陳曉軍，惠 建，馬洪文，白海波，馬 靜，馬斯霜，李樹華

(1.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究中心，銀川 750002；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)作物研究所，銀川 750002)

稻瘟病是危害水稻最嚴(yán)重的病害之一,由真菌(Magnaportheoryzae)引起，分布在世界各稻區(qū)，可引起水稻大幅度減產(chǎn)，嚴(yán)重時(shí)減產(chǎn)40%～50%，甚至顆粒無收[1]。利用分子標(biāo)記選育抗病品種是防治該病害最有效、最經(jīng)濟(jì)的方法。目前至少報(bào)道了69個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn)，共84個(gè)主效基因。這些基因成簇地分布于除第3 染色體外的所有水稻染色體上(2個(gè)隱性，其他顯性)，其中，Pid2,Pid3,Pb1,Pia,Pib,Pik,Pik-h/Pi54,Pit,Pik-m,Pik-p,Piz-t,Pish,Pita,Pi1,Pi2,Pi9,Pi5,pi21,Pi36,Pi25,Pi37,Pi63,Pi56,PiCO39等24個(gè)基因已被成功克隆(Piz-t、Pi9、Pi2同為Piz位點(diǎn)上的復(fù)等位基因；Pik-h/Pi54、Pi1、Pik-m、Pik-p同為Pik位點(diǎn)上的復(fù)等位基因；Pia與PiCO39等位；Pid3與Pi25等位)(http://www.ricedata.cn/gene/gene_pi.htm)[2-6]。

Li等[7]在廣譜高抗水稻地谷中，發(fā)現(xiàn)BSR-d1的啟動(dòng)子變異后對(duì)稻瘟病具有廣譜水平抗性，它是編碼 C 2 H 2 類轉(zhuǎn)錄因子的基因。BSR-d1基因的啟動(dòng)子區(qū)域一個(gè)核苷酸變異(A→G)，導(dǎo)致上游 MYB 轉(zhuǎn)錄因子對(duì)BSR-d1的啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合能力增強(qiáng)，抑制了BSR-d1誘導(dǎo)表達(dá)，并導(dǎo)致BSR-d1直接調(diào)控的H2O2降解酶基因表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞內(nèi)大量的H2O2賦予其抗病性，從新的角度提出了水稻抗病性分子機(jī)理。該等位基因變異對(duì)稻米品質(zhì)和產(chǎn)量性狀沒有明顯影響，具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

受環(huán)境條件和人為因素影響，傳統(tǒng)稻瘟病抗病育種僅通過田間或室內(nèi)抗性表型鑒定，降低了目標(biāo)基因的前景選擇。分子標(biāo)記輔助選擇是利用與目標(biāo)基因緊密連鎖或基因共分離的分子標(biāo)記來區(qū)分材料的基因型。水稻全生育期，包括種子在內(nèi)都可以鑒定目標(biāo)基因, 它不受環(huán)境影響, 從而大大提高了育種選擇的效率和準(zhǔn)確性。然而開發(fā)分子標(biāo)記的前提是對(duì)目標(biāo)基因的變異結(jié)構(gòu)有較為深刻的理解。本研究以75份北方粳稻品種為研究對(duì)象，利用PCR擴(kuò)增測(cè)序的方法研究BSR-d1有利等位基因的序列結(jié)構(gòu)變異，并驗(yàn)證其變異對(duì)靶基因的調(diào)控，為粳稻育種中骨干親本的選擇及抗病基因的聚合等提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2×Mixture PCR擴(kuò)增試劑盒購自北京擎天生物科技有限公司；DNA Marker DL 2000、瓊脂糖為北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品。

北方區(qū)試材料共計(jì)75份。材料具體名稱見表1。

表1 75份北方粳稻品種名稱Table 1 Names of 76 northern japonica rice varieties

1.2 BSR-d1 基因測(cè)序引物設(shè)計(jì)和合成

對(duì)稻瘟病抗性基因BSR-d1的克隆結(jié)果顯示，BSR-d1(LOC_Os03g32230)抗病基因在其啟動(dòng)子 618 位核苷酸堿基為G，而感病基因在該位點(diǎn)核苷酸堿基為A。在水稻基因組數(shù)據(jù)庫 (http://rice.plantbiology.msu.edu/)下載BSR-d1(LOC_Os03g32230)基因的核苷酸序列, 并分析相關(guān)序列, 利用Premier 5.0軟件在單核苷酸變異區(qū)域的前后兩側(cè)500 bp，設(shè)計(jì)包含該變異位點(diǎn)的引物, 預(yù)期PCR擴(kuò)增片段大小387 bp，設(shè)計(jì)引物序列如下 ，由北京捷瑞生物科技有限責(zé)任公司合成。

