何冰，潘浩漢，吳建陽，羅威，武愛龍,卜浩，楊麗冬

(湛江幼兒師范?？茖W(xué)校，廣東 湛江 524037)

0 引言

相思類樹種為含羞草科(Mi-mosaceae)金合歡屬(Acacia)植物 ，由于它們具有極大的生態(tài)和經(jīng)濟效益而廣泛受到人們的喜愛[1]，但來自于我國的相思樹種卻極少，所以目前我國栽培的相思樹種大部分要從澳大利亞引進。相思樹能與土壤中的根瘤菌共生固氮而能在氮元素貧瘠、酸性、甚至退化的土壤條件下生存，在我國南方短周期工業(yè)原料林發(fā)展、水土保持和豐富林木種質(zhì)資源等方面具有重要作用和地位[2]。銀葉金合歡(Acaciapodalyriifolia)就是其中的一種，它具有適應(yīng)性強，可作荒山造林及營造薪炭林。同時，樹形優(yōu)美，花繁葉茂，花朵金黃色，花期長，是兼具觀花和觀葉效果的園林綠化和林相改造的優(yōu)良樹種[3-4]。

隨著我國園林事業(yè)的快速發(fā)展，對這些既具有生態(tài)價值、經(jīng)濟價值，同時又具有顯著觀賞價值的觀賞相思樹的社會需求正在迅速增長，而銀葉金合歡的常規(guī)繁殖主要有播種和扦插，但由于種子要從國外引進，不僅價格較貴，而且播種條件要求嚴(yán)格、出苗困難，繁殖率極低；扦插繁殖又因枝條內(nèi)單寧含量較高而生根困難。植物組織培養(yǎng)技術(shù)具有繁殖系數(shù)大、繁殖周期短、迅速去除病毒、可周年生產(chǎn)等優(yōu)點, 故組織培養(yǎng)技術(shù)的探索成為了國內(nèi)外學(xué)者的研究焦點之一[5]。植物生長調(diào)節(jié)劑是植物組織培養(yǎng)的關(guān)鍵物質(zhì)，雖用量極小，但在植物組織培養(yǎng)中起著重要和明顯的調(diào)節(jié)作用[6]，因此組培研究中，對添加植物激素的種類和濃度的研究較為普遍。但傳統(tǒng)的組織培養(yǎng)試驗是在每個階段篩選出合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)環(huán)境，轉(zhuǎn)接過程可能會造成污染，工作量大，周期長。而響應(yīng)面法(RSM)采用多元二次回歸，將多因子實驗中因子指標(biāo)的相互關(guān)系用多項式近似擬合，通過對函數(shù)響應(yīng)面和等高線的分析，能夠精確地研究各因子與響應(yīng)值之間的關(guān)系[7]。具有試驗數(shù)少、周期短、回歸方程精度高，并能克服正交試驗只能處理離散水平值，而無法找出最佳組合和響應(yīng)值的缺陷[8]。近幾年，響應(yīng)面法在植物組織培養(yǎng)中逐步得到應(yīng)用[9-10]。探討增殖階段，植物生長調(diào)節(jié)劑(6-BA、IBA、GA3)對其增殖系數(shù)的影響。并在單因素的試驗基礎(chǔ)上，參考Box-Behnken 設(shè)計的中心組合試驗設(shè)計原理，用響應(yīng)面法將各因子的相互關(guān)系進行擬合分析，研究各因子與響應(yīng)值的關(guān)系，從而優(yōu)化銀葉金合歡的組培條件，為今后相關(guān)研究提供理論實踐基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

