諶素華,秦小明, ,章超樺, ,曹文紅, ,鄭惠娜, ,林海生,
(1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院/國(guó)家貝類(lèi)加工技術(shù)研發(fā)分中心 (湛江)/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省海洋生物制品工程實(shí)驗(yàn)室/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 湛江 524088; 2. 大連工業(yè)大學(xué)/海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心,遼寧 大連 116034)
牡蠣屬于軟體動(dòng)物門(mén)、雙殼綱、珍珠貝目,俗稱海蠣子、蠔等,是世界第一大養(yǎng)殖貝類(lèi)[1]。牡蠣肉鮮味美、營(yíng)養(yǎng)豐富,富含蛋白質(zhì),其氨基酸組成和品質(zhì)優(yōu)于人乳和牛乳,有“海底牛奶”之稱[2]。牡蠣具有獨(dú)特的食用、藥用價(jià)值,是我國(guó)首批被列為藥食同源的保健食品之一[3]。據(jù)《神龍本草經(jīng)》和《傅青主女科》記載,蠣肉治虛損,療婦人氣血;治產(chǎn)后汗出煩躁,效果顯著。研究表明,牡蠣酶解產(chǎn)物 (Oyster enzymatic hydrolysate products,OEHP) 具有增強(qiáng)免疫力[4]、抗腫瘤[5]、抗癌[6]、抗氧化[7]、降血壓[8]、降血糖[9]和抗炎[10]等多種生物活性,但有關(guān)OEHP對(duì)泌乳的作用和機(jī)理等尚未見(jiàn)報(bào)道。
母乳含有豐富的免疫物質(zhì)和活性生長(zhǎng)因子,能全面滿足嬰兒生長(zhǎng)、發(fā)育的需要,母乳喂養(yǎng)是全球公認(rèn)的最佳喂養(yǎng)方式[11-13]。目前受職業(yè)女性增加、剖宮產(chǎn)率增高、母乳喂養(yǎng)知識(shí)缺乏、膳食營(yíng)養(yǎng)不均衡、生活方式改變以及社會(huì)環(huán)境等因素的影響,產(chǎn)后缺乳癥逐年攀升,母乳喂養(yǎng)現(xiàn)狀堪憂[14-17]?;谀迪牭乃幨硟捎脙r(jià)值,有必要對(duì)其促進(jìn)泌乳作用進(jìn)行深入研究。本研究先開(kāi)展了牡蠣粉對(duì)哺乳期超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳影響的預(yù)實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示牡蠣粉能顯著改善哺乳期母鼠泌乳,在此基礎(chǔ)上,采用大鼠超負(fù)荷哺乳模型探索了OEHP對(duì)母鼠泌乳的調(diào)節(jié)作用,以期為牡蠣資源的開(kāi)發(fā)與利用提供參考依據(jù)。
SPF級(jí)健康SD大鼠 (49日齡未配種大鼠),購(gòu)于北京華阜康生物科技有限公司,動(dòng)物生產(chǎn)許可號(hào)為SCXK [(京) 2019-0008]。其中,雌性60只,雄性30只,雌鼠體質(zhì)量為180~200 g,雄鼠體質(zhì)量為 200~250 g。
香港牡蠣 (Crassostrea hongkongensis) 購(gòu)于湛江霞山東風(fēng)水產(chǎn)品市場(chǎng),新鮮開(kāi)殼清洗干凈,勻漿后冷凍干燥超微粉碎過(guò)100目篩制得牡蠣粉(Oyster powder, OP) 備用。OEHP的制備采用常格[18]方法,加入動(dòng)物蛋白水解酶 (1 000 U·g-1),53 ℃酶解4 h后離心取上清液濃縮冷凍干燥,得OEHP備用。
動(dòng)物蛋白水解酶 (酶活為18×104U·g-1,南寧龐博生物工程有限公司);硼酸、無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇、濃硫酸、濃鹽酸、硫酸鉀、葡萄糖、正丁醇、五水合硫酸、三氯乙酸、二甲苯 (分析純,廣東光華科技股份有限公司);蘇木精伊紅染色劑(>200 T)、水合氯醛、乙酸鋅、福林酚、牛血清蛋白 (97%純度)、PRL試劑盒 (廣州鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。
UX42OH電子天平、HC10002小動(dòng)物電子秤、ATY1124電子天平 (日本島津公司);RM2016石蠟切片機(jī)、KD-H烘片機(jī)、DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡 (德國(guó)Leica公司);Varioskan Flash全自動(dòng)酶標(biāo)儀 (美國(guó)Thermo公司)。
