馮嘉潤，詹 盛，許煥麗

（首都醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100069）

鐵死亡是一種鐵依賴性的細(xì)胞中脂質(zhì)活性氧異常累積造成的細(xì)胞程序性死亡。鐵死亡有別于凋亡、自噬及壞死等經(jīng)典的細(xì)胞死亡方式，其無法被凋亡抑制劑所抑制，卻能被鐵螯合劑或攝入的鐵抑制劑所阻斷。鐵死亡參與了多種腫瘤的發(fā)生及耐藥性產(chǎn)生。大量研究證明，通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡可有效抑制腫瘤生長，為新的抗腫瘤藥物的開發(fā)及克服腫瘤耐藥帶來希望[1]。

許多化療藥物均可通過多種途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡來殺死腫瘤細(xì)胞，然而，由于腫瘤細(xì)胞對凋亡獲得性的、內(nèi)在的抵抗，僅通過誘導(dǎo)凋亡抗腫瘤的效果有限。因此，通過誘導(dǎo)其他形式的非凋亡性的細(xì)胞死亡方式來殺傷腫瘤細(xì)胞、抵抗腫瘤耐藥有望成為腫瘤治療的新的有效手段。天然產(chǎn)物是發(fā)現(xiàn)抗腫瘤藥物先導(dǎo)化合物的重要資源。近年研究表明，許多天然藥物可通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞鐵死亡發(fā)揮抗腫瘤作用。因此，本文重點(diǎn)對鐵死亡通路上的相關(guān)靶點(diǎn)及天然產(chǎn)物對其干預(yù)的機(jī)制進(jìn)行綜述，為其進(jìn)一步研究、開發(fā)和臨床應(yīng)用提供理論參考。

1 鐵死亡信號通路與腫瘤的治療

鐵死亡是由于細(xì)胞抗氧化能力降低，二價(jià)鐵離子以類似芬頓反應(yīng)的方式氧化脂質(zhì)產(chǎn)生大量活性氧簇，達(dá)到一定程度所引起的細(xì)胞氧化性死亡。細(xì)胞抗氧化能力降低主要是由于谷胱甘肽過氧化物酶4（glutathione peroxidase 4，GPX4）失活導(dǎo)致的。在還原型谷胱甘肽（GSH）存在的情況下，GPX4將過氧化氫和有毒的脂質(zhì)過氧化物分解成水或相應(yīng)的無毒脂質(zhì)醇。位于細(xì)胞膜上的胱氨酸-谷氨酸反向轉(zhuǎn)運(yùn)體（System Xc-）可以1:1的比例轉(zhuǎn)出谷氨酸，同時(shí)轉(zhuǎn)入胱氨酸，在氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)中起十分重要的作用。胱氨酸在攝入后迅速被還原為半胱氨酸，然后參與GSH的合成，維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài)[2]。因此，GPX4活性是調(diào)控鐵死亡的樞紐與核心。

二價(jià)鐵離子的存在也是鐵死亡的必要條件。膜蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白受體1（transferrin receptor 1，TFR1）可轉(zhuǎn)運(yùn)Fe3+進(jìn)入細(xì)胞，在二價(jià)金屬轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（divalent metal transporter 1，DMT1）作用下轉(zhuǎn)為Fe2+。鐵反應(yīng)元件結(jié)合蛋白2（iron responsive element binding protein 2，IREB2）、核因子紅細(xì)胞2相關(guān)因子2（nuclear factor-E2 related factor 2，Nrf2）可調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Fe2+[2]。鐵死亡受到細(xì)胞中多種代謝的嚴(yán)密調(diào)控，如氨基酸代謝、脂質(zhì)代謝、鐵代謝等。針對以上途徑進(jìn)行調(diào)控可誘導(dǎo)或抑制鐵死亡的發(fā)生。

近年越來越多的研究表明，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡與抑制腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及耐藥密切相關(guān)[3-4]，誘導(dǎo)鐵死亡從而有效地靶向癌細(xì)胞已成為當(dāng)今藥物開發(fā)的熱點(diǎn)。

