孔祥福，賀 艷，宋偉豪，孫敏敏

(中國(guó)海洋大學(xué)海洋生物遺傳學(xué)與育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003)

MyoD1基因全稱為成肌分化抗原基因(Myogenicdifferentiationantigen)，具有誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞和其他非骨骼肌細(xì)胞分化為骨骼肌細(xì)胞的能力[1]。由于MyoD1基因能將其他細(xì)胞重新編程成肌肉，以及它在早期肌肉細(xì)胞系中的表達(dá)，其通常被稱為肌肉生成的主調(diào)節(jié)器[2]。具有bHLH 結(jié)構(gòu)域的MyoD1蛋白可以特異地與肌肉特異基因啟動(dòng)子上的E-box(CANNTG)位點(diǎn)結(jié)合[3-4]，并與其他轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子共同調(diào)節(jié)肌球蛋白重鏈(MyHC，Myosinheavychain) 和肌動(dòng)蛋白(α-Actin，alpha-Actin)等肌肉結(jié)構(gòu)蛋白的表達(dá)[5-7]。在體內(nèi)，從胚胎肌肉前體細(xì)胞的命運(yùn)決定、增殖和分化，到個(gè)體出生后肌肉的發(fā)育成熟及創(chuàng)傷修復(fù)，都有MyoD1基因的參與[8]。MyoD1基因過(guò)表達(dá)會(huì)引起成纖維細(xì)胞細(xì)胞的肌源性分化[9]，使非體節(jié)細(xì)胞向肌肉細(xì)胞轉(zhuǎn)變[10]。MyoD1基因的表達(dá)可以啟動(dòng)肌源性程序，在完整的肌肉發(fā)育過(guò)程中起到了必不可少的作用。與此相反，MyoD1基因缺失會(huì)導(dǎo)致胚胎骨骼肌細(xì)胞形成終止[11-12]，MyoD1基因敲除會(huì)破壞成肌細(xì)胞的分化能力[13-14]。

繼哺乳動(dòng)物之后，魚(yú)類中的MyoD1基因也相繼被克隆出來(lái)，其在不同魚(yú)類中的表達(dá)模式大致是相同的。在多數(shù)魚(yú)類中，MyoD1基因在各組織均有表達(dá)，在肌肉中的表達(dá)顯著高于其他組織[15-18]。魚(yú)類MyoD1基因的表達(dá)可能與運(yùn)動(dòng)相關(guān)的肌肉的發(fā)育[19]和個(gè)體的生長(zhǎng)速度相關(guān)[17-20]。目前，關(guān)于魚(yú)類MyoD1基因的功能驗(yàn)證主要在斑馬魚(yú)中開(kāi)展，經(jīng)濟(jì)魚(yú)類相關(guān)研究較少。MyoD1基因突變會(huì)引起斑馬魚(yú)顱骨肌肉組織嚴(yán)重減少、發(fā)育缺陷和仔魚(yú)致死率升高。此外，MyoD1基因的突變還會(huì)延遲和減小斑馬魚(yú)胚胎早期體節(jié)發(fā)生，造成肌肉體積的減小和肌纖維數(shù)目的增加[21-24]。

許氏平鲉(Sebastesschlegelii)為卵胎生的巖礁性魚(yú)類，其肉質(zhì)鮮美，是一種重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚(yú)類和增養(yǎng)殖優(yōu)良品種。但許氏平鲉生長(zhǎng)速度慢，肌肉生長(zhǎng)是對(duì)其進(jìn)行遺傳改良最有價(jià)值的經(jīng)濟(jì)性狀之一。為了更好地了解許氏平鲉MyoD1基因在肌肉生長(zhǎng)調(diào)控中的作用，本研究鑒定了許氏平鲉MyoD1基因，檢測(cè)了基因的時(shí)空表達(dá)情況，并利用小鼠C2C12細(xì)胞初步驗(yàn)證了其誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化的功能。本結(jié)果將為研究MyoD1基因在經(jīng)濟(jì)魚(yú)類肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程的調(diào)控作用提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