1.3.1 一般營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定 水分按照GB 5009.3—2010采用常壓干燥法測(cè)定;灰分按照GB 5009.4—2010采用高溫灼燒法測(cè)定;脂肪按照GB 5009.6—2003采用索氏抽提法測(cè)定;蛋白質(zhì)按照GB 5009.5—2010采用凱氏定氮法測(cè)定,轉(zhuǎn)換系數(shù)為6.25;總糖采用蒽酮比色法測(cè)定,測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.005 9x+0.000 6 (R2=0.998 6)。
1.3.2 牡蠣粉和OEHP的灌胃量確定 參考胡培麗等[19]的方法,開(kāi)展牡蠣粉對(duì)哺乳期母鼠泌乳的預(yù)實(shí)驗(yàn),灌胃劑量參考1 800 mg·kg-1;結(jié)合牡蠣酶解粉蛋白質(zhì)含量及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)實(shí)際情況確定本實(shí)驗(yàn)的灌胃劑量,按照1∶2∶4選擇高、中、低劑量,確定OEHP的灌胃高、中、低劑量為1 250、625、312.5 mg·kg-1。
1.3.3 大鼠同籠交配 雌雄比2∶1,連續(xù)同籠7 d,交配后的雌鼠合籠飼養(yǎng),每籠5只。妊娠20 d后,將雌孕鼠單籠飼養(yǎng),做好分娩準(zhǔn)備,每日觀察2次,及時(shí)了解大鼠分娩及分娩的胎仔數(shù)量,分娩結(jié)束后,清點(diǎn)仔鼠數(shù)。
1.3.4 超負(fù)荷哺乳模型建立 參考胡培麗等[19]和汪琴等[20]的方法,建立大鼠超負(fù)荷哺乳模型,取產(chǎn)仔前后相差不超過(guò)24 h的40只母鼠作為研究對(duì)象,每窩仔鼠調(diào)整為14只。在哺乳期前5 d一旦發(fā)現(xiàn)仔鼠死亡,記為仔鼠自然死亡,立即補(bǔ)充仔鼠到14只;超過(guò)5 d后仔鼠死亡,則不再補(bǔ)充異窩仔鼠。將母鼠按體質(zhì)量隨機(jī)分為對(duì)照組和OEHP高、中、低劑量組,每組10只。自分娩第二日起,對(duì)照組每日以蒸餾水灌胃,給藥組分別以不同濃度的OEHP灌胃,每日1次,各組均灌胃21 d,各組動(dòng)物均正常飲水。哺乳母鼠和仔鼠每天稱體質(zhì)量1次,分別計(jì)算期間哺乳母鼠泌乳量和仔鼠平均體增重。每日觀察仔鼠死亡情況。
1.3.5 相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 1) 母鼠泌乳量測(cè)定。母鼠產(chǎn)仔后第二日起,每日08:00時(shí)將仔鼠與母鼠分離,待仔鼠饑餓4 h后,即12:00時(shí)對(duì)仔鼠進(jìn)行哺乳前稱量,之后將仔鼠放回鼠窩中哺乳1 h,然后再次分離仔鼠與母鼠,并對(duì)哺乳1 h后的仔鼠進(jìn)行稱量,仔鼠哺乳1 h前后的體質(zhì)量差值即為這一小時(shí)的泌乳量。2) 仔鼠平均體增重測(cè)定。仔鼠從產(chǎn)后第二日起,每日08:00時(shí)將仔鼠與母鼠分離后立即稱量每窩仔鼠體質(zhì)量,持續(xù)稱量21 d,記錄數(shù)據(jù),計(jì)算21 d仔鼠前后體質(zhì)量差。3) 乳腺器官指數(shù)、臟器指數(shù)測(cè)定。處死母鼠后剪取第三對(duì)乳腺稱質(zhì)量;分別剪取母鼠心臟、胸腺、脾臟、肝臟、腎臟等稱質(zhì)量并計(jì)算。乳腺指數(shù)=乳腺組織質(zhì)量/母鼠體質(zhì)量×100%,臟器指數(shù)=臟器組織質(zhì)量/母鼠體質(zhì)量×100%。4) 泌乳素 (Prolactin, PRL) 測(cè)定。PRL測(cè)定方法按試劑盒說(shuō)明操作,酶標(biāo)儀檢測(cè),以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)物的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出直線回歸方程,再將樣品的OD值代入直線回歸方程中,計(jì)算樣品濃度,即為母鼠血清PRL濃度,測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.001 6x-0.032 2(R2=0.998 2)。5) HE染色法觀察乳腺組織結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)處死母鼠,剪取第三對(duì)乳腺,固定后染色鏡檢進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。
