林桂宇，黃 斌，成芳梅，王翠榮，韋錦斌，黃仁彬，趙勁民

（廣西醫(yī)科大學，南寧 530021）

高血脂癥（hyperlipemia，HLP）是指體內(nèi)脂質(zhì)代謝紊亂、升高的狀態(tài)，進而造成血脂成分含量增高[1]，在臨床上主要表現(xiàn)為總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的異常升高[2]。HLP 是誘發(fā)動脈粥樣硬化的直接因素，而動脈粥樣硬化是誘發(fā)心腦血管疾病的直接因素。臨床常用于調(diào)節(jié)血脂的藥物有他汀類和貝特類藥物。然而，這兩種藥物存在諸多的不良反應，且可能導致老年患者肝功能異常[3]。

中醫(yī)認為HLP 是血濁病、“膏”病等，病機為肝失疏泄、脾失健運、痰瘀內(nèi)阻，治療方法主要為理肝調(diào)脾、化痰濕濁、活血化瘀[4]。牡蠣葛根固體飲料（OKPD）是由牡蠣、葛根、山楂、苦瓜4 味中藥組成。牡蠣富含豐富的蛋白質(zhì)和鋅，具有保肝、降血糖、抗腫瘤等藥用價值[5]。葛根具有解肌退熱、升陽舉陷的功效，常用于陰虛消渴、脾虛泄瀉等[6]。研究發(fā)現(xiàn)，葛根素具有降血脂的作用[7]。目前尚無文獻報道OKPD 治療HLP 的相關(guān)研究。本研究用Triton WR-1339 誘導小鼠HLP，探討OKPD 對HLP 小鼠的療效及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 昆明種小鼠，SPF級，雌雄各半，體重（20±2）g，購自廣西醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK 桂2014-0002，動物使用許可證號：SYXK桂2014-0003。動物飼養(yǎng)于通風條件良好，溫度在18～25 ℃，相對濕度在40%～70%，12 h 光照晝夜循環(huán)的環(huán)境。

1.2 藥物的制備 OKPD（批號：20190616）是由葛根、山楂、苦瓜、牡蠣4 味藥物按一定比例組成。其中葛根、山楂、苦瓜各2 kg，牡蠣粉1.2 kg。葛根、山楂、苦瓜3味藥，先干燥后粉碎為80目，加水煎煮（2次，第1 次10 倍量，第2 次8 倍量，2 h/次），濃縮，得到濃縮膏。向濃縮膏中加入牡蠣粉1.2 kg（90 ℃烘烤30 min，超細粉），淀粉0.35 kg，糊精50 g，混勻，制成顆粒，備用。1 g OKPD相當于12 g生藥材。成人每日用量為20～30 g（顆粒劑）/60 kg體重。

1.3 主要試劑 非諾貝特購自法國利博福尼制藥公司。Triton WR-1339 購自Sigma 公司。LDL-C、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、TC、TG、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、一氧化氮（NO）、總NO 合成酶（T-NOS）試劑盒購自南京建成生物工程研究；通用SP試劑盒購自上海雅吉生物技術(shù)有限公司；兔抗核轉(zhuǎn)錄因子κB（NF-κB）、白細胞介素6（IL-6）及腫瘤壞死因子α（TNF-α）抗體購自Cell Signaling Technology公司；通用二抗購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.4 動物分組、給藥及模型建立 將60 只小鼠隨機分為6 組，即正常對照組、模型組、非諾貝特陽性對照組及OKPD高、中、低劑量組，每組10只。非諾貝特陽性對照組灌胃給予0.03 g/kg 非諾貝特，OKPD 高、中、低劑量組分別灌胃給予10 g/kg、5 g/kg、2.5 g/kg的OKPD。給藥體積為20 mL/kg，連續(xù)給藥14 d，1次/d。正常對照組和模型組給予等量生理鹽水。末次給藥后1 h，除正常對照組外，其余各組小鼠腹腔注射600 mg/kg Triton WR-1339 構(gòu)建HLP 模型[8-9]。

1.5 動物處置及標本制備 造模24 h 后，麻醉小鼠，眼眶取血，靜置、離心、取血清，超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。處死后取小鼠肝臟，一部分浸泡于4%甲醛溶液中，用于病理檢查和免疫組化。另一部分存放于液氮中，用于檢測肝功能指標。

1.6 血清生化指標的檢測 收集小鼠血清，嚴格按照試劑盒說明檢測血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C、AST、ALT、T-NOS水平。

