馬振玲， 王 雷， 喬柳惠， 劉 薇

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，鄭州 450002)

CCL2(CC chemokine ligand 2)，又稱為單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP1)，是C-C趨化因子的一員，能夠募集單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等到炎癥部位并調(diào)節(jié)它們的活性，成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、單核細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞均能夠表達(dá)CCL2[1-2]。CCL2在多種腫瘤如結(jié)直腸癌、乳腺癌、卵巢癌中高表達(dá)，與患者不良預(yù)后密切相關(guān)[3]。研究表明，CCL2在急性髓系白血病(acute myeloblastic leukemia，AML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(acute lymphoblastic leukemia，ALL)中同樣發(fā)揮重要功能。AML患者血漿中CCL2含量比正常對照組顯著性升高，且CCL2促進(jìn)單核細(xì)胞向AML細(xì)胞的遷移[4-5]。同時，CCL2在AML、ALL患者血漿、骨髓及轉(zhuǎn)移部位高表達(dá)，提示CCL2與白血病耐藥、不良預(yù)后呈正相關(guān)。以上研究主要集中于CCL2在白血病中的表達(dá)量分析，但是CCL2在白血病中的作用機(jī)制報道較少。深入研究CCL2在白血病中的作用機(jī)制，有助于我們從細(xì)胞因子角度開展藥物靶向治療，為白血病的治療、預(yù)后提供新的思路和分子靶點。

前期研究發(fā)現(xiàn)，CCL2在白血病骨髓微環(huán)境中表達(dá)顯著性升高，而CCL2的來源以及在白血病中的調(diào)控機(jī)制尚不清楚[6]。腫瘤微環(huán)境中CCL2表達(dá)上調(diào)的可能原因：(1)腫瘤細(xì)胞本身表達(dá)CCL2；(2)腫瘤細(xì)胞受到刺激產(chǎn)生大量CCL2；(3)基質(zhì)細(xì)胞出于對刺激的應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生CCL2[7]。為了探索外源性CCL2在白血病中的功能，本研究構(gòu)建了pGEX-4T-CCL2原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌BL21(ED3)中表達(dá)和純化了CCL2融合蛋白，初步檢測了CCL2重組蛋白對白血病細(xì)胞黏附和細(xì)胞遷移的影響，旨在為CCL2在白血病功能及機(jī)制的深入研究提供材料和奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

原核表達(dá)載體pGEX-4T-1、Escherichiacoli(E.coli)DH5α、E.coliBL21(DE3)菌株和C1498細(xì)胞為本實驗室保存，pECMV-CCL2-m-FLAG載體購自淼靈質(zhì)粒共享平臺。引物合成及DNA測序由鄭州瑞優(yōu)生物科技有限公司完成。KOD高保真酶購自ToYoBo生物科技有限公司。限制性內(nèi)切酶BamH Ⅰ、XhoⅠ、核酸外切酶Ⅲ購自NEB有限公司。DNA Marker購自博邁德生物有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司。谷胱甘肽瓊脂糖凝膠(Glutathione Sepharose 4B)購自GE Healthcare公司。IPTG、考馬斯亮藍(lán)R-250購自賽國生物科技。蛋白Marker購自賽默飛世爾科技公司?？笹ST標(biāo)簽單克隆抗體購自北京全式金生物科技有限公司?？笴CL2單克隆抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG、ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑購自莊盟生物。其他常規(guī)試劑為分析純。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計及小鼠CCL2基因擴(kuò)增

根據(jù)小鼠CCL2mRNA序列(NM_011333)設(shè)計引物，mCCL2-F：5′- CGCGTGGATCCATGCAGGTC-3′，mCCL2-R：5′- GGCCGCTCGAGCTAGTTCACTGT-3′(下劃線為BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位點，前5個堿基為與載體重復(fù)序列)，由鄭州瑞優(yōu)生物科技有限公司合成。以pECMV-CCL2-m-FLAG載體為模板，PCR擴(kuò)增小鼠CCL2基因。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增完成之后，PCR產(chǎn)物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠并用DNA凝膠回收試劑盒回收。