所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,利用獨(dú)立性t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析,結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。
牡蠣粉和OEHP一般營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1,兩者的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高,其次是總糖,而脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。
表1 牡蠣及其酶解產(chǎn)物一般營(yíng)養(yǎng)成分 (干基)Table 1 General nutrition indices and enzymatic hydrolysate products of oyster (dry mass basis) %
對(duì)超負(fù)荷哺乳大鼠持續(xù)灌胃21 d的每天每小時(shí)泌乳量和總平均泌乳量進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表2和表3。與對(duì)照組比較,OEHP高劑量組母鼠的每天每小時(shí)泌乳量有顯著性差異 (P<0.05) 的天數(shù)是第3、第4、第5、第6、第10、第11、第14、第15和第18天,有極顯著差異 (P<0.01) 的天數(shù)是第1、第2、第7、第9、第12、第13、第16、第17、第20和第21天;中劑量組母鼠的每小時(shí)泌乳量有顯著性差異 (P<0.05) 的是第2、第3、第4、第11和第16天,有極顯著差異 (P<0.01) 的天數(shù)是第9、第12、第13、第14、第18、第20和第21天;僅第8和第19天各劑量組母鼠每小時(shí)泌乳量無(wú)顯著差異;低劑量組母鼠每小時(shí)泌乳量有顯著性差異 (P<0.05) 的是第3、第16和第18天。與中劑量組相比,高劑量組母鼠每小時(shí)泌乳量在第6和第10天有顯著性差異 (P<0.05),在第1和第17天有極顯著差異 (P<0.01);與低劑量組相比,高劑量組在第5、第6、第7、第12和第16天有顯著差異 (P<0.05),在第1、第2、第9、第13、第17和第21天有極顯著差異 (P<0.01);與低劑量組相比,中劑量組在第5、第12和第14天有顯著性差異 (P<0.05),在第20天有極顯著差異 (P<0.01)。本結(jié)果表明,OEHP高劑量組可顯著增加哺乳期母鼠的泌乳量,中劑量組的影響次之,低劑量組的影響最小且效果不顯著,OEHP對(duì)超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳的影響與灌胃劑量呈正相關(guān)。
表2 母鼠哺乳21 d每天每小時(shí)泌乳量Table 2 Maternal milk production per hour per day for female rats lactated for 21 d g·h-1
對(duì)灌胃21 d的各組母鼠總平均泌乳量進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表3。與對(duì)照組相比,OEHP高劑量組差異極顯著 (P<0.01),泌乳量增加57.85%;中劑量組差異顯著 (P<0.05),泌乳量增加38.02%;低劑量組差異不顯著,但泌乳量增加17.69%。以上結(jié)果表明OEHP使超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳量顯著增加,可有效促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳。
表3 母鼠哺乳21 d每小時(shí)泌乳量總平均值Table 3 Total average maternal milk production per hour per day for female rats lactated for 21 d g
本實(shí)驗(yàn)對(duì)哺乳21 d的仔鼠進(jìn)行觀察記錄,未發(fā)現(xiàn)死亡現(xiàn)象。并對(duì)其體增重進(jìn)行分析 (表4)。母鼠哺乳21 d后,OEHP高、中、低劑量組仔鼠體增重與對(duì)照組相比均有增加,分別增長(zhǎng)13.62%、12.28%、11.99%,且差異極顯著 (P<0.01),高劑量組與中低劑量組相比有顯著差異 (P<0.05)。本結(jié)果表明OEHP能明顯增加超負(fù)荷哺乳母鼠的泌乳量,從而使其窩仔鼠的體增重顯著增加,這一評(píng)價(jià)指標(biāo)也表明OEHP對(duì)哺乳期母鼠有促進(jìn)泌乳作用,可減少仔鼠的死亡。
