黃 霞， 康喜龍， 孟 闖， 顧 丹， 焦新安， 潘志明

(1.揚州大學 江蘇省人獸共患病學重點實驗室，揚州 225009；2. 揚州大學 江蘇高校動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚州 225009；3. 揚州大學 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子(動物源)控制重點實驗室，揚州 225009；4. 揚州大學 農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國際合作聯(lián)合實驗室，揚州 225009)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的豬高致死性出血性疾病。高毒力株引起超急性和急性疾病，使豬群在感染后短時間內(nèi)死亡率達100%。非洲豬瘟自1921年在肯尼亞被首次報道后，主要在撒哈拉以南的非洲國家呈地方流行。1957年ASF首次在歐洲葡萄牙出現(xiàn)，該疫情被撲滅后，又于1960年重現(xiàn)，后蔓延至撒丁島、加勒比等地區(qū)。到20世紀90年代，除撒丁島外，這些國家的疫情都被根除[1]。2007年，可能因東非受感染豬肉引入，ASF進入格魯吉亞；然后，迅速蔓延到俄羅斯和東歐一些國家。2018年8月，ASF在我國沈陽首次被發(fā)現(xiàn)[2]。至2019年底，全國共報告發(fā)生162起ASF疫情，撲殺生豬近120萬頭。由于尚無針對ASF的有效疫苗，目前只能采取撲殺的方式控制疫情，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。因此，迫切需要研發(fā)安全有效的疫苗應對當前的疫情。

1 非洲豬瘟病毒

1.1 結構與理化特性

ASFV是目前已知的唯一由蟲媒傳播的雙鏈DNA大型囊膜病毒。ASFV病毒體是大約200 nm的二十面體，結構對稱，由5個同心層形成，從內(nèi)到外依次為內(nèi)核、內(nèi)核心殼、內(nèi)膜、衣殼和囊膜。內(nèi)核由基因組、核蛋白，以及類核形成。內(nèi)核心殼是主要由多聚蛋白pp62和pp220組成的寬蛋白層。內(nèi)膜緊挨核殼，電子顯微鏡下為單一的脂膜，含有p54、p17和p12蛋白。衣殼主要為p72蛋白。囊膜則是在病毒出芽過程中從細胞質(zhì)膜獲得[3]。ASFV基因組的長度為170～194 kb，有150～167 個開放閱讀框(open reading frame, ORF)，可編碼150多種蛋白質(zhì)，其中包括結構蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白。ASFV編碼的多基因家族(multigene families, MGFs)占基因組的17%～25%，這直接決定了不同毒株基因組之間長度的變化[4]。

1.2 傳播途徑

ASFV可感染家豬和野豬，包括非洲的疣豬和叢林豬以及歐亞大陸的野豬。軟蜱作為天然的病毒儲存宿主，可通過叮咬傳播病毒。被感染豬的組織或體液、未煮熟的豬副產(chǎn)品、受污染的材料和受感染的軟蜱是該病傳播的主要途徑。而此次我國ASF的暴發(fā)，主要是由于感染豬及其副產(chǎn)品的大范圍運輸導致的傳播[5]。

1.3 致病性

根據(jù)ASFV毒力的不同，ASF的臨床癥狀可表現(xiàn)為長期持續(xù)感染和高度急性疾病。高毒力株感染后，可引起超急性和急性疾病，伴有高熱、嗜睡、出血性病變等癥狀。血小板及淋巴細胞減少是其主要特征[6]。由中等毒力株引起的亞急性疾病，死亡率30%～70%。低毒力株一般導致低病死率和無血管病變的慢性疾病，可能會出現(xiàn)消瘦、關節(jié)腫脹和皮膚潰瘍[7]。野豬和疣豬一般呈輕度或持續(xù)感染。長期持續(xù)感染的豬只可至少排毒70 d[8]，這是病毒持續(xù)存在的原因之一。

1.4 感染與免疫機制

ASFV進入細胞是一個依賴溫度、能量、膽固醇和低pH值的過程，主要感染單核巨噬細胞。網(wǎng)格蛋白介導的內(nèi)吞與肌動蛋白驅(qū)動的巨胞飲是ASFV侵入巨噬細胞的主要方式[3]。巨噬細胞作為免疫系統(tǒng)的多功能細胞，對感知和殺滅病原體以及隨后激發(fā)先天性和適應性免疫反應都必不可少。然而，ASFV具有獨特的免疫逃逸機制可抵抗巨噬細胞殺傷，ASFV對單核吞噬細胞的細胞嗜性以及其在體內(nèi)復制和調(diào)節(jié)巨噬細胞功能的能力是其致病的關鍵因素[9]。