1.2.2 LIC法構(gòu)建重組載體pGEX-4T-CCL2

pGEX-4T-1載體用BamH Ⅰ和XhoⅠ于37 ℃酶切2 h，用1.0%瓊脂糖凝膠檢測并切膠回收。將PCR回收產(chǎn)物與載體雙酶切回收產(chǎn)物按5∶1的比例混合，加入核酸外切酶Ⅲ冰上放置1 h，加入1 μL 0.5 mmol/L EDTA(pH 8.0)，60 ℃處理5 min終止反應(yīng)。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，在氨芐青霉素LB平板上篩選，陽性克隆經(jīng)菌液PCR、雙酶切鑒定和DNA測序。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將pGEX-4T-CCL2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜。次日，按1∶100的比例接種于2×YTA培養(yǎng)液中，37 ℃培養(yǎng)2～3 h至OD600達(dá)到0.6～0.8，取一個試管作為陰性對照，其余組加入IPTG至終濃度為0.1、0.3或0.5 mmol/L，20 ℃～28 ℃誘導(dǎo)5～10 h。離心收集菌液，超聲波破碎，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液。加入4×SDS loading buffer，100 ℃煮沸10 min進(jìn)行10% SDS-PAGE蛋白電泳檢測?？捡R斯亮藍(lán)R-250染色3 h，脫色液脫色處理后分析融合蛋白表達(dá)情況。

1.2.4 重組蛋白的純化及鑒定

按照上述條件誘導(dǎo)100 mL菌液，離心收集，超聲裂解菌液，4 ℃、12 000 r/min離心10 min收集上清液。取1 mL Glutathione Sepharose 4B裝入5 mL層析柱中，于4 ℃加入5倍柱床體積的PBS平衡。將收集的蛋白上清液過柱，反復(fù)將流穿液過柱3次，用5 mL PBS洗滌3次，最后用2 mL還原谷胱甘肽洗脫液洗脫，收集樣品進(jìn)行10% SDS-PAGE蛋白電泳檢測。將蛋白條帶轉(zhuǎn)至PVDF膜上，經(jīng)5%牛血清白蛋白封閉2 h后，4 ℃孵育小鼠抗GST單克隆抗體、小鼠抗CCL2單克隆抗體過夜。1×TBST洗膜3次，每次12 min；加入HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG室溫孵育2 h，1×TBST洗膜3次，每次12 min。最后用ECL發(fā)光試劑顯影。

1.2.5 CCL2對C1498細(xì)胞黏附的檢測

C1498細(xì)胞計數(shù)，按照每孔10 000個細(xì)胞接到96孔板中，設(shè)置GST蛋白為對照組，在實驗組中加入200、500 ng的CCL2重組蛋白，3 h后吸去培養(yǎng)基加入CCK8或者用化學(xué)發(fā)光儀檢測熒光情況，分析細(xì)胞黏附能力。

1.2.6 CCL2對C1498細(xì)胞遷移的檢測

將微孔直徑為8 μm的transwell小室放置于24孔板中，在下室加入不同濃度(200和500 ng/mL)的重組CCL2蛋白，并以GST蛋白作為陰性對照，上室加入不含血清的C1498細(xì)胞，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中，24 h后計數(shù)下室細(xì)胞，分析外源CCL2對白血病細(xì)胞遷移能力的調(diào)控作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠CCL2基因擴(kuò)增

以含目的基因的pECMV-CCL2-m-FLAG載體為模板進(jìn)行小鼠CCL2基因的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，如圖1所示，在250～500 bp且靠近500 bp處出現(xiàn)條帶，與預(yù)期目的片段大小(447 bp)相一致。

M：DNA Marker；1：PCR產(chǎn)物。圖1 小鼠CCL2基因PCR擴(kuò)增Figure 1 Amplification of mouse CCL2