表4 21 d仔鼠體增重Table 4 Total average body weight gain of newborn rats in 21 d g
對(duì)灌胃21 d母鼠的乳腺器官指數(shù)和臟器指數(shù)進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表5和表6。OEHP高劑量組的乳腺器官指數(shù)與對(duì)照組差異極顯著 (P<0.01),中劑量組與低劑量組差異顯著 (P<0.05)。本結(jié)果顯示各組乳腺器官指數(shù)由大到小的順序?yàn)楦邉┝拷M>中劑量組>低劑量組>對(duì)照組。乳腺器官指數(shù)能從側(cè)面反映哺乳期母鼠乳腺的生長(zhǎng)、發(fā)育與泌乳情況,說(shuō)明OEHP可以促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠乳腺發(fā)育。
表5 母鼠乳腺器官指數(shù)Table 5 Mammary gland organ indexes of female rats
與對(duì)照組相比,灌胃OEHP各劑量組的母鼠心臟指數(shù)有顯著差異 (P<0.05),其中高劑量組差異極顯著 (P<0.01),說(shuō)明OEHP能促進(jìn)哺乳期母鼠的心臟發(fā)育,使其泵血更有力,從而增強(qiáng)哺乳期母鼠的負(fù)荷能力 (表6)。高劑量組母鼠的脾臟指數(shù)與對(duì)照組相比差異顯著 (P<0.05),且腎臟指數(shù)差異極顯著 (P<0.01)。各組母鼠的臟器指數(shù)與對(duì)照組相比均有不同程度的增加,說(shuō)明OEHP能增強(qiáng)超負(fù)荷哺乳母鼠的臟器負(fù)荷能力,有利于其哺育仔鼠。
表6 母鼠臟器器官指數(shù)Table 6 Organ indexes of female rats
對(duì)灌胃21 d的各組哺乳母鼠的血清PRL進(jìn)行分析,結(jié)果見(jiàn)表7。與對(duì)照組相比,高劑量組PRL質(zhì)量濃度增加了41.67%,有極顯著性差異(P<0.01);中劑量組增加26.39%,有顯著性差異(P<0.05);低劑量組增加11.11%;OEHP高劑量組的PRL質(zhì)量濃度比低劑量組高27.50%,有顯著差異 (P<0.05)。由此可以得出OEHP高、中劑量組促進(jìn)超負(fù)荷哺乳期母鼠泌乳的效果顯著,且存在一定的劑量依賴性。
表7 母鼠血清催乳素質(zhì)量濃度Table 7 Serum PRL mass concentrations of female rats ng·mL-1
對(duì)灌胃21 d各組母鼠的乳腺組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察,結(jié)果見(jiàn)圖1。與對(duì)照組相比,OEHP各劑量組的母鼠乳腺組織腺泡較多,且集中,泡腔充盈,導(dǎo)管數(shù)量多,導(dǎo)管腔較粗,腺泡有明顯擴(kuò)大增生,OEHP高劑量組的效果最明顯,說(shuō)明OEHP能促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠乳腺發(fā)育,改善其乳腺結(jié)構(gòu),提高哺乳母鼠泌乳量,促進(jìn)泌乳。
圖1 各組乳腺組織結(jié)構(gòu)Figure 1 Tissue structure of mammary gland in each group
大鼠泌乳調(diào)節(jié)方式同人類(lèi)相似,在血漿PRL的調(diào)節(jié)下啟動(dòng)和維持泌乳。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,雖然不易觀察正常哺乳的催乳作用,但能觀察到乳汁分泌不足情況[21],所以在進(jìn)行泌乳實(shí)驗(yàn)時(shí)首先要建立乳汁不足的動(dòng)物模型。常用的大鼠缺乳模型有2種:1) 用化學(xué)藥物處理大鼠,使母鼠缺乳,建立病理模型;2) 通過(guò)調(diào)整每只母鼠所哺育的仔鼠數(shù)量,使母鼠在哺乳一定數(shù)量的仔鼠時(shí)不能滿足仔鼠的哺乳需求,為超負(fù)荷大鼠模型。產(chǎn)后缺乳是指產(chǎn)后哺乳期內(nèi)產(chǎn)婦乳汁甚少或無(wú)乳可下,不夠喂養(yǎng)嬰兒,乳房檢查松軟無(wú)痛,乳汁點(diǎn)滴而出[22]。為了能更好地貼合臨床實(shí)際,本研究采用正常大鼠超負(fù)荷哺乳模型來(lái)研究OEHP對(duì)母鼠泌乳的影響。
