龔治忠, 李清月, 汪 沖, 徐曹玲, 劉 剛

(安徽醫(yī)科大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 合肥 230000)

鳥類是一些疾病的天然宿主和傳播媒介，由于具有極強(qiáng)的地理擴(kuò)散能力和廣泛的分布范圍，其攜帶的寄生蟲可以傳播給其他動(dòng)物和人類，從而引發(fā)一系列疾病[1-3]。作為人禽共患病的重要宿主及傳播媒介，候鳥和家禽在一些流行性疾病的發(fā)生和傳播中扮演著重要角色。鳥類的區(qū)域性活動(dòng)和季節(jié)性遷徙為寄生蟲疾病的傳播和擴(kuò)散帶來(lái)了潛在風(fēng)險(xiǎn)，鳥類遷徙時(shí)攜帶的寄生蟲通過身體接觸或空氣、水、食物等傳播媒介傳染給家禽，家禽再傳染給人類，從而引起疾病的發(fā)生和傳播，對(duì)鳥類甚至人類健康帶來(lái)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生威脅。研究表明，遷徙水鳥和家禽感染的球蟲(Coccidea)、線蟲(Nematode)、吸蟲(Trematode)和絳蟲(Cestode)等寄生蟲在腸道寄生蟲病的發(fā)生和傳播中起重要作用[4-7]。近年來(lái)，鳥類與家禽之間疾病傳播規(guī)律已經(jīng)引起人們的廣泛關(guān)注，成為鳥類學(xué)和流行病學(xué)研究的熱點(diǎn)問題[8-10]。

長(zhǎng)江中下游地區(qū)濕地蘊(yùn)含豐富的水生生物資源，是東亞-澳大利西亞(East Asian-Australasian)遷徙水鳥的重要遷徙停歇地和越冬地，也是我國(guó)人口密度較大的地區(qū)[10-11]。近年來(lái)由于過度開發(fā)，使越冬鳥類的棲息地不斷減少，致使家禽與遷徙鳥類共同覓食或活動(dòng)，進(jìn)而加大了鳥類和家禽之間寄生蟲傳播的風(fēng)險(xiǎn)[3]。小白額雁是長(zhǎng)距離遷徙的水鳥，是雁形目中重要的濕地指示物種，具有廣闊的活動(dòng)空間和復(fù)雜的生活習(xí)性，是長(zhǎng)江中下游地區(qū)越冬的常見鳥類，該物種在球蟲、線蟲、絳蟲等寄生蟲疾病的傳播和擴(kuò)散中扮演著重要角色。長(zhǎng)江中下游地區(qū)尤其是升金湖地區(qū)的人類農(nóng)業(yè)活動(dòng)使越冬小白額雁的棲息地不斷減少，使其攝食方式和行為發(fā)生改變，導(dǎo)致其放棄已經(jīng)退化的原始覓食棲息地，轉(zhuǎn)向稻田以獲取充足的食物[12]。前期研究發(fā)現(xiàn)，在小白額雁越冬濕地的周邊有大量的家禽養(yǎng)殖場(chǎng)，常出現(xiàn)飼養(yǎng)家禽和小白額雁在相同水域混群覓食的現(xiàn)象，這種混群行為增加了寄生蟲相互傳播的機(jī)會(huì)，造成寄生蟲疾病在家禽、候鳥之間周期性的暴發(fā)和循環(huán)感染。因此，越冬候鳥和家禽之間的寄生蟲流行病學(xué)研究值得進(jìn)一步關(guān)注。研究通過對(duì)升金湖越冬小白額雁和同域家鴨腸道寄生蟲的多樣性、感染強(qiáng)度和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，揭示越冬水鳥和同域家禽寄生蟲的傳播規(guī)律，為鳥類寄生蟲疾病甚至人禽共患寄生蟲疾病的預(yù)防提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 糞便樣本來(lái)源與采集