2018年1月，選擇連續(xù)晴天3 d以上，從湛江東盟城的東菊公園選擇生長健壯、無病蟲害的植株，先用酒精消毒后的手術(shù)刀將含有腋芽的當(dāng)年枝條，從其母株上切下，切除枝條上的葉部結(jié)構(gòu)后，用流水沖洗干凈，放室內(nèi)晾3 d。隨后，將其放入5%洗潔精溶液中浸泡30 min，軟毛刷洗凈后流水沖洗30 min，切成長1.0～2.0 cm帶腋芽的莖段，在超凈工作臺上先用75%的酒精消毒1 min，再用0.2% 的升汞(加幾滴吐溫-20)浸泡消毒20 min，最后用無菌水沖洗5～7次，接于 MS培養(yǎng)基上，獲得不定芽。待生長一段時間，剪取不定芽幼嫩莖段，去掉基部葉片，就用此單芽莖段作為實驗材料進行離體腋芽增殖培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)條件

基本培養(yǎng)基為含有30% g/L蔗糖添加量，瓊脂粉濃度為6 g/L的MS培養(yǎng)基，附加各種不同比例的激素，pH值為5.8～6.2。組培室培養(yǎng)溫度(25±2)℃，培養(yǎng)基均在 121 ℃ 高壓滅菌 15 min，光照 12 h/d，光照度 2000 lx。

1.3 試驗方法

1.3.1 單因素試驗

1.3.1.1 6-BA對增殖系數(shù)的影響：將不定芽接種到培養(yǎng)基內(nèi)，6-BA濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mg/L。每個水平處理5瓶，每瓶接種5株不定芽，重復(fù)3次，培養(yǎng)周期為30 d。

1.3.1.2 IBA對增殖系數(shù)的影響：將不定芽接種到培養(yǎng)基內(nèi)，IBA濃度分別為 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L。每個水平處理5瓶，每瓶接種5株不定芽，重復(fù)3次，培養(yǎng)周期為30 d。

1.3.1.3 GA3對增殖系數(shù)的影響：將不定芽接種到培養(yǎng)基內(nèi)，GA3濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/L。每個水平處理5瓶，每瓶接種5株不定芽，重復(fù)3次，培養(yǎng)周期為30 d。

1.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上，用響應(yīng)面分析法，根據(jù)Box- Behnken的中心組合試驗設(shè)計原理，以6-BA、IBA、GA3為試驗因子，增殖系數(shù)為響應(yīng)值，進行三因素三水平的優(yōu)化試驗設(shè)計，見表1。每個水平處理 10瓶，每瓶接種5株不定芽，培養(yǎng)周期為 30 d。

表1 銀葉金合歡增殖培養(yǎng)基響應(yīng)面試驗因素水平mg·L-1

1.4 數(shù)據(jù)分析

用 SPSS和Design-Expert8.0.6軟件對數(shù)據(jù)進行分析。

增殖系數(shù)=培養(yǎng)30 d后有效不定芽總數(shù)/接種的不定芽株數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 6-BA激素濃度對增殖系數(shù)的影響。由表2可知，不同6-BA激素濃度對銀葉金合歡的增殖影響效果差異極大。隨培養(yǎng)基中6-BA 濃度的升高，銀葉金合歡的增殖系數(shù)也逐漸增加，6-BA濃度達到2.0 mg/L時增殖系數(shù)達到最大，為3.21；當(dāng) 6-BA 濃度增加到 2.5 mg/L 時，銀葉金合歡組培苗的增殖系數(shù)反而減小，說明6-BA濃度為2.5 mg/L 時銀葉金合歡組培苗的增殖生長受到抑制，表明不是6-BA激素濃度越高就越對銀葉金合歡組培苗的增殖越好，對連續(xù)增殖也存在不利影響，同時6-BA濃度為1.5 mg/L與2.5 mg/L差異不明顯。因此，在銀葉金合歡組培苗增殖培養(yǎng)中以6-BA 濃度為2.0 mg/L。

