戰(zhàn)晶玉，袁星星，張雅麗，劉長發(fā)，王炳予

（黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院南崗分院，黑龍江哈爾濱 150036）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）是一種因環(huán)境和遺傳背景等多因素相互作用產(chǎn)生的慢性腸道炎癥性疾病，常累及直腸和結(jié)腸黏膜及黏膜下層，具有反復(fù)發(fā)作的特點［1］。免疫因素是UC 的核心機制，而異常的免疫激活對UC 的發(fā)病中具有重要作用，因此抑制或是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的活性對于UC 的治療具有重要的意義，并且為UC 的治療帶來新的方法［2］。

人體的免疫系統(tǒng)包括先天性免疫和適應(yīng)性免疫，其中包括輔助性T 細(xì)胞（T helper，Th）及調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（regulatory T，Treg）在內(nèi)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答是機體免疫調(diào)節(jié)的核心，并且參與UC 的發(fā)生與發(fā)展。近年來研究發(fā)現(xiàn)，Th17 和Treg 通過分泌促炎性細(xì)胞因子從而提高腸道蛋白酶的活性，最終引起腸道炎癥反應(yīng)和黏膜損傷［3-5］。連草瀉痢膠囊為我院張雅麗教授治療潰瘍性結(jié)腸炎的經(jīng)驗方，能夠有效改善UC 患者炎性因子的失衡和腸道黏膜屏障功能的異常［6］。同時，動物實驗表明連草瀉痢膠囊具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抑制潰瘍的作用［7］。本研究通過分析UC 小鼠模型脾臟和腸系膜淋巴組織中Th17 和Treg 細(xì)胞的比例，以期進一步明確連草瀉痢膠囊抑制腸道炎癥反應(yīng)的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

雄性無特定病原體級的BALB/c 小鼠（體質(zhì)量18～22 g，7～8 周齡）購于北京Charles River 公司（實驗動物生產(chǎn)許可證：SCXK（京）2016-0011）。動物飼養(yǎng)于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院動物實驗中心，飼養(yǎng)環(huán)境：無特定病原體級實驗動物屏蔽環(huán)境，相對恒溫恒濕（溫度：21～24 ℃，濕度：44%～55%），12 h的光暗循環(huán)，自由飲水及攝食。實驗操作嚴(yán)格遵循《關(guān)于善待實驗動物的指導(dǎo)性意見》中相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)［8］。

1.2 藥物與試劑

連草瀉痢膠囊（組成：黃連、木香、炒薏苡仁、白芍、馬齒莧、蒲公英和白花蛇舌草，0.5 g/粒，黑藥制字：Z20180005）購于黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院成藥局；美沙拉嗪腸溶片（莎爾福，0.5 g/片，進口藥品注冊證號：H20171358）購于德國?？酥扑幑煞萦邢薰?；葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS，分子量36 000～50 000 Da）購于法國MP Biomedicals公司；無毒環(huán)保蘇木素-伊紅（hematoxylin eosin，HE）染液購于南京建成生物工程研究所（貨號：D006-1-3）。 小鼠轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）購于江蘇酶免實業(yè)有限公司（貨號：MM-45041M2）。小鼠白介素6（interleukin 6，IL-6）、IL-17A 酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）檢測試劑盒及辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司（貨號分別為：PT878、PI326、PI545 和A0201）；紅細(xì)胞裂解液購于北京索萊寶科技有限公司（貨號：R1010）；RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）購于美國Gibco 公司（貨號：11875101 和26140079）；抗CD4抗體、抗CD25 抗體、維甲酸相關(guān)孤兒受體γt（ROR-γt）、抗叉頭狀轉(zhuǎn)錄因子p3（Foxp3）抗體和β-actin 抗體購于英國Abcam 公司（貨號分別為：ab207755、ab283576、ab58670、ab36607 和ab8227）；抗IL-17A 抗體購于美國Cell signaling Technology公司（貨號：13838）；BD Perm/Wash 破膜劑購于美國BD Biosciences 公司（貨號：554723）。