1.7 肝組織病理學檢查 取4%甲醛固定24 h后的肝臟組織，行蘇木精—伊紅（HE）染色，于低倍鏡下觀察肝組織病理學變化。

1.8 免疫組化法檢測肝臟組織中TNF-α、NF-κB、IL-6 蛋白表達 取出肝組織，常規(guī)石蠟包埋、切片。檢測過程嚴格按照免疫組化試劑盒說明書進行操作，滴加一抗TNF-α（1∶800）、NF-κB（1∶1 000）、IL-6（1∶600），4 ℃孵育過夜，二抗（1∶10 000）孵育2 h，PBS 沖洗5 次后，染色、封片、閱片。細胞質(zhì)內(nèi)黃棕色顆粒為蛋白陽性表達。用Image Pro plus 6.0軟件分析NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白表達量，以平均光密度值表示蛋白的相對定量（平均光密度值=累積光密度值/陽性面積）。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 OKPD 對HLP 小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平的影響 模型組小鼠血清中TC、TG、LDL-C水平較正常對照組顯著升高，HDL-C水平較正常對照組顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，OKPD 高、中劑量組TC、TG 水平顯著下降，OKPD各劑量組HDL-C 水平顯著升高，LDL-C 顯著下降（P＜0.05），OKPD 低劑量組TC、TG 水平與模型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；OKPD 高劑量組TC 水平顯著低于OKPD 低劑量組（P＜0.05），見表1。

表1 OKPD對HLP小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響mmol/L，，n=10

表1 OKPD對HLP小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平的影響mmol/L，，n=10

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與OKPD低劑量組比較，&P＜0.05。

2.2 OKPD 對HLP 小鼠血清中AST、ALT、T-NOS水平的影響 模型組小鼠血清中AST、ALT、T-NOS水平較正常對照組顯著升高（P＜0.05），與模型組比較，非諾貝特陽性對照組及OKPD高、中劑量組小鼠血清AST、ALT水平顯著下降，OKPD各劑量組T-NOS水平顯著降低（P＜0.05），OKPD高劑量組AST 水平顯著低于OKPD 低劑量組（P＜0.05），見表2。

表2 OKPD對HLP小鼠血清中ALT、AST、T-NOS水平的影響，n=10

表2 OKPD對HLP小鼠血清中ALT、AST、T-NOS水平的影響，n=10

與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與OKPD低劑量組比較，&P＜0.05。

2.3 OKPD對HLP小鼠肝臟病理形態(tài)學的影響 光鏡下可見，正常對照組小鼠肝細胞結(jié)構(gòu)正常，肝細胞核清晰可見，核大而圓，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，清晰，肝索呈放射狀分布，肝間質(zhì)無明顯炎癥浸潤，整體無氣球樣變、點狀壞死及灶性壞死，未見病理改變。模型組小鼠肝細胞出現(xiàn)明顯腫脹，排列混亂，變形，部分胞質(zhì)溶解，呈空泡狀；肝小葉模糊不清，肝細胞核濃縮變小，呈點狀壞死；肝細胞之間邊際不清，中央靜脈區(qū)和匯管區(qū)分布有大量炎性細胞，同時可見明顯脂滴。OKPD高、中劑量組肝細胞結(jié)構(gòu)完整、清晰，呈放射狀排列，少見肝細胞腫脹、壞死及炎癥浸潤，OKPD低劑量組肝細胞雖較模型組有所改善，但依然可見肝細胞排序混亂、變形，腫脹，部分肝細胞呈空泡樣，見圖1。

圖1 小鼠肝臟組織HE染色圖（×200）

2.4 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α 及IL-6 蛋白表達比較 NF-κB、TNF-α、IL-6 陽性表達分別定位于肝細胞膜、細胞質(zhì)和細胞膜、細胞膜和細胞間隙中。與正常對照組比較，模型組肝組織NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；非諾貝特陽性對照組及OKPD各劑量組肝組織NF-κB、TNF-α及IL-6 蛋白表達較模型組明顯降低（P＜0.01），見圖2、圖3。OKPD高、中、低劑量組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。

圖2 肝組織NF-κB、TNF-α及IL-6蛋白表達的免疫組化染色圖（×400）

圖3 6組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表達比較

3 討論

Triton WR-1339，又稱四酚丁醛，是一種非離子型表面活性劑，現(xiàn)常作為實驗性HLP 的誘導劑，廣泛應用于降脂藥物的篩選。Triton WR-1339通過抑制脂蛋白脂肪酶的活性，可在短時間內(nèi)引起機體血清TC及TG異常，具有操作簡便，迅速的優(yōu)點[10]。文獻報道Triton WR-1339 誘導HLP 模型受劑量及造模時間的影響[11]。綜合文獻的研究報道及預實驗的結(jié)果，本研究的造模方案為一次性腹腔注射600 mg/kg Triton WR-1339，造模時間為24 h。