BSR-RP：gggcgtggttttggtgtggg

BSR-FP：gatacggactcatcgtttcgc

1.3 水稻葉片DNA和RNA提取

在水稻分蘗盛期選取新鮮幼嫩葉片，采用快速簡(jiǎn)易的方法提取水稻基因組 DNA，具體參考陳曉軍等[8]的方法。同時(shí)，利用TRZOL法提取對(duì)照材料富源4號(hào)和錢稻2號(hào)相應(yīng)時(shí)期葉片總RNA，備用。

1.4 目標(biāo)片段PCR 擴(kuò)增和測(cè)序

使用實(shí)驗(yàn)室常規(guī) PCR 擴(kuò)增技術(shù)，配制40 μL 反應(yīng)體系：模板 DNA (約20 ng·μL-1) 2 μL、BSR-FP引物 (10 μmol·L-1) 1 μL、BSR-RP引物 (10 μmol·L-1) 1 μL、2×Mixture 4 μL、添加滅菌雙蒸水 32 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃，預(yù)變性 5 min；94 ℃,30 s;55 ℃,30 s;72 ℃,45 s;共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃10 min延伸。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1% 的瓊脂糖(含0.1% Gel Read)凝膠電泳分離, 紫外凝膠成像系統(tǒng)成像檢測(cè) PCR 產(chǎn)物是否為單一擴(kuò)增產(chǎn)物。將單一擴(kuò)增產(chǎn)物送北京擎科生物科技公司測(cè)序，測(cè)序引物為BSR-RP (10 μmol·μL-1)。

注：M為DL 2 000 bp DNA marker， 各泳道為樣品的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。圖1 北方粳稻品種(部分)BSR-d1啟動(dòng)子區(qū)PCR擴(kuò)增Fig.1 PCR amplification of BSR-d1 promoter region in part of northern japonica rice varieties

1.5 BSR-d1 基因的序列比對(duì)

利用DNAMAN version 7.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

1.6 BSR-d1 相關(guān)基因的表達(dá)分析

在預(yù)冷的RNase free 的反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積13 μL。試劑組分體積終濃度總 RNA 1 μg，60 μmol·L-1Oligo(dT)181 μL ，DEPC水至總體積13 μL；混勻RNA引物混合物 ，進(jìn)行短暫離心，65 ℃變性10 min后立即放置冰上。在上述反應(yīng)管內(nèi)加入以下試劑至總體積25 μL。5×RT Reaction Buffer 5 μL，25 mmol·L-1dNTP 1 μL ；25 U·μL-1RNase Inhibitor 1 μL；200 U·μL-1M-MLV RTase 1 μL；DEPC水 4 μL。混勻反應(yīng)，短暫離心后42 ℃孵育1 h，反應(yīng)結(jié)束后85 ℃滅活處理5min，最后-20 ℃保存反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

采用染料法(SYBR Green I)以水稻泛素基因UBQ為內(nèi)參基因進(jìn)行過氧化物酶前體(Os05g04470，Os10g39170)兩個(gè)基因表達(dá)的相對(duì)定量分析。實(shí)驗(yàn)步驟如下：將2×Universal SYBR qPCR Master在室溫下融解，輕輕上下顛倒混勻并進(jìn)行瞬時(shí)離心。 實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)體系如下： 2×Universal SYBRqPCR Master 10 μL ；ddH2O 1 μL；PCR Forward Primer(4 μmol·L-1) 2 μL；PCR Reverse Primer(4 μmol·L-1) 2 μL；cDNA 5 μL；總體積 20 μL。實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?95 ℃,預(yù)變性 30 s;95 ℃,10 s;60 ℃,10 s;共 40 個(gè)循環(huán)。

所用引物序列如下：

Os05g04470-Real-F:CCATGGCGCCGTCCGCAACG

Os05g04470-Real-R:CTTGGCGCGGTCGATGACGC

Os10g39170-Real-F:CGACATCCTCGCCTTCGCCG

Os10g39170-Real-R:CCCGGTACAGGCGGCTGCTG

UBQ-F：CAAGATGATCTGCCGCAAATGC

UBQ-R:TTTAACCAGTCCATGAACCCG

2 結(jié)果與分析

2.1 BSR-d1 基因擴(kuò)增

以75份北方粳稻品種的 DNA 為模板, 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1%瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1)。由圖 1 可以看出，退火溫度為55 ℃擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物條帶清晰、單一且沒有雜帶, 其產(chǎn)物可以用于進(jìn)一步的DNA測(cè)序分析。