1.3 動物分組與造模

40 只BALB/c 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后按照體質(zhì)量隨機分為空白組、模型組、美沙拉嗪組和連草瀉痢膠囊組，每組各10 只。造模前，將DSS 溶于適量的蒸餾水中配置成3%的DSS 溶液。同時，分別取適量粉碎后的美沙拉嗪腸溶片及連草瀉痢膠囊溶于適量的蒸餾水中配置成終濃度為15.6 g/L 和16.1 g/L 的混懸藥液。除空白組外，其余30 只BALB/c 小鼠按照文獻［9］中的方法復(fù)制UC 模型，具體方法如下：模型組、美沙拉嗪組和連草瀉痢膠囊組小鼠予以3%DSS 溶液自由飲用，期間美沙拉嗪組和連草瀉痢膠囊組小鼠分別給予0.68 g/kg 美沙拉嗪混懸液和0.77 g/kg 連草瀉痢膠囊水溶液灌胃，每次1 mL，每日1 次，灌胃劑量參照人和動物藥物等效劑量進行換算?？瞻捉M小鼠則給予蒸餾水自由飲用，期間與模型組小鼠則給予等體積的蒸餾水灌胃，連續(xù)7 d。造模期間每日監(jiān)測小鼠食物和水的攝入量、體重、大便稠度和大便潛血。并參照文獻［10］中方法評估小鼠結(jié)腸炎疾病活動指數(shù)（disease activity index，DAI）。

各組小鼠于末次給藥后禁食24 h，以1%戊巴比妥鈉40 mg/kg 腹腔注射進行麻醉，從回盲部到分離直腸遠端分解結(jié)腸，用磷酸鹽緩沖鹽溶液輕輕沖洗以除去糞便，同時測量切除的結(jié)腸的重量和長度。隨后取1 cm 中段結(jié)腸組織置于4%多聚甲醛中的固定，余下組織置于-80 ℃保存。同時，收集各組小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)，用于指標(biāo)檢測。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 結(jié)腸組織病理學(xué) 取置于4%多聚甲醛中固定的結(jié)腸組織，梯度酒精脫水后置于二甲苯中進行透明處理，石蠟包埋后以切片，切片厚度設(shè)定為5 μm。參照HE 染色試劑盒說明書進行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織病理形態(tài)的改變。參照文獻［11］中標(biāo)準(zhǔn)進行組織病理學(xué)評分，即根據(jù)結(jié)腸病變（潰瘍深度、潰瘍程度、炎癥的存在和纖維化的位置）的嚴(yán)重程度，每個參數(shù)從0 分到4 分：無變化得分為0；最小變化為1 分；輕度變化2 分；中度變化為3 分；嚴(yán)重變化評分為4 分，最低分為0 分，表明沒有炎癥；得分越高，結(jié)腸組織炎癥越嚴(yán)重。

1.4.2 ELISA 法檢測 取適量結(jié)腸組織并加入預(yù)冷的磷酸鹽緩沖鹽溶液中沖洗，玻璃勻漿器于冰浴中充分勻漿。于4 ℃環(huán)境下3 500 r/min 離心10 min，取上清。參照ELISA 試劑盒說明書測定組織TGF-β、IL-6 和IL-17A 的含量。

1.4.3 流式細(xì)胞術(shù) 取小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)組織剪碎、研磨后制備單細(xì)胞懸液，不銹鋼濾網(wǎng)過濾后使用紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞。1 500 r/min離心10 min，將所得細(xì)胞懸液在RPMI-1640 中洗滌兩次，并保存在含5%FBS 的冰上培養(yǎng)基中。隨后對細(xì)胞懸液進行計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個/mL。對于Th17 細(xì)胞檢測：從脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中分離的單個核細(xì)胞后用離子霉素和佛波肉豆蔻酸酯在5%CO2中處理1 h。隨后加入GolgiPlug 蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑并置于5%CO2中繼續(xù)孵育6 h。細(xì)胞用抗CD4 抗體于室溫下孵育15 min，固定、破膜、洗滌，加入抗IL-17A 抗體于室溫下繼續(xù)孵育30 min。對于Treg 細(xì)胞的檢測：分別于細(xì)胞中加入抗CD4抗體和抗CD25 抗體孵育30 min，固定、破膜、洗滌，加入抗Foxp3 抗體進行染色，室溫下繼續(xù)孵育30 min。細(xì)胞洗滌后重懸，上機檢測。