2.2 pGEX-4T-CCL2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆接種于含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，進(jìn)行菌液PCR鑒定。結(jié)果[圖2(a)]顯示，1～5號菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在接近500 bp處可見特異性條帶，條帶大小與預(yù)期片段大小相符。選取1～3號克隆提質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切鑒定。經(jīng)BamH Ⅰ和XhoⅠ雙酶切后產(chǎn)生了約500 bp的片段，與PCR擴(kuò)增的目的片段大小一致[圖2(b)]。最后對1～3號克隆送公司測序，與GenBank報道序列比對結(jié)果顯示一致，表明成功構(gòu)建了pGEX-4T-CCL2原核表達(dá)載體。

(a)菌液PCR鑒定(M：DNA Marker，1～5：菌液PCR產(chǎn)物)；(b)重組質(zhì)粒pGEX-4T-CCL2雙酶切(M：DNA Marker，1～3：雙酶切克隆)。圖2 pGEX-4T-CCL2重組子的鑒定Figure 2 Identification of pGEX-4T-CCL2

2.3 GST-CCL2融合蛋白的表達(dá)

分別用不同溫度(28 ℃、20 ℃)，以及不同IPTG濃度(0.1、0.3 和0.5 mmol/L)誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳并經(jīng)考馬斯亮藍(lán)R-250染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IPTG濃度對GST-CCL2融合蛋白的表達(dá)影響不大。在28 ℃誘導(dǎo)表達(dá)6 h沒有可溶性GST-CCL2表達(dá)，當(dāng)溫度降到20 ℃時，SDS-PAGE顯示在40 ku處有與GST-CCL2理論分子質(zhì)量(41.3 ku)相似的可溶性蛋白存在，而未誘導(dǎo)組則未見蛋白條帶(圖3)。

(a)28 ℃誘導(dǎo)GST-CCL2融合蛋白的表達(dá)(M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～4分別為0、0.1、0.3和0.5 mmol/L IPTG)；(b)20 ℃誘導(dǎo)GST-CCL2融合蛋白的表達(dá)(M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1～4分別為0、0.1、0.3和0.5 mmol/L IPTG，箭頭所指為GST-CCL2)。圖3 SDS-PAGE電泳檢測GST-CCL2融合蛋白的表達(dá)Figure 3 SDS-PAGE analysis of the GST-CCL2 expression

2.4 GST-CCL2融合蛋白的純化及鑒定

大量誘導(dǎo)菌液，超聲波裂解后離心取上清液過Glutathione Sepharose 4B凝膠柱，用還原型谷胱甘肽洗脫，結(jié)果顯示成功純化出GST-CCL2融合蛋白[圖4(a)]，并成功純化出GST蛋白[圖4(b)]。GST-CCL2融合蛋白經(jīng)Western Blot檢測，分別孵育GST和CCL2抗體，化學(xué)發(fā)光顯色后結(jié)果如圖4(c)和(d)所示，融合蛋白可以與GST抗體發(fā)生特異性反應(yīng)[圖4(c)]，也可與CCL2抗體發(fā)生特異性反應(yīng)[圖4(d)]。除了GST-CCL2與GST抗體結(jié)合外，還有部分GST蛋白出現(xiàn)特異性結(jié)合，說明在純化過程中可能有融合蛋白由于GST標(biāo)簽丟失而不能通過親和層析純化。

(a)SDS-PAGE檢測GST-CCL2[M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1：0 mmol/L IPTG，2：0.1 mmol/L IPTG，3：流穿液，4：凝膠株，5：洗脫液(箭頭所指為GST-CCL2)]；(b)SDS-PAGE檢測GST[M：蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)，1：0 mmol/L IPTG，2：0.1 mmol/L IPTG，3：洗脫液(箭頭所指為GST)]； (c)GST抗體Western Blot檢測GST-CCL2[1：0 mmol/L IPTG，2：0.1 mmol/L IPTG，3：洗脫液(箭頭所指為GST-CCL2)]；(d)：CCL2抗體Western Blot檢測GST-CCL2[1：0 mmol/L IPTG，2：0.1 mmol/L IPTG，3：洗脫液(箭頭所指為GST-CCL2)]。圖4 GST-CCL2融合蛋白的純化與鑒定Figure 4 Purification and identification of GST-CCL2 fusion protein