HLP 時機體內(nèi)脂類物質(zhì)發(fā)生顯著改變，TC、TG、LDL-C 水平異常升高，HDL-C 水平異常降低，以上指標常作為評價HLP 的“金標準”。在諸多危險因素中，LDL-C 的升高被認為是最危險的因素。LDL-C 積蓄于血管內(nèi)皮上，在氧化因子的作用下，進一步氧化形成氧化型LDL（ox-LDL）。ox-LDL可觸發(fā)血管內(nèi)皮上的系列炎癥反應及細胞凋亡，加重機體的炎癥狀態(tài)[12]。因此，LDL-C 升高被認為是不利因素。而HDL-C 則與之相反，在HLP 時，其呈現(xiàn)低表達狀態(tài)，被認為是有利因素。肝臟、小腸等機體多數(shù)器官參與TG 的合成與代謝，其中以肝臟合成能力最強。因此，通過檢測肝臟功能了解HLP的進程是必要的。Triton WR-1339 作為化學物質(zhì)，可增加肝細胞膜的通透性，使得肝細胞內(nèi)重要的酶如ALT、AST外漏。同時，異常升高的脂質(zhì)可反向加重肝臟的脂代謝負擔，進一步加劇肝臟細胞的損傷，阻礙脂代謝。二者相互作用，使得HLP和肝損傷惡性循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)Triton WR-1339 誘導的小鼠血清ALT及AST水平較正常對照組升高，表明在HLP 發(fā)生的同時伴隨著肝臟的損害。而OKPD 給藥組小鼠血清ALT、AST 水平較模型組顯著降低，說明OKPD 具有護肝的功效。以上結(jié)果提示，在降脂藥的研發(fā)過程及在臨床工作中，應該關(guān)注HLP引發(fā)或合并肝臟損害的情況，以便更好地指導臨床工作。

炎癥反應是機體抵御外界有害物質(zhì)侵入機體的常見病理過程，控制炎癥對于維持機體的正常代謝功能及抑制疾病的進展具有重要意義。研究表明，TNF-α 的激活與肝臟病變存在密切聯(lián)系。NFκB 是炎癥反應、免疫調(diào)節(jié)等過程的重要介質(zhì)，是調(diào)節(jié)細胞增殖、凋亡過程的重要因子。促炎因子的激活導致炎癥因子如NF-κB及其下游因子的釋放，引發(fā)機體炎癥級聯(lián)反應[13]。TNF-α是由多種細胞產(chǎn)生的中樞炎癥促進細胞因子，是控制炎癥過程的關(guān)鍵。IL-6主要由巨噬細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞產(chǎn)生，具有多種復雜生理功能，在機體發(fā)生炎癥反應或感染時，TNF-α 等多種細胞因子可誘導機體產(chǎn)生IL-6[14]。當上游刺激因子如TNF-α被激活時，IκB發(fā)生磷酸化反應，激活NF-κB?；罨腘F-κB 因子核定位序列被暴露，轉(zhuǎn)錄到核內(nèi)特定位點，啟動基因轉(zhuǎn)錄程序，產(chǎn)生或激活下游的其他因子。下游其他因子又可以反向激活NF-κB因子，形成反饋調(diào)節(jié)模式，從而使炎癥級聯(lián)反應擴大，加劇疾病的進展。Triton WR-1339誘導劑作為外源性物質(zhì)注射到小鼠體內(nèi)，激活TNF-α、IL-6等促炎因子及NF-κB炎癥因子。因此，有效抑制TNF-α、IL-6、NF-κB 的活化可以有效抑制機體的炎癥反應，進而緩解疾病的進展。本研究中，模型組小鼠肝索周圍可見大量炎癥細胞侵潤，肝細胞變性、壞死，OKPD 高、中、低劑量組少見炎癥細胞侵潤；免疫組化結(jié)果顯示，模型組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α、IL-6蛋白表達較正常對照組明顯升高，而OKPD 給藥組較模型組明顯降低。提示OKPD 能有效抑制HLP 小鼠肝組織炎癥反應。

綜上，OKPD通過抑制TNF-α、NF-κB、IL-6等炎癥因子的釋放，調(diào)節(jié)血脂，對實驗性高血脂癥小鼠發(fā)揮保護肝臟的作用。