1.4.4 Western blot 檢測 取結(jié)腸組織剪碎后置于RIPA 裂解液冰上裂解，以BCA 法測定總蛋白濃度；加入15 μL 蛋白樣品進行電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5% 脫脂牛奶封閉2 h；分別加入稀釋后的ROR-γt、Foxp3 及β-actin 兔單抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；TBST 緩沖液洗膜5 次，加入適量稀釋后的山羊抗兔二抗后室溫下繼續(xù)孵育1 h，TBST 緩沖液洗膜5 次。滴加ECL 顯影液，凝膠成像系統(tǒng)分析，β-actin 作為內(nèi)參，以目的蛋白與β-actin 的比值作為目的蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

通過SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間數(shù)據(jù)的比較以單因素方差（ANOVA）進行分析，組間兩兩的比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 連草瀉痢膠囊對UC 小鼠體重、DAI 評分和結(jié)腸長度的影響

實驗過程中模型組小鼠死亡1 例，其余3 組未出現(xiàn)死亡病例。與空白組相比，模型組小鼠體重和結(jié)腸長度明顯降低，DAI 評分明顯升高，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，實驗結(jié)束后美沙拉嗪組和連草瀉痢膠囊組小鼠體重和結(jié)腸長度明顯增加，DAI 評分明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠體重、DAI 評分和結(jié)腸長度的比較（±s）Tab 1 Comparison of body weight，DAI score and colon length of mice in each group（±s）

表1 各組小鼠體重、DAI 評分和結(jié)腸長度的比較（±s）Tab 1 Comparison of body weight，DAI score and colon length of mice in each group（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別空白組模型組美沙拉嗪組連草瀉痢膠囊組結(jié)腸長度（cm）9.68±1.12 7.43±0.83△9.07±1.38#8.93±1.12#6.570 0.001 n 10 9 10 10 FP體重（g）23.86±1.00 16.10±1.45△18.86±1.17#19.00±0.98#75.199 0.000 DAI 評分（分）0.20±0.42 7.22±1.09△3.30±1.34#2.70±0.95#78.562 0.000

2.2 連草瀉痢膠囊對UC 小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的影響

HE 染色結(jié)果顯示，空白組小鼠結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)正常，而模型組小鼠結(jié)腸組織中可見明顯潰瘍、糜爛，黏膜下層可見大量的炎性細(xì)胞存在及肉芽組織形成，其中組織病理學(xué)評分與空白組相比明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。美沙拉嗪及連草瀉痢膠囊均能夠改善結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)及炎性細(xì)胞的浸潤，尤其是組織水腫和黏膜潰瘍、糜爛明顯得到改善。兩組組織病理學(xué)評分與模型組比較均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。 見圖1和表2。

圖1 各組UC 小鼠結(jié)腸組織病理形態(tài)的比較（HE 染色，×200）Fig 1 Comparison of pathological morphology of colon tissue of UC mice in each group（HE staining，× 200）

表2 各組結(jié)腸組織炎癥評分的比較（分，±s）Tab 2 Comparison of inflammation scores in the colon tissue of each group（score，±s）

表2 各組結(jié)腸組織炎癥評分的比較（分，±s）Tab 2 Comparison of inflammation scores in the colon tissue of each group（score，±s）

注：與空白組比較，△P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

炎癥評分0.30±0.48 12.67±0.87△4.40±1.35#4.40±0.70#304.599 0.000組別空白組模型組美沙拉嗪組連草瀉痢膠囊組n 10 9 10 10 FP

2.3 連草瀉痢膠囊對UC 小鼠結(jié)腸組織中TGF-β、IL-6 和IL-17A 含量的影響

與空白組相比，模型組結(jié)腸組織中TGF-β 的含量顯著降低，IL-6 和IL-17A 的含量明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，實驗結(jié)束后美沙拉嗪組和連草瀉痢膠囊組小鼠結(jié)腸組織中TGF-β 明顯增加，IL-6 和IL-17A 的含量明顯降低，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3 各組結(jié)腸組織中TGF-β、IL-6 和IL-17A 含量的比較（pg/mL，±s）Tab 3 Effect of Liancao Xieli capsule on TGF- β，IL-6 and IL-17A in the colon tissue of UC mice（pg/mL，±s）

