20%的海藻水提取物可改善豇豆的生長[13]。使用3%的海藻提取液可提高豇豆的莖長、葉數(shù)和產(chǎn)量[7]。SWE還可增強(qiáng)農(nóng)作物對環(huán)境脅迫的耐受性，增加抗氧化劑含量[14-15]。海藻多糖約占海藻干重的40%，是資源利用的重要組成部分，這些糖類既是生命活動的主要能源，又是調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓的重要物質(zhì)，可有效提高作物的生長速率和抵抗逆境增強(qiáng)的能力。甜菜堿可以提高葉綠素含量，當(dāng)濃度較高時(shí)，調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透壓，其作為植物體內(nèi)有機(jī)物和無機(jī)物的運(yùn)輸載體，參與植物代謝循環(huán)過程，能夠明顯增強(qiáng)逆境抵抗條件下植物對養(yǎng)分的吸收[16]。海藻酸鹽促進(jìn)植物生長和發(fā)育并激活植物防御反應(yīng)。噴施海藻酸鹽后，葉片的光合速率及還原糖和脯氨酸含量增加，葉片中的H2O2含量降低[17]。海藻提取物包含多糖、微量營養(yǎng)素和植物生長激素的復(fù)雜混合物，可增強(qiáng)植物對非生物脅迫的抗性[5]。

本試驗(yàn)研究將海藻提取液噴施茶樹苗并進(jìn)行低溫處理，以探討海藻提取液在低溫脅迫下對茶樹的影響機(jī)理，為深入研究茶樹抗逆性提供理論支持，同時(shí)為減少低溫逆境對茶樹的危害具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 植物材料和試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以一年生無性系福鼎大白茶盆栽茶苗（Camellia sinensis (L.) O. Kuntze）為試材，試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)（N-36°19'42'', E-117°11'35''）人工氣候箱內(nèi)進(jìn)行。選取長勢基本一致、無病蟲害的一年生茶苗，定植于盆中，每盆3株。盆內(nèi)栽培基質(zhì)為草炭和蛭石，按1∶1的體積比混合。將茶苗首先在25℃適應(yīng)2 d，然后在10℃適應(yīng)7 d，再轉(zhuǎn)入5℃進(jìn)行低溫處理40 d。試驗(yàn)設(shè)海藻提取物噴施組（SWE）（海藻提取物由山東潔晶集團(tuán)提供）和清水組（Control）。SWE按4% v/v噴施，第一次噴施在茶苗轉(zhuǎn)入5℃溫度下開始，每7 d噴施一次，噴施于葉片正反面至滴水為準(zhǔn)，并從第一次噴施開始進(jìn)行試驗(yàn)。試驗(yàn)條件：光培養(yǎng)及暗培養(yǎng)各12 h，光照強(qiáng)度為3.3萬lx，空氣濕度為80%。

1.2 方法

1.2.1 紅外光譜檢測

將海藻提取物放入冷凍真空干燥機(jī)（EYELA，F(xiàn)DU-2200）內(nèi)進(jìn)行冷凍干燥。取1 mg凍干樣品和200 mg KBr于瑪瑙研缽中充分研磨均勻，置于模具中，在油壓機(jī)上壓成透明薄片，將樣片放入傅里葉紅外光譜儀中測試。波數(shù)范圍4000 ～ 400 cm-1，掃描次數(shù)32，分辨率4 cm-1。

1.2.2 葉片組織觀察

1.2.3 葉綠素及葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

利用便攜式葉綠素分析儀（SPAD-502Plus，Konica Minolta Holdings，Inc.Japan）測定成熟葉片（頂芽下第三片葉片）中葉綠素含量。使用SPAD儀器在上午7:00到9:00進(jìn)行測量。葉片邊緣周圍的六個(gè)SPAD讀數(shù)的平均值用作最終值[21]。

利用FMS-2型脈沖調(diào)試熒光儀（Hanstrch，UK）測量葉綠素?zé)晒鈪?shù)。所有的測量都是在成熟葉（頂芽下第三片葉）上進(jìn)行。測量之前，葉子適應(yīng)黑暗至少30 min，以平靜反應(yīng)中心。在光照強(qiáng)度為 125 μmol·m-2·s-1和低測量光束下測量暗適應(yīng)葉片的最小和最大熒光值。在自然光下測量初始、最大和發(fā)光熒光值。根據(jù)Li方法計(jì)算葉片的最大光系統(tǒng)II（PSII）效率（Fv/Fm）、非光化學(xué)熒光猝滅（NPQ）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（qP）和相對PSII電子轉(zhuǎn)移速率（ETR）[22]。