2.5 CCL2對C1498細(xì)胞黏附的檢測

為了檢測外源性CCL2對白血病細(xì)胞黏附的影響，利用重組蛋白處理進(jìn)行細(xì)胞黏附實驗。在C1498細(xì)胞中加入200 和500 ng小鼠CCL2重組蛋白，以GST蛋白為陰性對照，結(jié)果如圖5所示。說明CCL2能夠促進(jìn)C1498細(xì)胞黏附。

(a)200 ng CCL2重組蛋白對C1498細(xì)胞黏附的影響；(b)500 ng CCL2重組蛋白對C1498細(xì)胞黏附的影響。** 為P<0.01，*** 為P<0.001。圖5 CCL2對白血病細(xì)胞黏附的影響Figure 5 Effect of CCL2 on leukemia cell adhesion

2.6 CCL2對C1498細(xì)胞遷移的檢測

為了檢測外源性CCL2對白血病細(xì)胞遷移的作用，利用重組蛋白進(jìn)行細(xì)胞遷移實驗。加入200 和500 ng小鼠CCL2重組蛋白，同時設(shè)立GST蛋白為陰性對照組。結(jié)果顯示CCL2能夠促進(jìn)C1498細(xì)胞遷移(圖6)。

(a)200 ng CCL2重組蛋白對C1498細(xì)胞遷移的影響；(b)500 ng CCL2重組蛋白對C1498細(xì)胞遷移的影響。* 為P<0.05，** 為P<0.01。圖6 CCL2對白血病細(xì)胞遷移的影響Figure 6 Effect of CCL2 on leukemia cell migration

3 討論與結(jié)論

本研究采用不依賴連接反應(yīng)克隆(ligation-independent cloning，LIC)的方法構(gòu)建原核表達(dá)載體，在設(shè)計引物時在目的片段的5′端添加與載體同源黏性末端，依賴核酸外切酶Ⅲ的3′-5′外切酶活性，利用帶缺口和突出端的DNA復(fù)合物在細(xì)菌中能夠被有效修復(fù)的特點，高效地得到了重組質(zhì)粒。LIC法不需要連接酶的參與，并且克服了經(jīng)典連接克隆方法長片段連接大載體難度大、酶切位點有限、受酶切位點限制大的缺點，使得基因的克隆更加靈活、快捷及高效[8]。我們隨機(jī)挑選了5個克隆搖菌后進(jìn)行菌液PCR鑒定，結(jié)果顯示5個克隆都是陽性；進(jìn)一步選取3個克隆提質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果均為陽性，最終測序結(jié)果也表明序列及插入方向的正確性。目前，LIC法已被廣泛地用于GST、His標(biāo)簽以及基因敲除載體構(gòu)建中[9-11]。