關(guān)于牡蠣促進(jìn)泌乳的研究報(bào)道較少,有種含牡蠣粉的營(yíng)養(yǎng)品和組合物能促進(jìn)產(chǎn)婦泌乳和恢復(fù)[23-24],其主要通過(guò)添加一定量的牡蠣營(yíng)養(yǎng)品來(lái)促進(jìn)泌乳作用,而有關(guān)牡蠣促進(jìn)泌乳作用及其機(jī)制的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文通過(guò)開(kāi)展牡蠣粉對(duì)哺乳期超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳的預(yù)實(shí)驗(yàn),確定牡蠣粉能有效改善超負(fù)荷母鼠泌乳,結(jié)合牡蠣粉在酶解后富含活性多肽且更容易被吸收利用的特點(diǎn),對(duì)OEHP進(jìn)行促進(jìn)泌乳效果研究,為下一步對(duì)OEHP中促進(jìn)泌乳的活性成分的研究奠定基礎(chǔ)。
乳腺是泌乳的前提,乳腺由乳腺組織和分布期間的結(jié)締組織構(gòu)成[25],其發(fā)育區(qū)別于機(jī)體其他組織器官,是哺乳動(dòng)物出生后可繼續(xù)生長(zhǎng)發(fā)育的動(dòng)態(tài)變化的器官。泌乳過(guò)程以乳腺發(fā)育為基礎(chǔ),發(fā)育完善的乳腺在PRL等作用下開(kāi)始泌乳的發(fā)動(dòng)和維持,而泌乳的每個(gè)階段受不同激素的影響,參與調(diào)節(jié)的主要激素包括PRL[26]、生長(zhǎng)激素 (Growth homorne,GH)[27]、雌性激素[28],在乳腺發(fā)育階段受雌激素和孕激素的影響,泌乳發(fā)動(dòng)階段主要受PRL和糖皮質(zhì)激素的影響,乳腺泌乳的維持階段受PRL和GH的調(diào)控[29]。乳汁的分泌過(guò)程首先是乳腺組織的分泌細(xì)胞從血液中吸取各種營(yíng)養(yǎng)成分,隨后細(xì)胞利用這些養(yǎng)分合成乳汁,乳汁合成后分泌到腺泡中,最后經(jīng)過(guò)導(dǎo)管等分泌到體外。腺泡可以理解為暫時(shí)儲(chǔ)存乳汁的空間[30],所以腺泡腔體大小可反映泌乳能力,腺泡腔體越大,泌乳量越多。乳腺上皮細(xì)胞在PRL的作用下,其新陳代謝速度加快,乳蛋白mRNA濃度也相應(yīng)增加[31]。王一飛等[32]通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)“米酒雞”食療方可使產(chǎn)后缺乳母鼠的催乳素受體 (PRLR) 及β酪蛋白陽(yáng)性表達(dá)增強(qiáng),促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳腺發(fā)育。張榮慶等[33]通過(guò)研究大豆黃酮對(duì)妊娠大鼠乳腺發(fā)育和泌乳作用的影響,發(fā)現(xiàn)大豆黃酮能夠顯著促進(jìn)妊娠期大鼠乳腺的發(fā)育,明顯提高其泌乳量、血清GH和PRL濃度以及乳腺胞漿雌二醇受體數(shù)目。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了哺乳母鼠血清PRL濃度,結(jié)果表明OEHP高、中劑量組能夠促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳且效果顯著,但缺少對(duì)母鼠乳腺組織中PRL水平分析,后續(xù)實(shí)驗(yàn)可通過(guò)增加此項(xiàng)來(lái)完善OEHP對(duì)超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳效果及機(jī)制的研究。
OEHP對(duì)超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳的影響與灌胃劑量呈正相關(guān),高劑量組可顯著增加哺乳期母鼠的泌乳量;OEHP高、中、低劑量組仔鼠體增重與對(duì)照組相比分別增加13.62%、12.28%、11.99%,且差異極顯著 (P<0.01),OEHP高劑量組與中、低劑量組相比,仔鼠體增重有顯著差異 (P<0.05);OEHP各劑量組母鼠乳腺指數(shù)與對(duì)照組相比有顯著差異(P<0.05);OEHP高、中劑量組哺乳母鼠血清PRL水平與對(duì)照組相比差異顯著,且與灌胃劑量呈正相關(guān)。OEHP組與對(duì)照組的臟器指數(shù)相比均有不同程度增加,表明OEHP能夠增強(qiáng)哺乳期母鼠的臟器負(fù)荷能力,有利于其哺育仔鼠;在顯微鏡下觀察,OEHP組母鼠乳腺腺泡組織比對(duì)照組多且集中,泡腔充盈,導(dǎo)管數(shù)量多,導(dǎo)管腔較粗,腺泡有明顯擴(kuò)大,表明OEHP能促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠乳腺發(fā)育,改善其乳腺結(jié)構(gòu),提高哺乳母鼠泌乳量,促進(jìn)泌乳。