2.2 BSR-d1基因測(cè)序比對(duì)分析

利用DNAMAN 7.0序列分析軟件，將75份測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析，序列一致性達(dá)91.46%，見圖2。75個(gè)北方粳稻品種中，在BSR-d1基因啟動(dòng)子-618位不存在A和G的多態(tài)性，但花139和花140在其啟動(dòng)子-540位插入了CCCCG 5個(gè)堿基，在其啟動(dòng)子上游604位至上游609位ATATAA突變成TATAAG，同時(shí)還存在4個(gè)SNP位點(diǎn)(C-653T、G-716 A、T-724 A、T-762 C)；錢稻2號(hào)在啟動(dòng)子上游553位至559位缺失TGGCAAA 7個(gè)堿基，詳細(xì)位置見圖2。值得注意的是花139和花140的上游540位插入CCCCG 5個(gè)堿基、上游604位至609位ATATAA突變成TATAAG、4個(gè)SNP位點(diǎn)(C-653 T、G-716A、T-724 A、T-762 C) 突變類型與Digu的廣譜抗稻瘟病基因BSR-d1一致，暗示這兩個(gè)品種很可能具有相同的親緣關(guān)系，其抗病機(jī)理與地谷可能相同。

注：C-653 T，-604-609位ATATAA突變成TATAAG；錢稻2號(hào)-553-559位缺失TGGCAAA；花139和花140-540位插入CCCCG。圖2 BSR-d1測(cè)序部分序列比對(duì)分析Fig.2 Comparative analysis of BSR-d1 sequences

2.3 BSR-d1相關(guān)基因表達(dá)分析

熒光定量PCR的結(jié)果表明，在相同生長(zhǎng)條件和生育期下，對(duì)照材料富源4號(hào)與攜帶BSR-d1基因材料錢稻2號(hào)過氧化物酶相關(guān)基因Os05g04470和Os10g39170表達(dá)略微不同。過氧化物酶兩個(gè)相關(guān)基因在正常條件下，錢稻2號(hào)中表達(dá)比在富源4號(hào)中低。這暗示其過氧化物酶活性在攜帶BSR-d1基因材料中較低，推測(cè)H2O2水平高，使其具有水平抗性，與Li等[7]的研究結(jié)果一致。

圖3 BSR-d1相關(guān)基因表達(dá)分析Fig.3 Expression analysis of BSR-d1 related genes

3 討 論

對(duì)稻瘟病的防御，水稻中同時(shí)存在垂直抗性和水平抗性。垂直抗性是由一類編碼NBS-LRR(Nucleotide-binding site-leucine rich repeats)蛋白介導(dǎo)的抗性。在育種應(yīng)用上，這類主效抗性基因可操作性強(qiáng)、效果明顯，開展垂直抗性基因的鑒定及其應(yīng)用研究較多[9-17]。同樣，水稻中還存在著水平抗性，抗性是穩(wěn)定和持久的，也不會(huì)導(dǎo)致品種抗性的喪失。它對(duì)病原菌生理小種不形成定向選擇壓力，不致引起生理小種的變化。王軍等[18]對(duì) 324 份不同類型江蘇省和太湖流域的水稻品種和資源檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，271 份粳型資源中均不攜帶BSR-d1基因，11個(gè)秈稻品種和資源中含有BSR-d1基因，說明BSR-d1主要分布在秈型水稻資源中，并指出在粳型資源中幾乎不存在，這可能是該基因的功能位點(diǎn)突變發(fā)生在秈粳分化以后所致。通過本研究，發(fā)現(xiàn)了北方粳稻品種也有該基因的有利等位基因，3種單倍型只占3.95%(3/76)。劉暢媛等[19]在緬甸、老撾79份地方稻種資源中發(fā)現(xiàn)抗性基因BSR-d1變異頻率為10.13%，品種間存在18個(gè)變異位點(diǎn)和22個(gè)堿基差異，可劃分為6 種單倍型。緬甸老撾水稻資源攜帶持久抗性基因BSR-d1的品種比例遠(yuǎn)高于中國品種。這對(duì)我國選育稻瘟病持久抗性品種具有重要的利用價(jià)值。

本研究在粳稻背景中，發(fā)現(xiàn)了這些有利等位基因，有利于BSR-d1基因在北方粳稻育種中發(fā)揮更大作用。