表3 各組結(jié)腸組織中TGF-β、IL-6 和IL-17A 含量的比較（pg/mL，±s）Tab 3 Effect of Liancao Xieli capsule on TGF- β，IL-6 and IL-17A in the colon tissue of UC mice（pg/mL，±s）

注：與空白組比較，△P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

IL-17A 96.00±6.79 266.99±18.89△177.83±22.44#183.09±17.86#151.686 0.000組別空白組模型組美沙拉嗪組連草瀉痢膠囊組n 10 9 10 10 FP TGF-β 76.92±9.20 60.54±8.35△75.33±12.61#75.18±4.78#6.442 0.001 IL-6 192.39±43.41 385.42±33.59△239.96±30.00#214.22±33.52#55.751 0.000

2.4 連草瀉痢膠囊對UC 小鼠Th17 和Treg 細(xì)胞比例的影響

與空白組相比，模型組小鼠脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中Th17、Treg 細(xì)胞的比例和Th17/Treg 的比值明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，實驗結(jié)束后美沙拉嗪組和連草瀉痢膠囊組小鼠脾臟及腸系膜淋巴結(jié)中Th17 細(xì)胞的比例和Th17/Treg 的比值明顯降低，而Treg 細(xì)胞的比例明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表4、5。

表4 各組脾臟中Th17 和Treg 細(xì)胞比例的比較（±s）Tab 4 Comparison of the proportion of Th17 and Treg cellsin the spleen of mice in each group（±s）

表4 各組脾臟中Th17 和Treg 細(xì)胞比例的比較（±s）Tab 4 Comparison of the proportion of Th17 and Treg cellsin the spleen of mice in each group（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

組別空白組模型組美沙拉嗪組連草瀉痢膠囊組Th17/Treg 0.21±0.02 0.38±0.06△0.20±0.03#0.17±0.04#52.109 0.000 n 10 9 10 10 FP Th17（%）1.41±0.15 3.30±0.40△1.93±0.40#1.77±0.42#49.818 0.000 Treg（%）6.78±0.52 8.66±0.47△9.43±0.78#10.56±1.14#41.298 0.000

表5 各組腸系膜淋巴結(jié)中Th17 和Treg 細(xì)胞比例的比較（±s）Tab 5 Comparison of the proportion of Th17 and Treg cells in mesenteric lymph nodes of mice in each group（±s）

表5 各組腸系膜淋巴結(jié)中Th17 和Treg 細(xì)胞比例的比較（±s）Tab 5 Comparison of the proportion of Th17 and Treg cells in mesenteric lymph nodes of mice in each group（±s）

注：與空白組比較，與空白組比較，△P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

Th17/Treg 0.54±0.06 0.78±0.11△0.45±0.05#0.39±0.04#58.687 0.000組別空白組模型組美沙拉嗪組連草瀉痢膠囊組n 10 9 10 10 FP Th17（%）2.03±0.19 4.64±0.57△3.38±0.32#3.15±0.19#91.979 0.000 Treg（%）3.81±0.42 5.93±0.19△7.47±0.60#8.05±0.46#218.033 0.000

2.4 連草瀉痢膠囊對UC 小鼠結(jié)腸組織中STAT3/ROR-γt和STAT5/Foxp3 信號通路的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中p-STAT3、ROR-γt、p-STAT5 和Foxp3 蛋白的表達水平明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而結(jié)腸組織中STAT3 和STAT5 蛋白的表達水平未見明顯改變，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.01）。與模型組相比，實驗結(jié)束后美沙拉嗪組和連草瀉痢膠囊組小鼠結(jié)腸組織中p-STAT3 和ROR-γt 蛋白的表達水平明顯降低，p-STAT5 和Foxp3 蛋白的表達水平明顯增加，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），而結(jié)腸組織中STAT3 和STAT5 蛋白的表達水平未見明顯改變，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表6 和圖2。

圖2 各組結(jié)腸組織中STAT3/ROR-γt 和STAT5/Foxp3通路蛋白表達的比較Fig 2 Comparison of STAT3/ROR-γt and STAT5/Foxp3 pathway protein expression in the colon tissues of each group

表6 各組結(jié)腸組織中STAT3/ROR-γt 和STAT5/Foxp3 通路的比較（±s）Tab 6 Comparison of STAT3/ROR-γt and STAT5/Foxp3 pathways in the colonic tissues of each group（±s）