ASFV可通過調(diào)節(jié)細胞因子和促炎因子的表達來實現(xiàn)免疫逃逸。I型干擾素(interferon I, IFN-I)是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可抑制病毒在細胞內(nèi)的復制、成熟和細胞間傳播。有研究表明使用IFN-α預處理豬巨噬細胞可顯著抑制ASFV復制[10]。ASFV還可編碼多種免疫調(diào)節(jié)蛋白，這些蛋白會干擾并下調(diào)宿主多種免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達。ASFV感染期間，白介素-1(interleukin 1, IL-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNFα)等150多種細胞因子失調(diào)。ASFV編碼的A238L就是一種多功能免疫調(diào)節(jié)蛋白，可通過抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的活化來調(diào)節(jié)促炎因子和細胞因子的分泌。宿主對抗ASFV入侵的另一種主要防御策略是通過凋亡清除受感染的細胞。然而ASFV可通過表達能夠競爭和隔離促凋亡蛋白的蛋白質(zhì)(如A179L、A224L和DP71L)逃逸早期凋亡[11]。

2 非洲豬瘟疫苗研究進展

20世紀50年代第一次報道了從ASFV感染中恢復的豬能夠免受病毒的再次攻擊[12]。ASFV感染后，存活的豬只可以產(chǎn)生強烈的保護性免疫應答，這表明研制有效的非洲豬瘟疫苗是可能的。雖然在過去幾十年中，已開展了對ASF滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗等多項研究，但到目前為止仍未獲得一種安全、有效的ASF疫苗。2020年3月，中國農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所創(chuàng)制的ASFV疫苗已通過農(nóng)業(yè)農(nóng)村部評審，獲準在黑龍江、新疆和河南三地開展臨床試驗[13]。

2.1 滅活疫苗

作為控制傳染性疾病的重要措施之一，滅活疫苗通常被優(yōu)先選擇研究。雖然滅活疫苗具有抗原性，但由于物理或化學滅活手段而喪失了感染能力，無法產(chǎn)生持久的免疫應答是這類疫苗的主要缺點之一。

Forman等用戊二醛與洗滌劑分別處理ASFV感染后的豬肺泡巨噬細胞，并將其免疫豬。結果發(fā)現(xiàn)攻毒后戊二醛處理組可更快速地產(chǎn)生血清學反應，病毒血癥水平輕微降低；而洗滌劑處理組未觀察到明顯血清學反應，對同源攻擊不具有免疫保護作用[14]。除此之外，也有研究通過其他方式滅活病毒，如滅活感染細胞的提取物、純化滅活的病毒粒子等，均不能產(chǎn)生有效的免疫保護[15]。而Blome等[16]的研究表明加有佐劑PolygenTM與Emulsigen?-D的滅活ASFV制劑可在豬中誘導產(chǎn)生針對ASFV p73和p30的特異性抗體，但仍未觀察到有效的免疫保護作用。截至投稿時，未有傳統(tǒng)ASF滅活疫苗研發(fā)成功的報道。

2.2 減毒活疫苗

2.2.1 傳統(tǒng)減毒活疫苗

通過病毒在體外或非宿主動物中連續(xù)傳代致弱病毒的減毒活疫苗已成功控制多種病毒性疾病。同樣，在ASF減毒疫苗的研制中，已進行了多種天然或體外減毒的ASFV免疫的實驗。有研究顯示天然減毒的OURT88/3和NH/P68 ASFV毒株可誘導產(chǎn)生良好的免疫保護，抵抗強毒株的攻擊[17]。雖然使用傳統(tǒng)方法減毒的ASFV毒株免疫豬會產(chǎn)生針對同源病毒的長期抵抗力，但其很少能抵抗異源病毒的攻擊。此外，傳統(tǒng)減毒活疫苗通常會產(chǎn)生副作用，如瘀斑、壞死灶等，這限制了其在生產(chǎn)中的進一步應用。傳統(tǒng)減毒活疫苗還可能導致慢性或持續(xù)性感染，并有恢復毒力的風險。

2.2.2 基因工程減毒活疫苗

目前，通過比較基因組和功能基因組學研究已經(jīng)確定了與病毒毒力和宿主應答相關的ASFV基因。TK、UK、9GL是已知與ASFV毒力相關的基因，而MGF360和505/530基因可抑制宿主產(chǎn)生I型IFN。這些基因的缺失可導致病毒毒力的下降，同時能夠誘導針對同源病毒的保護性免疫應答。Monteagudo等[18]將CD2v/EP402R缺失的Ba71 ASFV毒株(基因I型)免疫豬后，其能夠誘導產(chǎn)生保護性免疫應答，抵抗同源Ba71或異源E75(基因I型)和Georgia07(基因II型)ASFV強毒株的攻擊。這種交叉保護反應在眾多基因缺失候選疫苗中比較少見，表明基于CD2v的減毒活疫苗具有較大的開發(fā)前景。2019年，軍事醫(yī)學科學院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良教授團隊[19]以我國流行ASF毒株SY18為親本構建了MGF和CD2v雙基因缺失株，對豬安全且接種豬能100%抵抗親本毒株的攻擊。此外,近期中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所步志高研究員團隊[20]以我國ASFV HLJ/18株為骨架，構建了不同基因缺失的重組病毒。通過在豬體內(nèi)的多項試驗，遴選出一株7基因缺失病毒(HLJ/18-7GD)可在豬體內(nèi)完全減毒，不能轉化為強毒株，對豬的致死性ASFV攻擊有完全的保護作用。