表2 增殖培養(yǎng)試驗設(shè)計與結(jié)果 mg·L-1

2.1.2 IBA激素濃度對增殖系數(shù)的影響。由表2可知，不同IBA激素濃度對銀葉金合歡增殖影響效果不同。各處理的增殖系數(shù)高低次序表現(xiàn)為0.40 mg/L>0.50 mg/L>0.30 mg/L>0.20 mg/L>0.10 mg/L。其中， 無菌組培苗在含0.40 mg/L的培養(yǎng)基中增殖系數(shù)最大，為2.88，IBA激素濃度為0.1 mg/L增殖系數(shù)最低為1.23，但是通過觀察發(fā)現(xiàn)，IBA激素濃度低的情況下，芽苗長勢不錯，比較健壯，葉子呈綠色，可能在IBA濃度較低的情況下，有利于芽苗伸長，長大。因此，銀葉金合歡增殖培養(yǎng)IBA激素濃度不適合于過高。綜合考慮分析，0.40 mg/L為銀葉金合歡增殖培養(yǎng)的適宜激素濃度。

2.1.3 GA3對增殖系數(shù)的影響。在植物組織培養(yǎng)中，GA3的作用主要用于促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株；赤霉素和生長素協(xié)同作用，對形成層的分化有影響，當(dāng)生長素/赤霉素比值高時有利于木質(zhì)部分化，比值低時有利于韌皮部分化。所以，很多組培研究中都應(yīng)用于增殖階段[11-12]，有利于組培苗增殖分化和生長。不同GA3激素濃度處理的銀葉金合歡增殖系數(shù)進行多重比較分析。結(jié)果表明，不同濃度GA3處理對銀葉金合歡增殖系數(shù)影響的作用排序為 GA30.20 mg/L>GA30.30 mg/L>GA30.40 mg/L>GA30.50 mg/L>GA30.10 mg/L。差異顯著性檢測結(jié)果顯示，GA30.20 mg/L 處理與其它三者處理間的增殖系數(shù)差異顯著；而GA30.40 mg/L與0.50 mg/L 的增殖系數(shù)差異不顯著。同時，GA3激素濃度越高越容易導(dǎo)致不定芽之間的抑制作用越強，進而導(dǎo)致叢生芽之間不易生長，因此，在增殖培養(yǎng)基中使用較低的GA3濃度就越好，這個也和很多組培研究人員比較符合[13-14]。因此，在銀葉金合歡組培苗增殖培養(yǎng)中以GA3濃度為0.2 mg/L比較合適。

表3 單因素試驗結(jié)果

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 回歸方程分析。以培養(yǎng)基中6-BA(A)、IBA(B)、GA3(C)為自變量因素，增殖系數(shù)(Y)為響應(yīng)值，根據(jù)試驗結(jié)果得到回歸方程為:

Y=2.89+1.49A-0.25B+0.36C+0.21A×B-0.14×A×C-0.28×B×C-0.66×A2-1.14×B2-1.16×C2, 其中, 相關(guān)系數(shù)R2=0.9914,校正決定系數(shù)R2=0.9803。該回歸方程的P值<0.0001,有極顯著性；方程經(jīng)失擬性檢驗分析得F=0.88,P>0.1, 失擬不顯著, 表明本實驗誤差小且方程對試驗擬合情況較好。從表4顯示, A、BC、A2、B2、C2回歸系數(shù)極顯著(P<0.01)。表明3因素對增殖系數(shù)的影響力大小為6-BA>GA3>IBA，其中激素6-BA濃度對銀葉金合歡外植體誘導(dǎo)出不定芽有著極顯著影響，且6-BA 濃度與GA3濃度的交互作用對誘導(dǎo)出不定芽有顯著性影響，但是6-BA濃度與IBA 濃度、GA3濃度的交互作用對結(jié)果影響不顯著。通過Design-Expert V8.0.6軟件得到最優(yōu)增殖培養(yǎng)基的激素濃度6-BA、IBA和GA3分別為:A=2.00 mg/L,B=0.39 mg/L,C=0.21 mg/L。