本研究中所用的1齡以下的許氏平鲉幼魚(yú)購(gòu)自于山東省青島市青島貝寶海洋科技有限公司，1齡及以上成魚(yú)購(gòu)自于山東省青島市竹岔島海上網(wǎng)箱。實(shí)驗(yàn)用魚(yú)的生長(zhǎng)狀態(tài)健康良好。對(duì)許氏平鲉斷椎處死，取出生后30天、60天、75天、90天、100天、180天、1齡、2齡、3齡、4齡魚(yú)的肌肉、2.5齡成魚(yú)的各組織，液氮速凍，-80 ℃保存，用于提RNA。另外，取部分肌肉，4%多聚甲醛(PFA)固定，用于肌肉組織的原位雜交實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)所用的Trizol購(gòu)買于Invitrogen公司；MLV 反轉(zhuǎn)錄體系、RNA 酶抑制劑 RRI、ScalⅠ 和XhoⅠ 內(nèi)切酶購(gòu)買于Takara公司；探針標(biāo)記試劑盒DIG RNA Labeling Kit、抗體Fab-AP、顯色液NBT/BCIP購(gòu)買于Roche公司；

1.2 總RNA提取、cDNA第一鏈合成及基因組DNA的提取

按照Trizol法提取許氏平鲉各組織、不同發(fā)育時(shí)期肌肉組織總RNA，采用DNase I清除RNA中的DNA，使用RNA clean試劑盒去除RNA中蛋白，通過(guò)Nanodrop儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的濃度和質(zhì)量。cDNA第一鏈利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶來(lái)合成，對(duì)合成的cDNA第一鏈進(jìn)行β-actin基因檢測(cè)，確定cDNA第一鏈?zhǔn)欠窨捎谩?/p>

采用酚-氯仿的方法提取許氏平鲉基因組DNA，利用Nanodrop儀和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的濃度和質(zhì)量。

1.3 MyoD1基因ORF序列和基因組DNA序列的獲得

使用primer5，根據(jù)許氏平鲉基因組注釋基因MyoD1(S.schlegelii_GLEAN_10020387)設(shè)計(jì)和優(yōu)化引物。本研究中所用引物見(jiàn)表1。以MyoD1-fw、MyoD1-rv為引物，分別以上述合成的cDNA和基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲取MyoD1基因的ORF片段和基因組DNA序列。用Taq DNA 聚合酶對(duì)MyoD1基因片段進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證，PCR反應(yīng)條件為：95 ℃，5 min；95 ℃，30 s，57 ℃，55 s(ORF)/3 min(DNA)，72 ℃，30 s，30 cycles；72℃，5 min，4 ℃，∞。將PCR產(chǎn)物克隆至pMDTM19T載體，轉(zhuǎn)化至DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)檢測(cè)得到的陽(yáng)性單克隆菌株進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析。

1.4 MyoD1基因多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

從NCBI和Ensembl網(wǎng)站下載其他物種的MyoD1氨基酸序列，同許氏平鲉的MyoD1-like氨基酸序列用 MUSCLE 進(jìn)行比對(duì)，利用 Genedoc 軟件進(jìn)行氨基酸多序列比對(duì)。采用 Bio Edit 和 MEGA7.0 的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)進(jìn)行聚類分析構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，Bootstrap的重復(fù)次數(shù)為5 000。各物種MyoD1氨基酸序列的 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)注冊(cè)序列號(hào)見(jiàn)表2。

表1 PCR所用引物

表2 用于比對(duì)的氨基酸序列

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

設(shè)計(jì)定量引物，擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度為172 bp，并通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定引物的擴(kuò)增產(chǎn)物單一。利用熒光定量PCR(qRT-PCR)，對(duì)上述合成的cDNA中MyoD1s基因的表達(dá)情況進(jìn)行定量分析。本實(shí)驗(yàn)中，內(nèi)參基因?yàn)镽pl17基因，產(chǎn)物長(zhǎng)度為109 bp，引物序列見(jiàn)表1。試劑為SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa公司)。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃，2 min；95 ℃，15 s，60 ℃，45 s，40 cycles。