pGEX-4T-1作為常用的表達(dá)GST融合蛋白的原核表達(dá)載體，具有增加重組蛋白可溶性的優(yōu)點。但很多GST融合蛋白表達(dá)過程中容易發(fā)生GST標(biāo)簽的丟失，導(dǎo)致部分重組蛋白不能高效的純化，WB結(jié)果顯示GST-CCL2存在標(biāo)簽丟失和降解的現(xiàn)象，具體原因還不明確[12-13]。在表達(dá)純化GST-CCL2時發(fā)現(xiàn)，溫度對重組蛋白的表達(dá)具有明顯的影響。在28 ℃誘導(dǎo)條件下，SDS-PAGE結(jié)果顯示沒有可溶性蛋白存在，當(dāng)溫度降至20 ℃時可以獲得可溶性GST-CCL2蛋白，說明優(yōu)化誘導(dǎo)溫度在蛋白純化過程中發(fā)揮重要作用。天然CCL2富含蘇氨酸、絲氨酸，約有50%蛋白在不同位點發(fā)生不同程度的糖基化修飾[14]。有研究發(fā)現(xiàn)嚙齒動物CCL2突變?nèi)笔腔腃末端后，不能發(fā)生二聚化/寡聚化，但具有更高的趨化作用，揭示CCL2介導(dǎo)的信號傳遞需要CCL2以單體形式存在[15]。Ruggiero 等[16]在酵母中表達(dá)人源CCL2，產(chǎn)生了不同的糖基化重組蛋白混合物，體外趨化實驗顯示，相對于大腸桿菌中表達(dá)的非糖基化CCL2，糖基化CCL2活性降低了4～20倍，但是在37 ℃長時間孵育能夠保持穩(wěn)定性。NEEDHAM 等[17]通過LCR/MEL系統(tǒng)表達(dá)的糖基化和非糖基化人CCL2具有同等的生物學(xué)活性。在純化CCL2重組蛋白過程中發(fā)現(xiàn)CCL2容易降解，可能與CCL2未發(fā)生糖基化修飾有密切關(guān)系。

目前，多項研究表明腫瘤組織中不同細(xì)胞來源的CCL2可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移以及侵襲，小鼠實驗也發(fā)現(xiàn)用CCL2或CCR2中和型抗體阻斷CCL2/CCR2軸，能夠明顯抑制腫瘤的增殖，并且抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移[18]。在乳腺癌、前列腺癌、肺癌等惡性腫瘤的臨床動物學(xué)實驗中，阻斷CCL2/CCR2軸均能夠顯著性減弱腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，目前已經(jīng)開展了靶向阻斷腫瘤患者CCL2/CCR2軸的一期、二期臨床試驗，開發(fā)相關(guān)藥物[19-21]。CCL2在白血病中的功能及機(jī)制報道較少，有研究表明白血病細(xì)胞的黏附能力與疾病的發(fā)生密切相關(guān)，ALL細(xì)胞可以表達(dá)不同的黏附整合蛋白，如T細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(T cell acute lymphoblastic leukemia，T-ALL)中的LFA-1、B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL)中的VLA-4[22]，與白血病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)外源性CCL2能夠促進(jìn)白血病細(xì)胞的黏附和遷移，初步揭示了CCL2促進(jìn)白血病細(xì)胞浸潤的機(jī)制，下一步將深入研究CCL2在白血病中作用的分子機(jī)理。趨化因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展及治療中的功能已經(jīng)引起越來越多學(xué)者的關(guān)注。Dong等[23]研究發(fā)現(xiàn)，骨髓微環(huán)境中Ptpn11發(fā)生激活突變時，可以導(dǎo)致造血干細(xì)胞的異常最終形成白血病。間充質(zhì)祖細(xì)胞/干細(xì)胞中Ptpn11發(fā)生突變時，能夠引起CCL3的持續(xù)表達(dá)，進(jìn)而募集單核細(xì)胞至造血微環(huán)境，而單核細(xì)胞產(chǎn)生的interleukin-1β以及其他炎癥因子使惡變造血干細(xì)胞過度激活，進(jìn)而形成白血病。CCL3受體拮抗劑能夠有效逆轉(zhuǎn)由骨髓微環(huán)境中Ptpn11突變引起的白血病，CCL3可作為白血病治療的潛在靶點。本研究為深入研究CCL2在白血病發(fā)生中的作用機(jī)制提供材料并奠定基礎(chǔ)，將有助于我們進(jìn)一步闡明白血病的發(fā)病機(jī)理，為白血病的臨床靶向治療、預(yù)后和預(yù)防提供新的思路和分子靶點。