表6 各組結(jié)腸組織中STAT3/ROR-γt 和STAT5/Foxp3 通路的比較（±s）Tab 6 Comparison of STAT3/ROR-γt and STAT5/Foxp3 pathways in the colonic tissues of each group（±s）

注：與空白組比較，△P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.01。

Foxp3/β-actin 0.20±0.08 0.42±0.13△0.55±0.10#0.60±0.06#35.116 0.000組別空白組模型組美沙拉嗪組連草瀉痢膠囊組n 10 9 10 10 FP p-STAT3/STAT3 0.26±0.07 0.46±0.13△0.32±0.11#0.32±0.10#6.345 0.001 ROR-γt/β-actin 0.28±0.04 0.65±0.13△0.44±0.12#0.44±0.26#8.586 0.000 p-STAT5/ STAT5 0.16±0.03 0.30±0.15△0.47±0.12#0.60±0.13#27.720 0.000

3 討論

潰瘍性結(jié)腸炎具有復(fù)雜的病理機制，目前尚未完全闡明。盡管如此，腸道炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的黏膜損傷在UC 發(fā)病中發(fā)揮著重要的作用。腸道黏膜屏障的受損可以引起腸道黏膜通透性的增加，從而引起腸道內(nèi)的抗原、細(xì)菌等有害物質(zhì)進入固有層導(dǎo)致免疫細(xì)胞的激活，誘導(dǎo)腸道異常的炎癥反應(yīng)［12］。TGF-β 分布于機體的多種細(xì)胞內(nèi)，是一種維持腸道免疫功能的抑炎因子，對于維持腸道的穩(wěn)態(tài)具有重要的作用［13］。IL-6 是一種由單核細(xì)胞產(chǎn)生的促炎因子，在調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)等過程中發(fā)揮著重要的作用。一方面，IL-6 可以影響腸道上皮細(xì)胞的分泌，進而導(dǎo)致黏膜通透性的增加和中性粒細(xì)胞的黏附和聚集，誘發(fā)或加重UC［14］。此外，IL-6 還可以與受體結(jié)合形成IL-6/sIL-6R 復(fù)合物，通過膜糖蛋白gp130-JAK 途徑，促使STAT3 的磷酸化及核轉(zhuǎn)位，導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生及持續(xù)［15］。IL-17A 是由Th17分泌的一種促炎因子，屬于IL-17 家族的一員。IL-17A 可以誘導(dǎo)多種促炎因子和趨化因子從而介導(dǎo)炎癥反應(yīng)，進而參與腸道免疫失衡［16］。研究證實，UC 患者血清和結(jié)腸組織中IL-17A 的表達水平顯著升高，并且與UC 患者脾虛濕熱證型的程度呈現(xiàn)顯著正相關(guān)［17，18］。同時，動物實驗顯示腹腔注射IL-17A 抗體能夠顯著減輕DSS 誘導(dǎo)的腸道炎癥程度［19］。本研究結(jié)果顯示，連草瀉痢膠囊治療后結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)及炎性細(xì)胞的浸潤情況明顯改善，并且連草瀉痢膠囊能夠顯著增加小鼠結(jié)腸組織中TGF-β的表達及降低IL-6 和IL-17A 的水平。