1.6 原位雜交

因MyoD1、MyoD1-like基因mRNA序列差別較小，原位探針無(wú)法區(qū)分兩者，所以原位雜交結(jié)果為兩個(gè)基因表達(dá)產(chǎn)物的混合。設(shè)計(jì)探針合成引物，探針長(zhǎng)度為458 bp，SP6和T7啟動(dòng)子序列分別加在正向引物和反向引物的5’端。以肌肉cDNA為模板，用MyoD1s探針合成引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。隨后，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、連接、轉(zhuǎn)化及測(cè)序。對(duì)測(cè)序正確的菌液提質(zhì)粒。以質(zhì)粒為模板，再次PCR擴(kuò)增和膠回收。以膠回收產(chǎn)物(50 ng/μL)為模板，使用SP6/T7 RNA polymerase試劑盒(TaKaRa公司)分別合成正義、反義探針，使用Nanodrop儀檢測(cè)原位探針的濃度，通過(guò)電泳檢測(cè)探針的質(zhì)量。參照Lin等[25]的步驟進(jìn)行原位雜交。原位雜交結(jié)果經(jīng)Nikon AZ100顯微鏡相機(jī)進(jìn)行拍照。

1.7 MyoD1-like基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染

設(shè)計(jì)MyoD1-like基因ORF全長(zhǎng)引物，兩端分別加上ORF序列中不存在的酶切位點(diǎn)XhoⅠ 和SalⅠ，5′端加保護(hù)堿基。PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物膠回收，將膠回收產(chǎn)物和pEGFP-N1 空載質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切。酶切電泳檢測(cè)后分別切下正確條帶，膠回收。膠回收的目的基因與載體進(jìn)行T4連接，然后轉(zhuǎn)化及測(cè)序。對(duì)測(cè)序正確的菌液提取MyoD1-like-pEGFP-N1真核表達(dá)質(zhì)粒。

根據(jù)脂質(zhì)體2000 轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen，USA)說(shuō)明書(shū)的操作方法，分別將1 μg pEGFP-N1空載質(zhì)粒和MyoD1-like-pEGFP-N1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞密度為70%的小鼠C2C12細(xì)胞中。設(shè)置陰性對(duì)照(只加轉(zhuǎn)染試劑)和空白對(duì)照。24 h后，倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染是否成功；72 h后，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 許氏平鲉 MyoD1基因ORF序列的擴(kuò)增

MyoD1基因的ORF長(zhǎng)度為897 bp，編碼298個(gè)氨基酸。此外，在MyoD1基因的ORF擴(kuò)增過(guò)程中，MyoD1基因共擴(kuò)增出兩個(gè)片段。這兩個(gè)基因序列分別命名為MyoD1和MyoD1-like。如圖1所示，MyoD1和MyoD1-like序列存在19個(gè)bp的差異。

2.2 許氏平鲉MyoD1、MyoD1-like基因的確定及分析

2.2.1 MyoD1、MyoD1-like基因的確定 針對(duì)MyoD1基因擴(kuò)增出的兩個(gè)不同序列，我們進(jìn)一步利用酶切法進(jìn)行驗(yàn)證。將上述測(cè)序?yàn)镸yoD1、MyoD1-like基因的菌株分別提取質(zhì)粒。其中，MyoD1基因中無(wú)StuⅠ 內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)，帶有MyoD1基因的質(zhì)粒不能被StuⅠ 內(nèi)切酶切開(kāi)；而MyoD1-like基因中含有StuⅠ 內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，帶有MyoD1-like基因的質(zhì)?？梢员磺虚_(kāi)。酶切驗(yàn)證表明，MyoD1基因確實(shí)存在MyoD1和MyoD1-like兩個(gè)基因序列(見(jiàn)圖2)。

2.2.2 MyoD1、MyoD1-like基因的基因組DNA擴(kuò)增 基因組中的MyoD1擴(kuò)增結(jié)果顯示，可以擴(kuò)增出兩條帶，分別命名為條帶a和條帶b(見(jiàn)圖3)。其中條帶a的大小與預(yù)期MyoD1基因的基因組大小一致；條帶b的大小與MyoD1轉(zhuǎn)錄本的大小一致。測(cè)序結(jié)果顯示，條帶a的序列和MyoD1的基因組序列完全匹配，含有完整的內(nèi)含子和外顯子序列。條帶b的序列則和MyoD1-like的外顯子序列完全匹配，代表MyoD1-like基因沒(méi)有內(nèi)含子。在基因組DNA水平，我們也進(jìn)一步證明了MyoD1基因存在MyoD1和MyoD1-like兩個(gè)亞型。

