周向平，許清孝，劉 峰，周 立，張洪波，樊 建，袁志輝

（1. 湖南省煙草公司永州市公司，湖南 永州 425100；2. 湖南科技學院，湖南 永州 425199；3. 湖南省銀杏工程技術研究中心，湖南 永州 425199）

煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）是煙草花葉病毒屬的代表種，也是研究最為廣泛的病毒之一。TMV的寄主非常多，可浸染包括30個科的310多種植物[1]。TMV的基因組為單股正鏈RNA，全長6 395堿基對，共編碼4個開放閱讀框（ORF），其中外殼蛋白（coat-protein，CP）編碼基因在TMV病毒分類中是一個主要的相關基因[2]。TMV在不同植物寄主上有許多不同的株系，我國主要有TMV-U1、TMV-U2、蘭花株系、番茄株系、葫蘆科株系、車前草株系和豆類株系；煙草上的株系主要有TMVN、TMV-OM、TMVRS、TMV-U1、TMVC、TMV-Vulgare、TMVY[3]。TMV是煙草的主要病原物之一，感染后煙葉產(chǎn)量下降、品質(zhì)變劣，常造成巨大的經(jīng)濟損失[4-6]，且目前還缺乏有效的防控措施[7]。近年來，隨著煙草漂浮育苗技術的普遍應用，由TMV引起的花葉病在煙草上發(fā)生嚴重[8]，對煙葉品質(zhì)及產(chǎn)量均造成較大影響。同時，永州不同縣區(qū)氣候的差異性及其獨特的地理地質(zhì)特點也導致了煙草花葉病毒的變異頻繁，出現(xiàn)了多種癥狀類型。為了查明永州主要煙區(qū)TMV株系的歸屬，筆者以采自永州不同煙區(qū)的病樣為材料，通過對TMVCP基因的克隆及序列分析，并與國內(nèi)外報道的主要株系（或分離物）的同一基因進行比較，研究其病毒株系的歸屬，以期為TMV的防控及快速檢測方法的研究提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試樣品供試樣品分別于2020年4月27—29日采集自永州市江永縣、新田縣、寧遠縣、江華縣、藍山縣、道縣等不同煙草種植區(qū)，采樣植株表現(xiàn)出花葉、葉片皺縮、植株矮化等癥狀。

1.1.2 引物與試劑根據(jù)已報道的序列（福建分離物，登錄號：AF165190；山西分離物，登錄號：JF 920727），設計并合成擴增TMVCP基因部分序列引物（見表1）。植物總RNA 提取試劑盒Transzol購自北京全式金公司，反轉錄試劑盒和pGEM-T Easy載體購自Promega公司，DNA聚合酶購自TaKaRa，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

表1 TMV CP基因序列擴增引物

1.2 方 法

1.2.1 TMV RNA提取利用Transzol試劑盒提取植物總RNA。提取到的總RNA通過甲醛變性瓊脂糖電泳，確定抽提RNA的完整性和DNA污染情況。

1.2.2 RT-PCR反轉錄TMV RNA參照王莉爽等[9]采用RT-PCR兩步法對TMV的CP基因序列進行擴增。

1.2.3 產(chǎn)物克隆及測序RT-PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒連接到pGEM-T Easy載體，轉化到大腸桿菌DH5α，涂布于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基上，篩選陽性克隆。所篩選的陽性克隆送上海華大基因有限公司進行測序。

1.2.4 序列分析利用DNAStar軟件進行序列拼接和分析；以獲得CP基因序列為基礎，用Mega 7.0程序的鄰近連接法（Neighbor-Joining，NJ）構建TMV病毒CP基因組序列的系統(tǒng)進化樹，其各分支的可信度用Bootstrap檢測（1 000次重復）[10]。從NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇15個代表性TMVCP基因序列用于CP基因比較和分析，這15個代表性序列的TMV病毒及其序列登錄號為：Fujian（AF395129.1），Africa（AY360447.1），Jimo（HE818443.1），Chongqing（EF183504.1），F(xiàn)ujian-U1（AF165190.1），Henan（GU324660.1），Japan（D63809.1），Korea（X68110.1），Kunming（AF516912.1），Shandong（DQ014551.1），Shanxi（JF920727.1），South Korea（DQ981481.1），USA（NC_001367.1），Vietnam（AM412008.1），Zhejiang（GQ280795.1）。

2 結果與分析

2.1 CP基因擴增結果

經(jīng)電泳和測序驗證，設計的4對引物中，03號引物能獲得較好的TMVCP基因擴增結果。故后續(xù)的所有樣品擴增均采用該引物。

從江永縣、新田縣、寧遠縣、江華縣、藍山縣、道縣6個縣區(qū)23個鄉(xiāng)鎮(zhèn)采集的煙草普通花葉病樣品91個，經(jīng)總RNA提取和RT-PCR擴增后進行電泳。結果顯示，有83個樣品的擴增結果為陽性，陽性率為91.21%（見圖1）。擴增陰性的樣品主要來自道縣和藍山縣，這2個縣的普通花葉病發(fā)病情況普遍較輕，采集樣品難度較大。道縣樣品的陽性率為80.00%，藍山縣樣品的陽性率為78.57%，均低于綜合陽性率，這從側面反應了這2個縣的普通花葉病發(fā)病與其他病害相混雜的情況較其他縣多。另外，由于所采集的樣品中混雜有相似癥狀但不是TMV感染所造成的情況，因此樣品的陽性率低屬正?，F(xiàn)象。