1.2.4 SOD、POD、CAT測定

鮮葉樣（0.2 g）在含有0.1 mmEDTA和1%聚乙烯的5 mL冷磷酸鹽緩沖液（50 mm，pH 7.8）中研磨。勻漿在11000 r·min-1、4℃下離心20 min，上清液檢測SOD、POD、CAT活性。

用硝基藍(lán)四唑（NBT）測定SOD活性[23]。試劑（酶）用量（mL）最終濃度（比色時(shí)間）：50 mm磷酸鹽緩沖液（pH 7.8）、13.0 mm蛋氨酸、10 μm硝基藍(lán)四唑（NBT）、0.1 mM medta、0.1 mM核黃素和50 μL酶提取物，在560 nm處記錄吸光度。SOD的活性單位是NBT光化學(xué)還原（U）的50%抑制[24]。

用愈創(chuàng)木酚法測定了POD的活性，并對其進(jìn)行輕微修飾。將磷酸緩沖液（2 mL，50 mM，pH 7.8）、愈創(chuàng)木酚（0.8 mL，1%）和H2O2（0.8 mL，10 mM）放入試管中，試管置于25℃的水罐中保持3 min。將粗酶提取物（50μL）添加到試管中，立即記下時(shí)間，同時(shí)搖勻后立即倒入比色皿，于470 nm波長下比色，每隔1 min記錄1次吸光度值，共記錄4次。每分鐘A470的0.01變化被認(rèn)為是一個(gè)酶活性單位（U）[25]。

截至2014年年底，全國有效使用綠色食品標(biāo)志企業(yè)總數(shù)達(dá)到8700家，產(chǎn)品21153個(gè)，達(dá)到歷史新高。2014年上半年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，綠色食品大米、水果和茶葉產(chǎn)量已分別占全國大米、水果和茶葉總產(chǎn)量的10.8%、6.8%和3.7%。全國共創(chuàng)建了635個(gè)綠色食品原料標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)基地，基地種植面積1.6億畝。

用紫外分光光度法測定CAT的活性。將磷酸緩沖液（1.5 mL，50 mM，pH 7.8）、H2O2（0.3 mL，100 mM）和蒸餾水（1 mL）放入試管中，試管放置在保持在25℃的水槽中3 min。將粗酶提取物（100 μL）添加到試管中，并在240 nm下每1 min測量所得混合物的吸光度4次，以每分鐘A240的變化表明酶活性單位（U）[26]。

1.2.5 qPCR

總RNA的提取采用植物RNA快速提取試劑盒（北京艾迪實(shí)驗(yàn)室生物技術(shù)有限公司）。使用瓊脂糖電泳檢測RNA的完整性，并使用超微分光光度計(jì)（Thermo NanoDrop 2000，America）分析總RNA的純度。以RNA為模板，Oligodt18為引物，合成了第一鏈cDNA。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中的基因序列，利用引物5.0設(shè)計(jì)特異引物（表1），選擇β-actin作為內(nèi)參照基因。擴(kuò)增反應(yīng)在定量PCR系統(tǒng)（美國羅氏Lightcycler 96）上進(jìn)行。熒光定量檢測試劑為SYBR定量檢測試劑盒（Takara）。用SYBR預(yù)混物Ex-Taq II（10 μL）、引物（0.6 μL）、cDNA 模板（1 μL）、dd H2O（8.4 μL）進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)步驟如下：預(yù)變性（95℃，30 s）、PCR反應(yīng)（95℃，5 s；62℃，14 s；40個(gè)周期），溶解（95℃，5 s；60℃，60 s；95℃，15 s）每個(gè)反應(yīng)重復(fù)三遍，并使用2-ΔΔ CT方法確定相對表達(dá)[27]。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences used in this study

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

統(tǒng)計(jì)分析使用spss 16進(jìn)行。采用單因素方差分析和最小顯著性差異檢驗(yàn)比較兩個(gè)處理的平均值。顯著性水平設(shè)為p= 0.05。Origin 8.0用于制作圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻提取液的官能團(tuán)