2 靶向System Xc- 的天然產(chǎn)物

System Xc-由兩個(gè)亞基組成，包括輕鏈亞基SLC7A11和重鏈亞基SLC3A2[5]。SLC7A11負(fù)責(zé)System Xc-的主要活性，而SLC3A2主要發(fā)揮輔助協(xié)調(diào)作用，目前關(guān)于鐵死亡的研究主要集中于對SLC7A11的調(diào)控方面。研究表明[6-7]，許多惡性腫瘤如肝細(xì)胞癌、非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞膜上的SLC7A11的表達(dá)量明顯上調(diào)，以維持高水平的GSH含量，應(yīng)對氧化還原應(yīng)激狀態(tài)。GSH是GPX4激活的必要輔因子，因此通過抑制System Xc-間接抑制GPX4的活性已被證明是有效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞鐵死亡的方法[8-9]。

丹參酮IIA是從中藥丹參中提取的具有抗腫瘤活性的脂溶性菲醌化合物[10]。Guan等[11]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮IIA可誘導(dǎo)BGC-823和NCI-H87胃癌細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)上調(diào)，而p53蛋白可結(jié)合SLC7A11的啟動子區(qū)，抑制其轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而誘發(fā)鐵死亡，抑制胃癌細(xì)胞的增殖。

3 靶向GPX4的天然產(chǎn)物

GPX4可去除細(xì)胞中的脂質(zhì)活性氧（reactive oxygen species，ROS），是鐵死亡中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。典型的鐵死亡誘導(dǎo)劑ras選擇性致死化合物（ras selective lethal compound 3，RSL3）就是通過共價(jià)結(jié)合GPX4中硒代半胱氨酸的活性位點(diǎn)，抑制GPX4的活性，造成細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過氧化物積累和鐵死亡[12]。靶向GPX4誘導(dǎo)鐵死亡已成為抗腫瘤藥物開發(fā)的重要策略。

沒食子酸（gallic acid，GA）是從植物中分離得到的天然酚類化合物，可有效治療胃癌、宮頸癌、乳腺癌和黑色素瘤等癌癥[13]。Khorsandi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，低水平激光聯(lián)合GA可通過細(xì)胞凋亡和鐵死亡機(jī)制誘導(dǎo)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞死亡。單獨(dú)GA處理的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性無顯著降低，而GA聯(lián)合低水平激光處理的MDAMB-231細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，GPX4及細(xì)胞增殖活性降低。

異硫氧酸鹽是來源于十字花科植物中的一類具有抗腫瘤活性的有機(jī)化合物，其中苯乙基異硫氧酸鹽（phenethyl isothiocyanate，PEITC）是一種ROS誘導(dǎo)劑[15-16]，有望發(fā)展為抗腫瘤治療藥物。大多數(shù)研究報(bào)道PEITC能誘導(dǎo)多種腫瘤凋亡[17-18]，而Lv等指出PEITC在人骨肉瘤細(xì)胞中可誘導(dǎo)多種方式的細(xì)胞死亡，包括鐵死亡[19]。PEITC降低了GSH/氧化型谷胱甘肽（oxidized glutathione，GSSG）比值，同時(shí)抑制GPX4的表達(dá)，導(dǎo)致ROS的積累，細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。該研究還檢測到TFR1的高表達(dá)，鐵蛋白重鏈（ferritin heavy chain 1，F(xiàn)TH1）和膜鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ferroportin，F(xiàn)PN）的表達(dá)下降，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鐵含量升高，誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生[19]。

澳洲茄堿是一種提取自龍葵的生物堿，具有多重藥理作用，如促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、促進(jìn)氧化活性、抑制真菌感染等[20]，亦有抑制腫瘤細(xì)胞生長的作用[21-22]。Jin等[23]研究發(fā)現(xiàn)，澳洲茄堿可誘導(dǎo)谷胱甘肽氧化還原系統(tǒng)破壞，促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞的鐵死亡作用。澳洲茄堿通過抑制谷胱甘肽合成酶（glutathione synthetase，GSS），間接抑制了GPX4的活性，提高了HepG2細(xì)胞脂質(zhì)ROS水平，參與了肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞的鐵死亡過程。

另外，丹參活性成分隱丹參酮能劑量依賴性抑制肺癌A549細(xì)胞的增殖，其機(jī)制與增加熱休克蛋白B1（heat shock protein B 1，HSPB1）和GPX4的mRNA表達(dá)水平，進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡有關(guān)[24]。