2.3 許氏平鲉MyoD1-like氨基酸的多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析

由圖4可知MyoD1和MyoD1-like氨基酸序列僅存在兩個(gè)位點(diǎn)不一致。MyoD1氨基酸序列在64位和((A)以基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)出兩條帶，分別命名為條帶a和條帶b。(B)MyoD1和MyoD1-like基因組結(jié)構(gòu)示意圖。條帶a的序列和MyoD1的基因組序列完全匹配，含有完整的內(nèi)含子和外顯子序列。條帶b的序列則和MyoD1-like的cDNA序列完全匹配，代表MyoD1-like基因沒(méi)有內(nèi)含子。(A) Two bands, named band a and band b, can be amplified using muscle genome DNA as template. (B) The sequence of band a was identical to the genomic sequence ofMyoD1, including two introns and three exons. The sequence of band b was identical to the mRNA sequence ofMyoD1-like, containing only exons.)

(MyoD1-like基因與MyoD1基因序列存在19 bp的差異。There is a 19 bp-difference between MyoD1-like and MyoD1 gene.)

(MyoD1-like基因存在StuⅠ 的酶切位點(diǎn)，質(zhì)粒可以被切開(kāi)；而MyoD1基因不存在該酶切位點(diǎn)，不能被切開(kāi)。MyoD1-like gene which has StuⅠ restriction site can be cut by endonuclease; while MyoD1 gene which does not have StuⅠ restriction site cannot be cut by endonuclease.)

圖3 MyoD1基因在基因組中的擴(kuò)增及其結(jié)構(gòu)示意圖

274位為絲氨酸和丙氨酸；MyoD1-like氨基酸序列在64位和274位都為蘇氨酸。由于兩者氨基酸序列差距較小，我們選擇MyoD1-like氨基酸序列進(jìn)行多重序列比對(duì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析。由圖5多重序列比對(duì)結(jié)果顯示，許氏平鲉MyoD1-like與其他硬骨魚(yú)MyoD1氨基酸序列的一致性較高，與大黃魚(yú)同源性高達(dá)90%，與金頭鯛、半滑舌鰨和尼羅羅非魚(yú)的同源性分別為 89%、88%、87%。MyoD1-like包含保守的bHLH結(jié)構(gòu)域和HlixⅢ 結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，進(jìn)化樹(shù)分為兩大支，許氏平鲉MyoD1-like氨基酸序列先與其他硬骨魚(yú)的MyoD1聚類在一起，然后與哺乳、鳥(niǎo)類、兩棲和爬行類的MyoD1聚類為一支。說(shuō)明許氏平鲉MyoD1-like基因與其他硬骨魚(yú)MyoD1基因親緣關(guān)系較近。

2.4 許氏平鲉MyoD1s基因在成魚(yú)各組織、肌肉發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)量分析

2.4.1 成魚(yú)各組織、肌肉發(fā)育不同時(shí)期表達(dá)量分析 通過(guò)已有的引物不能區(qū)分開(kāi)MyoD1和MyoD1-like基因各自的表達(dá)情況，因此，圖6所示結(jié)果為兩者的混合。不同組織的表達(dá)分析結(jié)果表明，MyoD1s基因在各組織中均有表達(dá)，在肌肉中高表達(dá)，精巢和卵巢中表達(dá)量次之。MyoD1s基因在肌肉中的高表達(dá)，說(shuō)明它們?cè)诩∪獍l(fā)育調(diào)控過(guò)程中扮演了至關(guān)重要的角色。因此，我們進(jìn)一步分析了其在不同發(fā)育時(shí)期肌肉中的表達(dá)量。

不同發(fā)育時(shí)期肌肉的表達(dá)分析表明，MyoD1s基因在35～90天之間表達(dá)量都較低，在100天時(shí)表達(dá)量相對(duì)于前期顯著升高；100天到1齡表達(dá)量呈逐漸降低的趨勢(shì)；在1齡之后表達(dá)量又逐漸升高，3齡和4齡時(shí)表達(dá)量最高。

(第一個(gè)框代表的bHLH結(jié)構(gòu)域，第二個(gè)框代表HlixⅢ 結(jié)構(gòu)域。bHLH 和HlixⅢ 結(jié)構(gòu)域在許氏平鲉與其他物種之間相對(duì)保守。The first box represents the basis helix-loop-helix; The second box indicates the HelixⅢ domains. bHLH and HelixⅢ domains are conserved between Sebastes schlegeli and other species.)