圖1 煙草普通花葉病樣品TMV擴增電泳結果

2.2 測序結果及分析

擴增產(chǎn)物經(jīng)DNA回收試劑盒連接到pGEM-T Easy載體，轉化到大腸桿菌DH5α，挑選篩選陽性克隆。對所篩選的陽性克隆每個樣品隨機選取2個送上海華大基因有限公司測序。所得序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)，所有序列均為TMVCP基因。從NCBI數(shù)據(jù)庫中選擇代表性TMVCP基因序列，與所有陽性樣品序列一起構建系統(tǒng)發(fā)育樹（見圖2）。該系統(tǒng)發(fā)育樹中，所有獲得的TMVCP基因與挑選的15個代表性序列一起分成了2個大枝。其中1大枝僅含有43個CP基因序列，未與NCBI數(shù)據(jù)庫的15個代表性序列中的任何1個聚在一起，且永州煙區(qū)6縣均有樣品分布在其中。這43個樣品的BLAST比對結果，序列相似性較低，僅95.6%～97.3%，且變異樣品中有65.3%是采自發(fā)病率10%以上的煙田。系統(tǒng)發(fā)育樹中另1大枝則由其他40個CP基因序列和15個代表性序列聚在一起，永州煙區(qū)6縣均有樣品分布在該大枝中。這40個樣品序列除日本分離物和我國山東分離物外，美國分離物、越南分離物、非洲分離物、韓國分離物以及我國的山西分離物、河南分離物、重慶分離物、福建分離物和浙江分離物均可以在永州煙區(qū)6個縣的樣品中找到親緣種。

永州煙區(qū)各縣的TMV株系雖然混雜，但各縣也存在一些主要的分離物親緣種，如表2所示，TMV親緣種寧遠縣以山西和福建分離物為主，還包括云南、韓國、日本和河南分離物；新田縣以山東分離物為主，還包括重慶、韓國、浙江、云南、福建分離物；藍山縣以山西分離物為主，另有2個樣品與重慶分離物親緣關系最近；道縣以福建和山東分離物為主，另有2個樣品分別與重慶和美國分離物親緣關系最近；江華縣以山西和福建分離物為主，還包括重慶、非洲和越南分離物；江永縣以福建分離物為主，只有1個樣品與山西分離物的親緣關系最近（表2）。由此可見，永州煙區(qū)的TMV主要親緣種包括山西、福建、山東分離物，其中尤以福建分離物所占比例最大，達到33.3%，其次是山西分離物，所占比例為28.6%。

3 結論與討論

永州煙區(qū)獲得的TMVCP基因序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹后分成2大枝。其中1大枝含有43個CP基因序列，且未與代表性序列中的任何1個聚在一起，永州煙區(qū)6縣均有樣品分布在該大枝中，說明永州煙區(qū)發(fā)病樣品中的TMV與現(xiàn)有代表性序列存在一定差異，即均發(fā)生了不同程度的變異。43個樣品的BLAST比對結果僅95.6%～97.3%的低序列相似性也可以說明部分區(qū)域的TMV已經(jīng)發(fā)生了變異。變異樣品中有65.3%是采自發(fā)病率10%以上的煙田，如道縣梅花鎮(zhèn)和四馬橋鎮(zhèn)、江華縣大石橋鄉(xiāng)和白芒營鎮(zhèn)。因此，在永州煙區(qū)的普通煙草花葉病毒的防控中，要特別注意高致病力或高傳播力變異株的出現(xiàn)。另1大枝含有40個CP基因序列且與代表性序列聚在一起，這40個樣品序列，也同樣包含永州煙區(qū)所有6個縣的樣品，也就是說，數(shù)據(jù)庫中存在的國內(nèi)外代表性株系均可以在永州煙區(qū)的樣品中找到親緣種，說明永州煙區(qū)普通花葉病毒的株系來源混雜。由于永州煙區(qū)普通花葉病毒的株系混雜，相互之間的多重雜交重組可以使得病毒進化進程加快，從而更容易產(chǎn)生危害程度高的高致病力或高傳播力的株系，因為重組是病毒進化的重要途徑之一，可改變病毒致病力[11]，擴大其寄主范圍[12-13]。因此，在永州煙區(qū)普通花葉病的防控中，應特別注意農(nóng)事操作的規(guī)范性，在轉場不同鄉(xiāng)鎮(zhèn)、不同村組，甚至是不同地塊進行農(nóng)事操作時，應做好清潔消毒工作，避免病毒的傳播，特別是避免造成病毒株系進化的加快。