表4 響應(yīng)面二次回歸方程方差分析

根據(jù)擬合方程，繪制3因素之間交互作用的響應(yīng)面圖和等高線圖(如圖1)。從響應(yīng)面的坡度變化及等高線的形狀可分析各因素的交互作用: 若等高線的形狀為橢圓形表示因素間交互作用顯著，圓形則表示因素間交互作用可忽略不計[15]，同時響應(yīng)面坡度相對平緩表示響應(yīng)值不敏感; 反之，則敏感。由圖1可知，有關(guān)6-BA、IBA、GA3的曲面的區(qū)別都比較陡峭，也就意味著這3種激素對于增殖的影響比較大，尤其是6-BA、GA3呈現(xiàn)極顯著的差異，影響同等大，而IBA呈現(xiàn)顯著的差異，影響相對小一點，同時通過通過等高線圖及響應(yīng)面圖，可見6-BA與 GA3的交互作用影響力最大，呈現(xiàn)顯著的差異。

圖1 6-BA、IBA和GA3濃度對銀葉金合歡增殖影響的響應(yīng)面和等高線

2.2.2 最佳激素濃度配比及驗證。通過二次回歸方程的分析可得出銀葉金合歡增殖的最優(yōu)條件如下：最優(yōu)增殖培養(yǎng)基的激素濃度6-BA、IBA和GA3分別為:A=2.00 mg/L,B=0.39 mg/L,C=0.21 mg/L。最佳增殖系數(shù)預(yù)測值為3.75。對該模型進行3次驗證試驗，為了操作的方便，試驗條件如下：6-BA濃度為2.00 mg/L+IBA濃度為4.0 mg/L+GA3濃度為0.20 mg/L。每次處理10株不定芽，獲得增殖系數(shù)實際平均值為3.73。與預(yù)測值十分接近，說明方程與真實試驗擬合度較好，該優(yōu)化方案有實際意義和可行度。

3 討論與結(jié)論

由于銀葉金合歡植物具有較高的觀賞價值和經(jīng)濟利用價值，在廣東、廣西以及福建等地得到大面積的推廣，種苗需求越來越多，但是目前銀葉金合歡在種子繁殖、扦插繁殖種苗方面存在著很多問題，比如萌發(fā)或者萌發(fā)率較低、難以生根、無法保持親本的優(yōu)良性狀等等。因此，通過植物組織培養(yǎng)來培育種苗就顯得非常重要，稱為專家關(guān)注的焦點，而在銀葉金合歡組織培養(yǎng)中不定芽的增殖培養(yǎng)室基礎(chǔ)也是難點。

6-BA可以促進細(xì)胞分裂，誘導(dǎo)芽分化，促進側(cè)芽萌發(fā)生長，在組織培養(yǎng)中一般用于誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基中，IBA和6-BA一樣，促進誘導(dǎo)愈傷組織的形成，但是2種激素濃度不是越高就越對銀葉金合歡組培苗的增殖越好，并對連續(xù)增殖也存在不利影響。GA3主要用于促進幼苗莖的伸長生長，促進不定胚發(fā)育成小植株，GA3激素濃度越高越容易導(dǎo)致不定芽之間的抑制作用越強，進而導(dǎo)致叢生芽之間不易生長。通過調(diào)節(jié)這3種激素濃度，能夠更好地提高增殖系數(shù)。本研究在單因素試驗中，6-BA、IBA、GA3的最佳增殖系數(shù)分別為 3.32、2.97、2.24。響應(yīng)面分析法是一種試驗次數(shù)少、回歸方程精度高、能研究多因子間交互作用的研究方法，其高效便捷，可節(jié)省人力、成本和時間[16]。優(yōu)化試驗的結(jié)果顯示，最適合銀葉金合歡增殖的培養(yǎng)環(huán)境如下：6-BA濃度為2.00 mg/L+IBA濃度為4.0 mg/L+GA3濃度0.20 mg/L，預(yù)測增殖系數(shù)為3.75。而優(yōu)化試驗中最佳增殖系數(shù)為3.73，明顯高于單因素的試驗結(jié)果，說明響應(yīng)面法用于銀葉金合歡組培苗增殖培養(yǎng)條件的優(yōu)化是可靠的。因此，利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化銀葉金合歡組培苗的增殖培養(yǎng)條件并獲得成功，為銀葉金合歡組織培養(yǎng)的工廠化育苗提供了一定的理論支撐。