圖5 許氏平鲉MyoD1-like蛋白和其他物種MyoD1蛋白構(gòu)建的鄰接系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4.2 MyoD1、MyoD1-like基因在雌雄魚(yú)肌肉中的表達(dá)比例 因MyoD1、MyoD1-like基因無(wú)法區(qū)分設(shè)計(jì)定量引物，本研究利用酶切的方式分析它們?cè)诔婶~(yú)肌肉中的表達(dá)比例。分別以成魚(yú)雌性、雄性肌肉cDNA為模板，PCR擴(kuò)增，連接，轉(zhuǎn)化，提取質(zhì)粒，酶切鑒別MyoD1和MyoD1-like基因的表達(dá)比例。MyoD1不能被StuⅠ 內(nèi)切酶切開(kāi)，而MyoD1-like可以被StuⅠ 內(nèi)切酶切開(kāi)。結(jié)果顯示，雌性中，在29個(gè)質(zhì)粒中有3個(gè)質(zhì)粒未被StuⅠ 內(nèi)切酶切開(kāi)(MyoD1)，26個(gè)質(zhì)粒被StuⅠ 內(nèi)切酶切開(kāi)(MyoD1-like)；雄性中，32個(gè)質(zhì)粒全被StuⅠ 內(nèi)切酶切開(kāi)(MyoD1-like)。以上結(jié)果說(shuō)明MyoD1-like是主要表達(dá)基因(見(jiàn)圖7)。

(①Heart；②Liver；③Spleen；④Kidney；⑤Brain；⑥Gill；⑦M(jìn)uscle；⑧Intestine；⑨Testis；⑩Ovary。(A)MyoD1s基因在成魚(yú)不同組織的表達(dá)模式。(B)MyoD1s基因在不同發(fā)育時(shí)期肌肉中的表達(dá)模式。數(shù)據(jù)顯示為平均值± SEM (n =3)。(A) Expression profiles of MyoD1s gene in different adult tissues. (B) Expression profiles of MyoD1s gene in muscle of different developmental stages. Data are shown as mean ± SEM (n =3).)

((A)、(B)通過(guò)StuⅠ 內(nèi)切酶分別檢測(cè)雌魚(yú)和雄魚(yú)肌肉中MyoD1和MyoD1-like基因的表達(dá)比例。方框表示不能被被切開(kāi)的基因(MyoD1)。每?jī)蓚€(gè)泳道為一組，單數(shù)泳道代表酶切前質(zhì)粒，偶數(shù)泳道代表酶切后質(zhì)粒。(A)、(B) The expression ratio of MyoD1 and MyoD1-like genes in female and male muscle was detected by StuⅠ endonuclease digestion. The box represents the band of MyoD1 that cannot be cut by endonuclease. Each two lanes are a group, singular lanes represent plasmids before digestion, and even lanes represent plasmids after digestion.)

2.5 許氏平鲉MyoD1s基因在肌肉發(fā)育不同時(shí)期的表達(dá)分布及比較

肌肉組織原位結(jié)果顯示，MyoD1s基因的表達(dá)位置是肌纖維的邊緣，位于肌纖維之間，即成肌細(xì)胞增殖、分化的位置。出生后100天肌肉組織中表達(dá)MyoD1s基因的細(xì)胞數(shù)目明顯多于180天肌肉組織，這說(shuō)明出生后100天肌肉的增殖分化能力要高于180天的肌肉(見(jiàn)圖8)。

2.6 許氏平鲉MyoD1-like基因的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)成肌細(xì)胞系C2C12的分化