4 靶向GSH的合成或消耗的天然產(chǎn)物

GSH在維持和調(diào)控細(xì)胞內(nèi)氧化還原環(huán)境中發(fā)揮著重要作用。除了System Xc-和GPX4可影響GSH合成外，谷胱甘肽的合成與消耗還受其他因素，如谷氨酰胺分解抑制、半胱氨酸利用率降低和胞外高濃度的谷氨酸等的影響[2]。一些天然產(chǎn)物可作用于GSH的合成或消耗從而誘導(dǎo)鐵死亡。

青蒿素是從中藥青蒿（Artemisia annuaL.）中提取的一種天然化合物，青蒿素及其衍生物包括青蒿琥酯、雙氫青蒿素、蒿甲醚和蒿醚，已被用于多藥耐藥瘧疾的治療[25]。近年，青蒿素及其衍生物作為鐵死亡誘導(dǎo)劑的相關(guān)研究日益增加，它們主要通過消耗GSH、增加ROS水平，并影響鐵的代謝等多個(gè)方面來調(diào)控鐵死亡的發(fā)生。

青蒿琥酯是一種水溶性的青蒿素衍生物，除抗瘧作用外，還具有抗癌活性[26]。Eling等[27]檢測到青蒿琥酯作用下胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）細(xì)胞ROS水平上升，并證實(shí)青蒿琥酯可誘導(dǎo)PDAC細(xì)胞發(fā)生鐵死亡。Greenshields等[28]發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對卵巢癌細(xì)胞的細(xì)胞毒性效果是依賴于ROS的，且外源性鐵的使用可提高青蒿琥酯治療卵巢癌的有效性，青蒿琥酯可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞鐵死亡。

雙氫青蒿素是一種青蒿素活性產(chǎn)物，除了具有傳統(tǒng)的抗瘧疾作用外，還對多種癌癥顯示出良好的抗腫瘤效果[29-30]。李艷純等[31]檢測到雙氫青蒿素處理后肝癌細(xì)胞內(nèi)ROS水平上升，同時(shí)伴隨細(xì)胞內(nèi)GSH水平下降及GPX4蛋白表達(dá)的下調(diào)。因此雙氫青蒿素對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用機(jī)制可能不僅局限于之前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡，鐵死亡可能在其中也發(fā)揮了作用。亦有研究發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可降低DNA引物酶M2（DNA primase M2，PRIM2）的表達(dá)。PRIM2是DNA引物酶的亞基，參與調(diào)控DNA復(fù)制。PRIM2的缺失可導(dǎo)致SLC7A11表達(dá)的下調(diào)，誘發(fā)鐵死亡，抑制肺癌細(xì)胞的增殖[32]。Lin等發(fā)現(xiàn)雙氫青蒿素可誘導(dǎo)頭頸部癌（HNC）細(xì)胞鐵死亡和凋亡[33]。因此，通過雙氫青蒿素誘導(dǎo)鐵死亡可能成為多種癌癥治療的一種新方法。

5 靶向脂質(zhì)ROS堆積的天然產(chǎn)物

脂質(zhì)過氧化代謝紊亂導(dǎo)致的ROS堆積為鐵死亡的另一個(gè)重要影響因素。細(xì)胞膜中脂質(zhì)中的多不飽和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）經(jīng)一系列反應(yīng)產(chǎn)生的過氧化物是ROS的來源，積累的ROS可進(jìn)一步參與生物膜的氧化過程。這些自由基可從鄰近的PUFA中轉(zhuǎn)移質(zhì)子，引發(fā)新一輪的脂質(zhì)氧化，使氧化損傷擴(kuò)散，進(jìn)而加速ROS的產(chǎn)生。過多的ROS積累會導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生[3]。脂質(zhì)的過氧化過程通過增加脂質(zhì)毒性在誘導(dǎo)鐵死亡中發(fā)揮重要作用，所以通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝增加ROS的水平也為誘導(dǎo)細(xì)胞鐵死亡提供了思路。