2017年11月至2018年4月從升金湖的楊峨頭村、西園村、聯(lián)合村和王壩村4個(gè)采樣點(diǎn)采集越冬小白額雁和家鴨糞便樣本各350份。越冬小白額雁的糞便樣本采集自升金湖灘涂及稻田，家鴨糞便樣本采集自灘涂及稻田放養(yǎng)的養(yǎng)殖場(chǎng)(表1)。釆集越冬小白額雁糞便樣本前用望遠(yuǎn)鏡觀察其覓食群體，選取種群數(shù)量在50只以上且四周沒有其他鳥類活動(dòng)的集群并觀察至少1 h，等候越冬小白額雁完成覓食并飛往下一個(gè)棲息地后，立即前往該區(qū)域采集新鮮糞便樣本，為避免個(gè)別樣本重復(fù)采樣，采樣距離至少為2 m。采集新鮮糞便樣本時(shí)佩戴一次性PE手套，每只手套采集一份樣本后便更換，將所有新鮮糞便樣本單獨(dú)收集于含10%福爾馬林的20 mL樣品收集管中，貼上標(biāo)簽后置于冰盒運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，放-20 ℃冰箱保存。

表1 越冬小白額雁和家鴨糞便樣本采集信息

1.2 方法

1.2.1 小白額雁糞便樣品鑒定

采用糞便樣本DNA提取試劑盒(Qiagen QIAamp R DNA Stool Mini Kit)從采集的越冬小白額雁糞便樣本中提取DNA，通過設(shè)計(jì)細(xì)胞色素氧化酶亞基1(COI)基因的引物(上游引物5′-TTC TCC AAC CAC AAA GAC ATT GGC AC-3′，下游引物5′-ACG TGG GAG ATA ATT CCA AAT CCT G-3′)對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序得到的序列通過GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果顯示所有糞便樣本均含有小白額雁的DNA，即采集的糞便樣本為小白額雁糞便樣本。

1.2.2 寄生蟲檢測(cè)方法

糞便樣本中的腸道寄生蟲采用飽和鹽水漂浮法和離心沉淀法進(jìn)行檢測(cè)。飽和鹽水漂浮法：取2 g新鮮糞便樣本置于燒杯中并用鑷子將其壓碎，加入適量飽和鹽水充分混勻，用糞篩過濾至錐形瓶中，繼續(xù)加入飽和鹽水至錐形瓶瓶口，蓋上載玻片，靜置5～10 min后取下載玻片進(jìn)行鏡檢觀察與記錄。離心沉淀法：取2 g新鮮糞便樣本于燒杯中并加入飽和鹽水混勻，用過濾篩過濾至離心管，將離心管放置于低速離心機(jī)中離心2～3 min，棄去離心管內(nèi)上清液，加入飽和鹽水混勻后再次離心，反復(fù)操作2～3次直至上清液澄清透明，棄去上清液后吸取適量沉淀至載玻片并進(jìn)行鏡檢觀察與記錄。

1.2.3 寄生蟲鑒定

采用顯微鏡鏡檢技術(shù)對(duì)糞便樣本中的腸道寄生蟲進(jìn)行鑒定。將含有糞便樣本的載玻片置于10倍鏡和20倍鏡下，對(duì)寄生蟲進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察并計(jì)數(shù)，而在低倍鏡下無(wú)法確定的寄生蟲種類，將其置于400或1 000倍鏡下進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)。通過測(cè)量和比較寄生蟲繁殖體(卵及其卵囊)的形狀、大小、卵殼厚度、特殊的部件以及內(nèi)部成分等，對(duì)寄生蟲種類進(jìn)行識(shí)別鑒定。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

統(tǒng)計(jì)并計(jì)算所有糞便樣本中檢測(cè)到的寄生蟲感染率，即感染寄生蟲的糞便樣本(陽(yáng)性樣本)數(shù)量占檢測(cè)的樣本總量的百分比。寄生蟲感染強(qiáng)度即每克糞便樣本中寄生蟲蟲卵及其卵囊的數(shù)量。寄生蟲多樣性通過寄生蟲豐富度、多樣性和均勻度進(jìn)行描述。寄生蟲豐富度即每個(gè)單獨(dú)糞便樣本中檢測(cè)到的寄生蟲種類的數(shù)量，寄生蟲的多樣性通過Shannon-Wiener指數(shù)進(jìn)行計(jì)算，寄生蟲均勻度通過Pielou指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。