由結(jié)果2.4可知，肌肉中MyoD1-like基因的表達(dá)量遠(yuǎn)高于MyoD1基因，因此我們構(gòu)建了MyoD1-like的真核表達(dá)質(zhì)粒，并將許氏平鲉MyoD1-like-pEGFP-N1真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至小鼠成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞中。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染后24 h，空白對(duì)照、陰性對(duì)照無(wú)熒光，pEGFP-N1空載質(zhì)粒組和實(shí)驗(yàn)組均有較強(qiáng)的熒光出現(xiàn)，說(shuō)明轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)成功。且在72 h時(shí)，轉(zhuǎn)染MyoD1-like-pEGFP-N1真核表達(dá)質(zhì)粒的細(xì)胞，發(fā)生了明顯分化，細(xì)胞融合形成了多核的肌管(見(jiàn)圖9)。以上結(jié)果表明，MyoD1-like基因的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)成肌細(xì)胞發(fā)生分化。

((A)～(C)和(D)～(F)分別代表MyoD1s在出生后100和180 d肌肉組織中的原位雜交結(jié)果。(B)和(E)分別為(A)和(D)中的放大框區(qū)域。箭頭為MyoD1s陽(yáng)性的細(xì)胞。相對(duì)于出生后180天的肌肉組織，100天的肌肉組織中有更多MyoD1s陽(yáng)性細(xì)胞。標(biāo)尺：(A、C、D、F)為50 μm，(B、E)為20 μm。(A)～(C) and (D)～(F) represent 100 dpb and 180 dpb samples respectively. (B) and (E) show magnification of boxed areas in (A) and (D) respectively. There are more MyoD1s positive cells noted by arrows in muscle of 100 dpb than in muscle of 180 dpb. Scale bar, 50 μm (A, C, D, F) and 20 μm (B, E).)

((A)、(A’)轉(zhuǎn)染后24 h，MyoD1-like-pEGFP-N1質(zhì)粒在細(xì)胞中表達(dá)；(B)空白對(duì)照組；(C)陰性對(duì)照組；(D)轉(zhuǎn)染pEGFP-N1空載質(zhì)粒；(E)轉(zhuǎn)染MyoD1-like-pEGFP-N1質(zhì)粒組。標(biāo)尺：100 μm。(A), (A’) Expression of MyoD1-like-pEGFP-N1 plasmid in cells at 24 h. (B) Control group. (C) Negative control group. (D) pEGFP-N1 empty plasmid group. (E) Treatment group. Scale bar, 100 μm.)

3 討論

3.1 許氏平鲉MyoD1基因的分子特征

本研究鑒定了許氏平鲉MyoD1基因兩個(gè)亞型，這與文昌魚(yú)(BranchiostomabelcheriGray)中含有兩個(gè)MyoD1基因相類似[26]。在許氏平鲉肌肉中，MyoD1-like基因占主導(dǎo)地位，這可能與啟動(dòng)子多態(tài)性及DNA甲基化相關(guān)[27-28]。此外，MyoD1的基因組含有完整的內(nèi)含子和外顯子序列，而MyoD1-like基因只含外顯子，因此也可能是基因結(jié)構(gòu)的不同造成了兩者轉(zhuǎn)錄效率的不同。許氏平鲉MyoD1-like氨基酸與其他魚(yú)類、哺乳動(dòng)物類似，有保守的氨基酸序列和bHLH、α螺旋(helixⅢ)結(jié)構(gòu)域。在哺乳動(dòng)物還是在魚(yú)類中，上述兩個(gè)結(jié)構(gòu)域均為MyoD1蛋白調(diào)節(jié)肌肉生長(zhǎng)的重要結(jié)構(gòu)[5-7]。此外，氨基酸肽鏈的長(zhǎng)度存在隨進(jìn)化地位升高而變長(zhǎng)趨勢(shì)[29-30]。不同魚(yú)類MyoD1氨基酸肽鏈的長(zhǎng)度也存在差異，其中，堿性區(qū)域的差異多于螺旋環(huán)區(qū)域[29]。系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)顯示，許氏平鲉的MyoD1-like與其他硬骨魚(yú)同源基因聚類為一支，說(shuō)明了許氏平鲉的MyoD1-like在進(jìn)化上相對(duì)保守，這也反映了不同物種的MyoD1基因在肌肉發(fā)育中的調(diào)控功能具有相似性[19]。