從圖1可看出，圖中波數(shù)為3348 cm-1寬峰為羥基-OH伸縮振動峰，3009 cm-1峰為= C-H伸縮振動峰，2923 cm-1和2853 cm-1峰分別歸屬于亞甲基或甲基C-H鍵對稱伸縮振動峰與反對稱伸縮振動峰，說明樣品中含有蛋白質(zhì)。1740 cm-1峰為羰基C=O伸縮振動峰，1603 cm-1峰為-OH面內(nèi)彎曲振動，說明樣品中有不飽和脂肪酸存在。1378 cm-1峰為C-H鍵彎曲振動，1168 cm-1和1059 cm-1峰為C-O-C伸縮振動峰，說明樣品中存在甾體與糖類物質(zhì)。718 cm-1峰為長烴基鏈的面外搖擺。通過傅里葉紅外光譜分析可知，海藻提取物中可能存在蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、甾體及糖類等物質(zhì)。

圖1 傅里葉變換紅外（FTIR）光譜檢測海藻提取物官能團(tuán)結(jié)果Figure 1 Results of functional groups in seaweed extracts detected by Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy

2.2 海藻提取液對茶樹葉片組織發(fā)育的影響

茶樹的抗寒性與茶樹葉片解剖結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，抗寒性強(qiáng)的茶樹品種柵欄組織的厚度大、細(xì)胞層數(shù)多、柵海比值高[28]。噴施海藻提取液后茶樹葉片厚度、柵欄組織和海綿組織厚度均顯著大于對照（p< 0.01），比對照分別增加63.84%、18.72%和8.86%（表2、圖2），同時(shí)海藻提取物處理P/S和Y值均顯著大于對照（p< 0.01）；表明低溫條件下噴施海藻提取液后促進(jìn)了葉片、柵欄組織和海綿組織厚度的增加，特別是顯著擴(kuò)大了葉片內(nèi)物質(zhì)積累空間，較好地促進(jìn)養(yǎng)分物質(zhì)的積累，對提高茶樹葉片的抗冷性具有較好的促進(jìn)作用。

表2 茶鮮葉組織結(jié)構(gòu)Table 2 Tissue structure of fresh tea leaves

圖2 低溫脅迫下茶葉的組織形態(tài)Figure 2 Tissue morphology of tea leaves under low temperature stress

2.3 茶鮮葉中葉綠素含量和葉綠素?zé)晒?/h3>

與對照相比，噴施海藻提取液20 d和40 d后茶樹葉片中葉綠素含量分別顯著提高68.85%和97.88%（p< 0.01）（表3）。低溫誘導(dǎo)40 d后，海藻提取液處理組茶樹葉片的葉綠素含量基本保持不變整體呈現(xiàn)深綠色，而對照組葉片呈黃綠色（圖3）。結(jié)果表明在低溫脅迫下海藻提取液能較長時(shí)間保持茶樹葉片中葉綠素含量及其穩(wěn)定性，減緩葉綠素的降解過程。

表3 低溫脅迫下茶葉的葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Table 3 Chlorophyll content and chlorophyll fluorescence parameters of tea leaves under low temperature stress

Fv/Fm比值為PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)化學(xué)效率，在低溫條件下，比值越小光抑制越重。從表3可看出，隨著低溫脅迫的延長，茶樹葉片中Fv/Fm比值下降，說明低溫脅迫降低了茶苗PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)化效率，使茶樹PSⅡ反應(yīng)中心受到傷害。噴施海藻提取物處理后葉片F(xiàn)v/Fm比值穩(wěn)定在32.74 ～ 35.42，而對照則下降到17.90～ 19.39?？梢?，海藻提取物能減輕低溫對葉片帶來的光抑制破壞，提高PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)化學(xué)效率。