感染率：P=陽(yáng)性樣本數(shù)/每個(gè)采樣點(diǎn)檢測(cè)的所有樣本數(shù)，%。

Pi=特定的寄生蟲繁殖體的數(shù)量/收集的樣本試驗(yàn)中所有寄生蟲繁殖體的數(shù)量，%。

采用卡方檢驗(yàn)和Fisher’s確切檢驗(yàn)確定差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。用R3.6.0比較越冬小白額雁和家鴨的寄生蟲豐富度、多樣性和均勻度。群落相似性指數(shù)C=2c/(a+b)，c是越冬小白額雁的數(shù)目，a是越冬小白額雁寄生蟲感染的數(shù)量，b是家鴨寄生蟲感染的數(shù)量。采用Microsoft Excel和IBM SPSS Statistics v 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

從升金湖越冬小白額雁糞便樣本中共鑒定出13種腸道寄生蟲，包括2種球蟲、6種吸蟲、3種線蟲和2種絳蟲；從家鴨糞便樣本中鑒定出11種腸道寄生蟲，包括1種球蟲、5種吸蟲、3種線蟲和2種絳蟲(表2，圖1)。在升金湖越冬小白額雁和家鴨中均發(fā)現(xiàn)6種腸道寄生蟲，包括鵝艾美爾球蟲(Eimerianseri)、接睪棘口吸蟲(Echinostomaparaulum)、卷棘口吸蟲(Echinostomarevolutum)、銳形裂口線蟲(Amidostomumacuta)、鴨雙睪絳蟲(Diorchisanatine)和膜殼絳蟲(Hymenolepissp.)，占全部寄生蟲的27.8%(表2)。通過對(duì)感染寄生蟲的糞便樣本進(jìn)行寄生蟲組分分析，發(fā)現(xiàn)吸蟲所占比例最多，在越冬小白額雁和家鴨中分別占46.2%和45.5%；其次為線蟲，分別占23.2%和27.3%；再次為絳蟲，分別占15.4%和18.2%；球蟲所占的比例最少(15.2%，9.0%)，具體見圖2。研究發(fā)現(xiàn)，在350份越冬小白額雁糞便樣本中共檢測(cè)出13種寄生蟲，感染率為67.4%，而在350份家鴨糞便樣本中檢測(cè)出11種寄生蟲，感染率為70.1%。不同寄生蟲間的感染率存在較大差別，感染率最高的寄生蟲是球蟲(小白額雁為57.5%，家鴨為50.1%)，其次是線蟲(16.5%，16.7%)和吸蟲(6.0%，6.7%)，而絳蟲(1.6%，1.2%)的感染率最低(表3)。

表2 越冬小白額雁和家鴨腸道寄生蟲的感染情況

(a)艾美爾球蟲(100倍鏡，標(biāo)尺=5 μm)；(b)卷棘口吸蟲(40倍鏡，標(biāo)尺=20 μm)；(c)并殖吸蟲(40倍鏡，標(biāo)尺=20 μm)；(d)棘口吸蟲(40倍鏡，標(biāo)尺=50 μm)；(e)毛圓線蟲(40倍鏡，標(biāo)尺=50 μm)；(f)毛細(xì)線蟲(10倍鏡，標(biāo)尺=50 μm)。圖1 從糞便樣本中分離出的腸道寄生蟲種類Figure 1 Some intestinal parasite species isolated from faeces

圖2 越冬小白額雁和家鴨糞便樣本中各種寄生蟲的比例Figure 2 Proportion of various parasite species in Anser erythropusand the poultry duck

表3 越冬小白額雁和家鴨腸道寄生蟲感染率

研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)陽(yáng)性樣本含有1種或2種寄生蟲，含有1種寄生蟲的樣本數(shù)量多于含有2種或2種以上的樣本數(shù)量，而含有3種或3種以上寄生蟲的樣本數(shù)量顯著減少，含有4種寄生蟲的樣本數(shù)量最少，未感染的樣本在小白額雁中占30.3%，在家鴨中占44.50%(圖3)。小白額雁和家鴨感染的腸道寄生蟲之間沒有檢測(cè)到顯著的物種豐富度差異(F=0.67，P=0.656)、多樣性差異(F=0.76，P=0.598)和均勻度差異(F=0.73，P=0.612)，而升金湖越冬小白額雁種群與家鴨種群的寄生蟲群落卻具有較高的相似性，相似系數(shù)為0.43。

圖3 升金湖越冬小白額雁和家鴨糞便樣本中寄生蟲的物種豐富度及其比例Figure 3 Proportion of various species richness detected inAnser erythropus and the poultry duck