3.2 許氏平鲉MyoD1s基因的組織表達(dá)特征

在大多數(shù)魚(yú)類的各個(gè)組織中均存在MyoD1基因的表達(dá)，在肌肉中的表達(dá)顯著高于其他組織，如蘭州鲇魚(yú)(Silurusasotus)、團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)[17,19]。許氏平鲉MyoD1s基因同樣在各組織中都有表達(dá)，且肌肉組織的表達(dá)量顯著高于其他組織，說(shuō)明其在許氏平鲉肌肉發(fā)育調(diào)控過(guò)程中扮演了至關(guān)重要的角色。

魚(yú)類胚后的肌肉發(fā)育主要包括增生和肥大兩個(gè)過(guò)程，肌肉的增生和肥大受多種調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控[31-34]，其中生肌調(diào)節(jié)因子家族(Myogenic regulatory factors, MRFs)在肌纖維的形成和分化中扮演著非常重要的角色[35]。許氏平鲉在100天時(shí)，MyoD1s基因有一個(gè)高表達(dá)，這說(shuō)明此階段肌肉中的成肌細(xì)胞發(fā)生了顯著的增生[36]，這也與黃鱔[15]的研究結(jié)果相似。

3.3 許氏平鲉MyoD1s基因的空間表達(dá)特征

MyoD1基因是增殖的成肌細(xì)胞的標(biāo)記基因[37]。成肌細(xì)胞位于肌纖維的邊緣，在肌肉生長(zhǎng)或損傷修復(fù)過(guò)程中能夠自我更新和分化[37-38]。MyoD1基因在組織中的細(xì)胞定位研究主要集中在小鼠中[39-40]，魚(yú)類中研究較少。斑馬魚(yú)MyoD1基因的定位主要是在胚胎中進(jìn)行[22-23]。本研究證明許氏平鲉MyoD1s陽(yáng)性細(xì)胞的表達(dá)位置在肌纖維的邊緣，位于肌纖維之間，即成肌細(xì)胞增殖和分化的位置，這與小鼠肌肉中MyoD1陽(yáng)性細(xì)胞所在位置一致[5,39,41]。此外，出生后100天肌肉組織中表達(dá)MyoD1s基因的細(xì)胞數(shù)目明顯多于180天肌肉組織，說(shuō)明在出生后100天肌肉組織中有更多處于增殖分化狀態(tài)的成肌細(xì)胞。

3.4 許氏平鲉MyoD1-like基因的過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)成肌細(xì)胞系C2C12的分化

肌肉前體細(xì)胞的命運(yùn)決定和進(jìn)入肌細(xì)胞程序由基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)控制[42-43]。在不同的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，MRFs基因家族發(fā)揮了重要作用。作為MRFs基因家族的重要一員，MyoD1基因的表達(dá)量決定了成肌細(xì)胞的命運(yùn)[1]。MyoD1基因表達(dá)量的升高可以誘導(dǎo)肌肉前體細(xì)胞趨向分化。之前的研究中，將線鰭電鰻的MyoD1基因轉(zhuǎn)到MyoD1基因缺失的小鼠中，能夠誘導(dǎo)小鼠的胚胎細(xì)胞轉(zhuǎn)化為肌管。本研究中，過(guò)表達(dá)許氏平鲉MyoD1-like基因可誘導(dǎo)小鼠成肌細(xì)胞發(fā)生分化，融合形成肌管，這與山羊中MyoD1基因過(guò)表達(dá)可以調(diào)控成肌細(xì)胞分化融合為肌管的研究[44]相一致，這也進(jìn)一步說(shuō)明了MyoD1基因的功能在不同物種中具有高度的保守性。

4 結(jié)語(yǔ)

本研究鑒定了許氏平鲉MyoD1基因的兩個(gè)拷貝，分別命名為MyoD1和MyoD1-like。MyoD1s主要在肌肉中表達(dá)，且MyoD1-like的表達(dá)量要顯著高于MyoD1，表達(dá)效率顯著差異的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此外，MyoD1-like基因的過(guò)表達(dá)可以誘導(dǎo)成肌細(xì)胞分化，融合形成肌管，證明MyoD1基因功能在不同物種中具有高度的保守性。該結(jié)果為研究MyoD1基因在經(jīng)濟(jì)魚(yú)類肌肉生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的調(diào)控作用奠定了基礎(chǔ)。