熒光猝滅是葉綠體耗散能量的一種途徑，分為光化學(xué)猝滅qP和非光化學(xué)猝滅NPQ兩種。由表3可知，隨著低溫逆境程度的加劇，qP均呈現(xiàn)下降趨勢，噴施海藻提取物處理葉片qP顯著大于對照（20 d,p< 0.05；40 d，p< 0.05），且qP下降幅度小于對照。表明在低溫脅迫下噴施海藻提取物后能提高茶樹葉片中PSII 的電子傳遞活性，從而增強(qiáng)茶樹葉片光合碳同化能力，促進(jìn)有機(jī)質(zhì)的積累。同時(shí)，低溫脅迫20 d后茶樹葉片NPQ下降，但海藻提取物處理NPQ顯著大于對照，表明海藻提取液能夠增強(qiáng)葉片的光保護(hù)能力，避免過剩的光能對葉片組織產(chǎn)生破壞；但隨著處理40 d后，光系統(tǒng)遭到了一定程度的破壞，導(dǎo)致NPQ數(shù)值下降幅度較大；但與對照相比，海藻提取物處理NPQ的下降幅度小于對照，表明雖然葉片組織產(chǎn)生了破壞但仍能對光合系統(tǒng)起到保護(hù)作用。

ETR是反映實(shí)際光強(qiáng)條件下的植物表觀電子傳遞效率，其值下降意味著從QA到QB的電子傳遞受阻，溫度越低，ETR下降越大。表3結(jié)果表明，低溫脅迫下海藻提取物處理ETR均顯著大于對照（p< 0.01）。相對于正常溫度下（25℃），低溫脅迫20 d和40 d海藻提取物ETR降幅分別為4.10和9.54，而對照下降幅度則分別為7.82和16.48，海藻提取物ETR下降幅度顯著小于對照（清水）。表明低溫脅迫后茶樹葉片的表觀電子傳遞效率受到抑制，而海藻提取液能較大程度上緩解表觀電子傳遞效率的下降，從而促進(jìn)光合作用的進(jìn)行。

2.4 抗氧化酶活性

海藻提取物能夠顯著提高茶苗葉片CAT、SOD和POD酶活性（表4）。處理20 d時(shí)海藻提取物組CAT、SOD、POD酶活性比對照分別提高7.32%、14.87%和17.24%（p< 0.01）；處理40 d時(shí)海藻提取物組CAT、SOD、POD酶活性比對照分別提高6.33%、16.87%和12.23%（p< 0.01）。結(jié)果表明在低溫脅迫下海藻提取物能刺激茶苗體內(nèi)抗氧化酶活性增強(qiáng)，以減少低溫脅迫產(chǎn)生的超氧化物自由基的傷害。

表4 低溫脅迫下茶葉的抗氧化酶活性Table 4 Antioxidant enzyme activities of tea under low temperature stress

2.5 海藻提取液對茶樹基因表達(dá)量的影響

低溫脅迫過程中，植物主要通過合成滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和低溫保護(hù)蛋白質(zhì)來增強(qiáng)植株的抗低溫能力。圖4結(jié)果可看出，噴施海藻提取物20 d后茶樹葉片β淀粉酶CsBAMs基因家族（CsBAM1、CsBAM3）、冷誘導(dǎo)基因（CsCBF3）、麥芽糖轉(zhuǎn)葡萄糖基酶基因 （CsDPE2）、脂肪酸去飽和酶調(diào)控基因（CsFAD2）、MYB/MYC類轉(zhuǎn)錄因子（CsICE）、AP2/ER家族轉(zhuǎn)錄因子（CsRAV）、棉子糖合成酶基因（CsRS2）、蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（CsSUT1）相對豐度與對照沒有差異，但在處理40 d后，其相對豐度顯著上調(diào)（p< 0.01）。同時(shí)，海藻提取物組液泡膜單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因（CsTMT1）和水通道蛋白基因（CsTIP1:1）的相對豐度在處理20 d和40 d均顯著大于對照。而脂肪酸去飽和酶調(diào)控基因CsFAD6在海藻提取物處理20 d后基因豐度顯著降低（p< 0.01），但隨著低溫的延長，處理40 d后基因豐度顯著上調(diào)（p< 0.05）。

圖4 低溫脅迫下茶樹葉片基因的定量表達(dá)Figure 4 Quantitative expression of genes in tea leaves under low-temperature stress