多基因缺失株盡管在安全水平上有所提高，但與單基因缺失株相比，喪失了原有的保護作用。Abrams等[21]同時缺失了天然減毒株OURT88/3中的UK和NL毒力基因后，免疫保護效力由100%降至66%。這可能是由于多種基因缺失使得病毒復制受到了極大的影響，而免疫保護的實現(xiàn)需要一定程度的病毒復制水平。

此外，研究表明不同毒株缺失相同基因后的免疫保護效果也不一定相同。例如，Sanford等[23]通過缺失Malawi毒株中的TK基因使之減毒，并成功誘導產(chǎn)生了對同源病毒攻擊的保護[22]。但同樣缺失Georgia07強毒株中的TK基因則喪失了免疫保護效力。

2.3 亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗

與減毒活疫苗相比，基于抗原和單個或小部分基因的疫苗具有更高的安全性。一些與ASFV病毒附著和內(nèi)化相關的蛋白，如p54、p30、p72和CD2v等，已用于亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗的研制(表1)。研究表明這些疫苗可以誘導機體產(chǎn)生特異性的抗體反應，但大部分只能提供部分的免疫保護。以下對研究較多的p54、p30、p72和CD2v蛋白的特性及相關疫苗進展進行概述。

2.3.1 p30與p54

p30由ASFV的ORFCP204L基因編碼，蛋白大小約為23.6 ku。 p30在ASFV感染早期表達，通常于感染后2～4 h產(chǎn)生，12 h后合成減少，在整個感染期間均能檢測到，與病毒入侵細胞密切相關[24]。作為ASFV重要的結構蛋白，p30也是最具抗原性的蛋白之一，可誘導感染動物產(chǎn)生中和抗體。目前，p30被廣泛應用于ASFV的血清學檢測。

p54由E183L基因編碼，是ASFV表達的早期膜蛋白，大小為19.9 ku。p54位于病毒顆粒的內(nèi)囊膜，在病毒的吸附和入侵中發(fā)揮重要作用。研究表明p54可直接與動力蛋白C-末端的輕鏈8(LC8)結合，形成病毒跨膜結構域，實現(xiàn)病毒在胞質(zhì)內(nèi)的轉運。ASFV感染后，p54-LC8復合物利用一個含13個氨基酸殘基的序列，與抗凋亡蛋白Bcl-2結合，消除其對細胞凋亡的抑制作用，同時caspase 3和caspase 9被激活，進而誘導細胞凋亡[25]。

p30和p54在病毒感染過程中具有相似作用，常聯(lián)合用于亞單位疫苗的研制。 Gómez-puertas等[26]單獨用p30或p54蛋白免疫豬后，可以誘導產(chǎn)生中和抗體，但免疫的豬不能抵抗強毒株的攻擊。然而，采取同時免疫p54和p30的策略，攻毒后，豬臨床癥狀有所延緩，病毒血癥也得到緩減，50%的豬可免受E75毒株的攻擊。

同樣，p54和p30也是DNA疫苗的靶標抗原。Argilaguet等[27]使用編碼p54和p30融合蛋白的重組質(zhì)粒免疫仔豬，并不能產(chǎn)生中和抗體和T細胞應答。然而將p54和p30與ASFV血凝素蛋白的胞外可溶性結構域(sHA)融合，構建重組質(zhì)粒免疫豬后可誘導特異性的體液和細胞免疫應答，但未發(fā)揮免疫保護作用[28]。最近，Lacasta等[29]的研究使用編碼泛素蛋白的基因序列與上述構建的p54/p30/sHA質(zhì)粒融合表達時，不僅可誘導體液與細胞免疫應答，也可抵御少量病毒的攻擊。

2.3.2 p72

p72產(chǎn)生于病毒感染晚期，是ASFV主要的衣殼蛋白，由B646L基因編碼。p72序列高度保守，且具有高度抗原性和免疫原性，常用于病毒檢測和疫苗的研制。使用基于桿狀病毒表達的ASFV蛋白p30、p54、p72和p22免疫豬，雖然在感染動物體內(nèi)檢測到了高滴度的中和抗體，但不能提供免疫保護[30]。陳新新等[31]利用反向遺傳技術構建表達p72 的重組新城疫病毒免疫BALB/c小鼠后，可產(chǎn)生較高滴度的p72特異性抗體，還可引發(fā)T細胞增殖和IFN-γ、IL-4等細胞因子的分泌。盡管p72已與多種蛋白聯(lián)合制作疫苗，但都缺乏相關的動物實驗來驗證其保護效力。