蓽茇是胡椒科胡椒屬植物蓽茇的干燥未成熟或成熟果穗，有效成分包括酰胺類、萜類、甾醇類、揮發(fā)油類等，其中蓽茇酰胺為主要特征性成分。最新的研究表明蓽茇酰胺有抗腫瘤、降脂、抗菌和抗氧化等方面的功效[34]。蓽茇酰胺直接結(jié)合并抑制細(xì)胞中的抗氧化酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶P1（glutathione S-transferase P1，GSTP1），導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞內(nèi)ROS水平升高，但對正常細(xì)胞沒有毒性[35]。Yamaguchi等[36]研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺可誘發(fā)胰腺癌細(xì)胞內(nèi)GSH水平下降，ROS水平升高，進(jìn)而發(fā)生鐵死亡。同時(shí)研究提示子葉列寧a（cotylenin A，CNA）、柳氮磺胺吡啶（sulfasalazine，SSZ）與蓽茇酰胺聯(lián)合使用可增加細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生，3種藥物聯(lián)合治療胰腺癌療效顯著。亦有研究發(fā)現(xiàn)，蓽茇酰胺對胃癌細(xì)胞增殖有抑制作用，其機(jī)制與蓽茇酰胺可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞中ROS的形成有關(guān)。蓽茇酰胺下調(diào)鐵死亡關(guān)鍵蛋白GPX4、System Xc-的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生[37]。因此，蓽茇酰胺是一種很有潛力應(yīng)用于癌癥治療的藥物。

6 靶向Nrf2的天然產(chǎn)物

Nrf2是調(diào)控細(xì)胞氧化應(yīng)激的核心轉(zhuǎn)錄因子，具有強(qiáng)大的抗氧化/抗凋亡作用，是腫瘤細(xì)胞耐藥的重要機(jī)制。在氧化應(yīng)激時(shí)，Nrf2會與Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1（Kelchlike ECH associated protein 1，KEAP1）解離，轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，與受其調(diào)控的抗氧化酶基因的抗氧化反應(yīng)元件結(jié)合，Nrf2的靶基因表達(dá)產(chǎn)物包括血紅素加氧酶1（hemeoxygenase-1，HMOX1），SLC7A11和GPX4 等。

葫蘆巴堿是一種大量存在于咖啡和葫蘆巴種子的生物堿，具有多重藥理作用[38]。研究表明，葫蘆巴堿在體外和體內(nèi)都可逆轉(zhuǎn)RSL3誘導(dǎo)的頭頸癌細(xì)胞（HNC）對鐵死亡的抗性[39]。其機(jī)制與抑制Nrf2的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。葫蘆巴堿可通過抑制Nrf2下調(diào)HMOX1和FTH1基因水平，從而改變鐵代謝和脂質(zhì)過氧化作用，獲得鐵死亡抗性。另一方面，葫蘆巴堿還阻斷了金屬硫蛋白 1G（metallothionein-1G，MT-1G）的表達(dá)，使GSH含量降低，進(jìn)而誘導(dǎo)鐵死亡。此外，葫蘆巴堿還可通過克服鐵死亡抗性，增強(qiáng)胰腺癌對依托泊苷的敏感性[40]及肝癌對索拉菲尼的敏感性[41]。

然而，在另一項(xiàng)研究中Nrf2及HMOX1的上調(diào)被證明抑制了鐵死亡的發(fā)生。醉茄素A是從南非醉茄中分離的甾體內(nèi)脂，具有抗炎、抗腫瘤等功效。其在中劑量下可靶向作用于KEAP1，激活Nrf2，上調(diào)HMOX1的表達(dá)，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的鐵死亡。這一現(xiàn)象可由HMOX1水平對細(xì)胞毒性的兩面性解釋：中等水平的HMOX1對細(xì)胞具有保護(hù)作用；而HMOX1的過表達(dá)可導(dǎo)致細(xì)胞中不穩(wěn)定Fe2+增加，誘導(dǎo)鐵死亡。因此，使HMOX1過量表達(dá)或抑制HMOX1的表達(dá)均可誘導(dǎo)鐵死亡的發(fā)生。此外，醉茄素A在高劑量下，可直接使GPX4失活，從而使細(xì)胞對鐵死亡敏感[42-43]。

7 靶向鐵離子積累

鐵死亡中鐵的存在是必要的。細(xì)胞內(nèi)鐵離子濃度的上升可促進(jìn)鐵死亡的發(fā)生[44]，而使用鐵螯合劑如去鐵胺則可抑制細(xì)胞的鐵死亡[45]。然而，鐵在鐵死亡中發(fā)揮的具體作用仍存在爭議。一種可能的解釋為鐵可向氧化物提供電子，促進(jìn)ROS的形成，而鐵螯合劑阻斷鐵死亡的機(jī)制是它們阻止了鐵提供電子[46]。