3 討論和結(jié)論

升金湖越冬小白額雁(67.4%)和家鴨(70.1%)的寄生蟲感染水平與灰鶴(78.9%)、白頭鶴(57.7%)等其他在長(zhǎng)江中下游濕地越冬水鳥的寄生蟲感染水平相似[4,13]。在所有檢測(cè)樣本中，感染率最高的是球蟲，其次是線蟲、吸蟲和絳蟲，與升金湖越冬白頭鶴腸道寄生蟲的感染種類類似[1]。通過對(duì)長(zhǎng)江中下游多種越冬水鳥腸道寄生蟲研究[1]表明，感染率最高的是艾美爾球蟲，這與本研究類似，艾美爾球蟲能夠?qū)τ坐B造成嚴(yán)重傷害或者致死，過高的種群密度會(huì)增加球蟲感染的風(fēng)險(xiǎn)。線蟲也是越冬小白額雁和家鴨腸道寄生蟲群落中相當(dāng)重要的組成部分，本研究發(fā)現(xiàn)的線蟲感染如毛圓線蟲屬和毛細(xì)線蟲屬在以往有關(guān)長(zhǎng)江中下游越冬白頭鶴腸道寄生蟲的文獻(xiàn)中均有報(bào)道[1]。吸蟲和絳蟲在很多野鳥和家禽中會(huì)造成宿主貧血、衰弱等癥狀，在本研究中，吸蟲的種類最多，兩者也是威脅越冬小白額雁和家鴨的重要腸道寄生蟲。

通過對(duì)升金湖越冬小白額雁和家鴨的腸道寄生蟲的群落結(jié)構(gòu)分析表明，升金湖越冬小白額雁和家鴨的寄生蟲群落相似系數(shù)為0.43，而差異性不顯著，該相似性可能是由于兩者間的寄生蟲交叉感染導(dǎo)致的。宿主和寄生蟲的密度以及它們的空間分布是影響寄生蟲傳播的重要因素，當(dāng)宿主密度在一定閾值內(nèi)時(shí), 密度越大，寄生蟲與宿主接觸的機(jī)會(huì)越多，寄生蟲感染的概率越大[14]。升金湖越冬小白額雁往往以大規(guī)模集群形式進(jìn)行越冬，而家鴨更是集成化養(yǎng)殖，這種高密度的聚集增加了宿主之間相互接觸的概率。近年來(lái)，隨著人為干擾和棲息地的破壞，越冬小白額雁和家鴨經(jīng)常在升金湖的湖岸灘涂共同覓食，形成的高密度混群大大增加了腸道寄生蟲發(fā)生與傳播的風(fēng)險(xiǎn)[15-16]。此外，腸道寄生蟲與宿主的棲息地環(huán)境及食性密切相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，寄生蟲的暴發(fā)通常發(fā)生在感染性卵囊積累的環(huán)境中感染性卵囊越多，寄生蟲暴發(fā)的可能性越大[12]。已有研究表明，升金湖越冬小白額雁主要棲息于升金湖地區(qū)的水田和灘涂草地，而養(yǎng)殖的家鴨白天也在此活動(dòng)覓食，并都以苔草、禾本科植物、雙子葉植物作為主要的食物來(lái)源[17]。由于覓食地重疊、食性相似、混合種群密度高和生態(tài)位重疊等因素導(dǎo)致越冬小白額雁與家鴨寄生蟲群落結(jié)構(gòu)相似，而且，越冬小白額雁與家鴨間的寄生蟲交叉?zhèn)鞑ピ黾恿巳祟惛腥炯纳x病的風(fēng)險(xiǎn)，并造成潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)[18]。

綜上，升金湖越冬小白額雁和家鴨種群寄生蟲群落結(jié)構(gòu)相似，寄生蟲感染率較高，表明升金湖水鳥越冬期寄生蟲更加容易發(fā)生與傳播，并且可能導(dǎo)致人類疾病，甚至引發(fā)潛在的公共衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。研究對(duì)預(yù)防越冬水鳥和家禽的寄生蟲交叉?zhèn)鞑ゾ哂兄匾囊饬x，有利于進(jìn)一步揭示寄生蟲在越冬水鳥和家禽之間發(fā)生與傳播的規(guī)律，從而為預(yù)防寄生蟲病奠定基礎(chǔ)。