T 淋巴細(xì)胞亞群Th17/Treg 失衡是導(dǎo)致UC 的重要原因［20］。ROR-γt 和Foxp3 分別為調(diào)控初始T細(xì)胞向Th17/Treg 分化的轉(zhuǎn)錄因子，其中ROR-γt在Th17 分化過程中持續(xù)表達，進入細(xì)胞核的p-STAT3 通過激活ROR-γt 促使CD4+T 淋巴細(xì)胞向Th17 分化，分泌IL-17A。此外，構(gòu)建ROR-γt 缺陷小鼠模型可以顯著抑制炎性細(xì)胞的浸潤和組織募集，從而緩解炎癥反應(yīng)［21］。在本研究中發(fā)現(xiàn)連草瀉痢膠囊能夠明顯抑制p-STAT3 和ROR-γt 的表達水平，從而下調(diào)脾臟和腸系膜淋巴結(jié)中Th17 細(xì)胞的比例。該結(jié)果表明抑制IL-6/STAT3/ROR-γt信號通路的活化是連草瀉痢膠囊改善腸道炎癥的重要途徑之一。低濃度的TGF-β 可以誘導(dǎo)初始T細(xì)胞向Th17 的分化，而高濃度的TGF-β 可以誘導(dǎo)初始T 細(xì)胞向Treg 的分化［22］。CD4+CD25+Treg 細(xì)胞是Treg 細(xì)胞的一個亞群，通過分泌IL-10 和TGF-β 等維持機體的免疫耐受。有研究顯示Foxp3的表達水平在活動期UC 患者腸道組織中明顯高于穩(wěn)定期UC 患者，這表明Treg 在炎癥反應(yīng)發(fā)生是通過轉(zhuǎn)移至炎癥部位從而發(fā)揮抑制免疫應(yīng)答的作用［23］。STAT5 是激活初始T 細(xì)胞表達Foxp3 并發(fā)育成為Treg 的重要信號通路，STAT5 通過與Foxp3 基因上的結(jié)合位點結(jié)合從而發(fā)揮Foxp3 表達調(diào)控的作用［24］。本研究結(jié)果顯示，模型組小鼠脾臟和腸系膜淋巴結(jié)組織中Treg 細(xì)胞的比例增加，而連草瀉痢膠囊能治療后Treg 細(xì)胞的比例明顯增加。同時，連草瀉痢膠囊能夠顯著上調(diào)接觸組織中p-STAT5 和Foxp3 的表達水平。表明連草瀉痢膠囊主要通過激活STAT5/ Foxp3 信號通路，從而上調(diào)Treg 細(xì)胞的比例發(fā)揮抑制腸道炎癥反應(yīng)的作用。

連草瀉痢膠囊為本院獨立研制的中藥復(fù)方制劑（專利號CN103705796B），由黃連、木香、炒薏苡仁、白芍、馬齒莧、蒲公英和白花蛇舌草組成。方中黃連和木香作為君藥，其中黃連苦寒，清熱燥濕，瀉火解毒；木香辛、苦，溫，以制黃連苦寒之性，具有行氣止痛，健脾消食的功效。課題組前期研究結(jié)果顯示，黃連-木香藥對可以通過抑制PI3K/Akt/mTOR介導(dǎo)的細(xì)胞自噬，改善由DSS 誘導(dǎo)的腸道炎癥和黏膜屏障損傷［25］。臣以炒薏苡仁歸脾、胃、肺經(jīng)，健脾滲濕，除痹止瀉，清熱排膿；白芍苦、酸，微寒，平肝止痛，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗；馬齒莧清熱利濕；涼血解毒的功效。以上三藥合用具有健脾柔肝、利濕排膿。現(xiàn)代研究表明白芍的主要活性成分白芍總苷具有抗炎、止痛和調(diào)節(jié)免疫的作用，能夠通過調(diào)節(jié)Treg/Th17 免疫平衡和細(xì)胞因子的分泌從而改善UC 小鼠腸道黏膜的損傷［26］。馬齒莧專治瀉痢，一項網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究分析證實馬齒莧主要通過調(diào)節(jié)mTOR 信號通路發(fā)揮治療UC 的作用［27］。此外，馬齒莧多糖還可以通過改善UC 小鼠腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，進而抑制IL-6/STAT3 信號通路的活化，改善腸道炎癥［28-30］。蒲公英和白花蛇舌草清熱解毒，消腫散結(jié)，活血止痛，在此作為佐藥。全方共湊清熱解毒、滲濕排膿、活血止痛的功效。現(xiàn)代研究表明，蒲公英和白花蛇舌草的活性成分對DSS 誘導(dǎo)的UC小鼠模型均表現(xiàn)出較好的治療作用［31，32］。

綜上所述，本研究結(jié)果表明連草瀉痢膠囊主要通過抑制STAT3/ROR-γT 和促進STAT5/Foxp3信號通路的活化，從而調(diào)控Treg/Th17 免疫平衡，達到改善UC 腸道炎癥的作用。

作者貢獻說明：

戰(zhàn)晶玉：實驗設(shè)計，指標(biāo)檢測，撰寫論文；袁星星、王炳予：實驗造模、藥物干預(yù)；劉長發(fā)：指標(biāo)檢測；張雅麗：實驗數(shù)據(jù)審核及統(tǒng)計分析，審閱。