魯斯可皂苷元是一種從生長在地中海地區(qū)的假葉樹（Ruscus aculeatusL.）中分離得到的一種甾體皂苷元，也是常用中藥麥冬中的主要皂苷元[47]。魯斯可皂苷元具有多種藥理活性，用于治療多種炎癥、心血管疾病及癌癥[47-48]。Song等研究了魯斯可皂苷元在胰腺癌中的作用，發(fā)現(xiàn)魯斯可皂苷元能顯著抑制胰腺癌細(xì)胞的存活。魯斯可皂苷元通過上調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，TF）表達(dá)和下調(diào)FPN表達(dá)增加了細(xì)胞內(nèi)鐵離子的濃度，同時(shí)增加了ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞的鐵死亡[49]。

β-欖香烯是從姜黃中分離出的一種生物活性化合物，具有抗癌作用，可用于多種癌癥治療[50]。Chen等[51]首次證實(shí)了KRAS突變型結(jié)直腸癌細(xì)胞對β-欖香烯和西妥昔單抗聯(lián)合治療敏感，二者聯(lián)合誘導(dǎo)KRAS突變結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116鐵死亡。β-欖香烯聯(lián)合西妥昔單抗處理后，HMOX1和TF的表達(dá)明顯升高，而使用去鐵胺幾乎可完全逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的死亡。HMOX1是細(xì)胞內(nèi)鐵離子的重要來源，該研究證明β-欖香烯通過調(diào)節(jié)胞內(nèi)鐵的濃度促進(jìn)了鐵死亡的發(fā)生。同時(shí)，鐵死亡負(fù)調(diào)控蛋白，包括SLC7A11、GPX4、FTH1、谷氨酰胺酶和SLC40A1的表達(dá)顯著降低。該研究表明，β-欖香烯和西妥昔單抗可聯(lián)合誘導(dǎo)鐵死亡，有望為KRAS突變的結(jié)直腸癌患者提供一種治療策略。

圖1 天然藥物調(diào)控腫瘤細(xì)胞鐵死亡機(jī)制

8 總結(jié)與展望

鐵死亡是一種區(qū)別于凋亡的新型細(xì)胞死亡方式。已有多個(gè)證據(jù)表明鐵死亡在腫瘤細(xì)胞的生長調(diào)控和耐藥等方面發(fā)揮著重要作用，可作為新的抗腫瘤靶標(biāo)。鐵死亡調(diào)控主要通過3種代謝途徑實(shí)現(xiàn)：氨基酸代謝，包括胱氨酸轉(zhuǎn)入，GSH合成，最終影響GPX4的活性；脂質(zhì)代謝，包括從PUFA到脂質(zhì)ROS的氧化途徑；鐵代謝，如FPN，TFR1，HMOX1等調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)二價(jià)鐵離子濃度。本文所涉及的天然藥物主要從上述方面調(diào)控了鐵死亡。在應(yīng)用方面，誘導(dǎo)鐵死亡能提高化療藥物的療效，如文中所述葫蘆巴堿聯(lián)合依托泊苷治療胰腺癌等。另外，利用鐵死亡對抗一些癌癥細(xì)胞產(chǎn)生的化療耐藥性也是研究關(guān)注的一個(gè)焦點(diǎn)[4]。

越來越多的研究表明，具有抗腫瘤作用的天然產(chǎn)物除了參與細(xì)胞凋亡、壞死、自噬等細(xì)胞死亡方式外，還可誘導(dǎo)鐵死亡。這些藥物通過不同的細(xì)胞死亡機(jī)制發(fā)揮抗腫瘤作用，但是它們所誘導(dǎo)的凋亡、壞死、自噬和鐵死亡之間的具體聯(lián)系還有待探究。研究藥物調(diào)控不同細(xì)胞死亡方式之間的關(guān)系可能對聯(lián)合用藥及更好地發(fā)揮藥物作用有所幫助。目前，鐵死亡中很多具體機(jī)制是不明確的，進(jìn)一步研究鐵死亡的具體機(jī)制會更有助于誘導(dǎo)鐵死亡新藥的研發(fā)。

天然來源的化合物是抗腫瘤藥物的重要來源。我國中藥資源豐富，其中含多種調(diào)節(jié)鐵死亡的活性成分，且與經(jīng)典鐵死亡誘導(dǎo)劑或抑制劑相比，具有價(jià)廉、來源廣、療效可靠等優(yōu)勢，進(jìn)一步發(fā)掘可誘導(dǎo)鐵死亡的天然藥物具有重要意義。