3 討論與結(jié)論

3.1 討論

本文通過傅里葉紅外光譜分析發(fā)現(xiàn)海藻提取物中可能存在蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、甾體和糖類等物質(zhì)，這與之前其他海藻物種研究結(jié)果相似[29,13]。海藻提取物中的物質(zhì)對增強(qiáng)植物抗性可以起到積極的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，噴施海藻提取液后促進(jìn)了葉片及葉片的柵欄組織和海綿組織厚度的增加，抗凍指數(shù)增強(qiáng)；同時(shí)葉片葉綠素降解緩慢[30]，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、qP、NPQ、ETR顯著大于對照（表3）。Fv/Fm、qP的增加有利于PSII反應(yīng)中心開放程度的提高以及天線捕光效率的增加，用于光合電子傳遞的量子產(chǎn)量增多，使ΦPSII在低溫脅迫環(huán)境中升高；同時(shí)NPQ 和ETR升高不僅增加光能熱耗散量，還增強(qiáng)了PSII電子傳遞活性，從而提高了光能轉(zhuǎn)化學(xué)效率，減輕了低溫對葉片帶來的光抑制破壞。

當(dāng)植物面臨氧化脅迫時(shí)，SOD能夠迅速地將·O2-轉(zhuǎn)化為H2O2和H2O，緊接著CAT及POD將SOD等催化產(chǎn)生的H2O2和·OH轉(zhuǎn)化成H2O和O2，各種酶之間相互協(xié)調(diào)減少較多的H2O2和·OH，進(jìn)而避免植物體受到活性氧（ROS）的傷害[31]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在噴施海藻提取物后，葉片中SOD、POD和CAT活性比對照顯著升高，且隨著處理時(shí)間延長升高趨勢愈加明顯，這與Vyas研究結(jié)果相似，表明外源噴施海藻提取物可有效激活低溫脅迫下茶樹幼苗的酶促防御系統(tǒng)，增強(qiáng)抗氧化酶活性，進(jìn)而快速清除體內(nèi)大量的活性氧，減輕膜損傷，最終達(dá)到提高茶樹抗低溫能力，有效提高茶樹的抗寒性[3]。

糖代謝與植物的低溫脅迫響應(yīng)密切相關(guān)，胞內(nèi)可溶性糖含量直接影響植物抗寒能力的強(qiáng)弱[32-33]。茶樹可通過調(diào)控體內(nèi)淀粉-糖之間的轉(zhuǎn)化以增強(qiáng)對低溫脅迫的抵抗能力。β-淀粉酶基因CsBAM1和CsBAM3是一種低溫誘導(dǎo)基因，通過水解淀粉提高可溶性糖含量，從而提高植物的抗寒能力。海藻提取物噴施茶樹葉片40 d后茶樹體內(nèi)CsBAM1和CsBAM3均被顯著地誘導(dǎo)表達(dá)，特別是CsBAM1的表達(dá)上調(diào)5倍以上。低溫脅迫下，BAM基因的上調(diào)能夠促進(jìn)淀粉水解，提高細(xì)胞中麥芽糖含量，麥芽糖含量的升高對低溫脅迫下植物光合電子傳遞鏈的正常作用具有重要作用，能夠維持低溫脅迫下光合系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）的穩(wěn)定，而本試驗(yàn)海藻提取物處理后的茶樹葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)顯著高于對照，減輕了低溫對光系統(tǒng)的破壞。此外，麥芽糖轉(zhuǎn)葡萄糖基酶基因CsDPE2在胞質(zhì)中能夠催化α-1,4-D-葡聚糖片段，將麥芽糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖，在淀粉水解中也具有重要作用。本試驗(yàn)海藻提取物組的CsDPE2相對表達(dá)量提高了9.14倍，表明麥芽糖在低溫脅迫中被運(yùn)出質(zhì)體，并在DPE2的作用下將麥芽糖轉(zhuǎn)化成葡萄糖，大大提高了胞質(zhì)中可溶性糖的含量。在可溶性糖中一些多聚糖是植物抗逆響應(yīng)中重要的滲透調(diào)節(jié)劑和抗氧化劑，如棉子糖[34-35]。研究顯示，棉籽糖在植物凍融過程中能維持光系統(tǒng) II（PSII）的穩(wěn)定性，從而緩解低溫脅迫對植物造成的嚴(yán)重傷害[36-37]。本試驗(yàn)中海藻提取物處理后茶樹葉片棉子糖合成酶基因CsRS2顯著上升，這與岳川的研究結(jié)果一致[38]；在低溫脅迫下，可溶性糖在抗寒中的作用與糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的運(yùn)輸作用密切相關(guān)[39]。本試驗(yàn)中茶樹蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CsSUT1在噴施海藻提取物40 d時(shí)顯著上調(diào)，而液泡單糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因CsTMT1在噴施海藻提取物20 d和40 d時(shí)均呈現(xiàn)顯著上調(diào)。兩個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的高表達(dá)，有利于促進(jìn)可溶性糖在葉綠體和液泡中的分配，參與抵御低溫[40-42]。