2.3.3 CD2v

CD2v由ORFEP402R基因編碼，是ASFV唯一的糖蛋白，與T淋巴細胞表面黏附受體CD2類似。研究表明CD2v協(xié)助紅細胞結合到感染細胞和胞外病毒粒子以促進病毒擴散。由于豬紅細胞表面具有CD2受體，因此ASFV病毒極易吸附到紅細胞上[25]。此外，缺失了CD2v的Ba71減毒株可產(chǎn)生針對同源病毒和異源病毒的交叉免疫保護，且能產(chǎn)生特異性 CD8+T 淋巴細胞應答，證實了CD2v還可抑制淋巴細胞增殖[15]，這使得CD2v成為亞單位疫苗研發(fā)的主要抗原蛋白之一。使用重組CD2v蛋白免疫豬只，然后利用強毒E75株進行攻毒，豬只可產(chǎn)生CD2v特異性IgG抗體，盡管有兩只動物檢測到攜帶病毒，但免疫保護效率高達100%[32]。最近，Sunwoo等[33]使用組合的ASFV質(zhì)粒DNA(CD2v、p72、p32和p17)和重組蛋白(p15、p35、p54和p17)聯(lián)合免疫豬，進行免疫效果評價。結果顯示接種疫苗后只檢測到少量的抗原特異性T細胞，未檢測到中和抗體，同時不能提供免疫保護。由于CD2v相關亞單位、核酸等疫苗的研究相對較少且缺少對強毒攻擊的免疫保護評價，所以后續(xù)需要進一步對其研究。

除上述4種熱點蛋白外，pp62、A151R、K205R及B602L等也都可作為靶抗原，用于疫苗研制的研究，但較少的細胞免疫保護以及保護效率方面數(shù)據(jù)的缺乏不足以支撐疫苗的研發(fā)。因此，為了進一步建立ASF亞單位疫苗研發(fā)平臺，需要更深入地探究相關的ASFV保護性抗原與現(xiàn)有病毒株多樣性之間的關系。

表1 ASFV亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗

3 我國非洲豬瘟疫苗研發(fā)的挑戰(zhàn)

盡管目前針對ASF滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗等進行了多方面嘗試研究，但結果并不盡如人意，所以ASF疫苗的研發(fā)還面臨許多挑戰(zhàn)。其一，研究所得疫苗大多只能提供同源保護，只有極少數(shù)能提供小部分的異源保護。而ASF具有24種基因型，這使得對疫苗的交叉保護能力的要求有進一步提高。其二，由于ASFV的生物安全等級較高，需要在生物安全三級及以上實驗室才可開展病毒分離鑒定、活病毒培養(yǎng)、動物接種(感染)等實驗活動，目前我國批準開展ASFV相關實驗的實驗室有中國動物衛(wèi)生與流行病學中心、國家外來動物疫病診斷中心等8家單位，這在一定程度上限制了ASF疫苗多樣發(fā)展。其三，在研發(fā)過程中，實驗動物的使用也存在一定問題。小鼠模型常用于疫苗研制的前期工作，以證明疫苗的安全性和免疫原性，但這些結果很難復制到豬上。如p54/p30核酸疫苗在小鼠模型中具有較強免疫原性，但免疫豬后并不能產(chǎn)生免疫原性，表明了使用豬模型評估ASF疫苗顯得尤為重要。

4 總結與展望

ASF在許多國家和地區(qū)呈現(xiàn)地方性或流行性能通過各種傳播途徑擴散到無ASF的國家，這對全球養(yǎng)豬業(yè)構成了巨大威脅。目前ASF控制策略在很大程度上依賴于嚴格的生物安全措施和撲殺，但這些措施所起的作用是有限的，所以急需安全有效的疫苗來控制疾病，并從野豬和家豬中根除病毒。目前，盡管已經(jīng)嘗試了不同類型的疫苗，但是尚無市售的ASF有效疫苗。滅活疫苗不能提供保護，亞單位疫苗也通常是部分保護，而減毒活疫苗已顯示可以提供同源保護，是目前最有望投入生產(chǎn)的，但仍存在安全性問題。然而由于ASFV結構復雜，我們對其免疫機理和免疫逃逸機制認識的缺乏嚴重阻礙了疫苗的研發(fā)進展。因此，需要繼續(xù)努力揭示ASFV致病與免疫機理以及與宿主細胞相互作用的機制，為疫苗的研發(fā)帶來新的認識和途徑。