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是生物體內(nèi)廣泛存在的一種膜內(nèi)在蛋白，廣泛參與植物的抗逆響應(yīng)。本試驗(yàn)對CsTIP1∶1進(jìn)行定量分析發(fā)現(xiàn)，隨著低溫處理時(shí)間延長，CsTIP1∶1相對豐度均顯著高于對照，處理40 d時(shí)海藻提取物處理是對照的5.16倍（p< 0.01）。由于CsTIP1∶1的Ar/R濾器為HIAV，該基因具備轉(zhuǎn)運(yùn)過氧化氫的功能[43]，因此，該基因在葉片中高水平的表達(dá)有利于降低過氧化氫積累, 減輕低溫脅迫對膜系統(tǒng)的傷害；同時(shí)，本試驗(yàn)對不飽和脂肪酸形成的關(guān)鍵因子CsFAD2和 CsFAD6進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，CsFAD2在海藻提取物處理20 d時(shí)與對照無差異，而CsFAD6卻顯著下調(diào)（p<0.01），但在處理40 d后兩個(gè)基因均顯著上調(diào)，這種情況的出現(xiàn)有可能是因?yàn)樵趪娛┖Ｔ逄崛∥镏安杳缫呀?jīng)進(jìn)行了低溫鍛煉，膜酯結(jié)構(gòu)已產(chǎn)生變化，CsFAD2和 CsFAD6活性降低。但隨著低溫脅迫程度的加重，為了進(jìn)一步提高抗性，CsFAD2和CsFAD6基因表達(dá)量升高。

茶樹中存在一些冷誘導(dǎo)基因，例如恢復(fù)/脫水反應(yīng)元件結(jié)合因子基因（CsCBF3）。噴灑SWE 40 d后，SWE組CsCBF3的相對表達(dá)上調(diào)了對照組的3.5倍（p< 0.01，圖4C）。擬南芥中CsCBF3的表達(dá)顯示出對寒冷脅迫的耐受性增強(qiáng)和光合作用得到改善，而在寒冷條件下的損害更少[44]。此外，調(diào)節(jié)CBF冷誘導(dǎo)（CsICE）的主要調(diào)節(jié)因子之一顯示出與CsCBF3類似的變化（圖4G）。可見，低溫條件下CsICE的上調(diào)表達(dá)利于ICE在低溫下結(jié)合到CBF的啟動子序列上誘導(dǎo)CBF的表達(dá)，以此來增強(qiáng)植物的抗寒能力[45]。茶樹中另外一個(gè)與低溫脅迫有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子RAV（Relate to ABI3/VIP1）類轉(zhuǎn)錄因子在低溫處理后表達(dá)量上調(diào)，處理12 h表達(dá)量達(dá)到最大，提高了5.8倍。本試驗(yàn)噴施海藻提取物后CsRAV表達(dá)與Chen相似，但CsRAV相對豐度是對照的9.45倍，表明海藻提取物可能會進(jìn)一步刺激CsRAV的表達(dá)[46]。

3.2 結(jié)論

海藻提取物可能含有蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、甾體和糖類等物質(zhì)。低溫條件下，噴施海藻提取物能促進(jìn)茶樹增加葉片及柵欄組織和海綿組織厚度，抗寒指數(shù)增大；葉片中葉綠素降解減緩，葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、qP、NPQ和ETR顯著大于對照（清水），減輕低溫對葉片帶來的光抑制破壞。同時(shí)，刺激茶樹體內(nèi)抗氧化酶活性增強(qiáng)，減少低溫脅迫產(chǎn)生的傷害。噴施海藻提取物后涉及糖代謝、脂肪酸代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白以及冷誘導(dǎo)相關(guān)基因均顯著上調(diào)表達(dá)。噴施海藻提取液提高了茶樹的抗低溫能力，減少了低溫脅迫對茶樹苗的傷害。