曹艷，黃崇煌，黃承都，任仙娥，黃永春*

(1.廣西科技大學 生物與化學工程學院，廣西 柳州 545006;2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006)

殼聚糖(chitosan)是甲殼素(chitin)脫乙?；a(chǎn)物，具有無毒無害、生物相容性好、抗菌抑菌和抗氧化性良好等優(yōu)點，在食品加工、環(huán)境保護、生物醫(yī)藥、化工等諸多領域有著廣泛的應用前景[1-3]。低聚殼聚糖是殼聚糖的降解產(chǎn)物，相比高分子量的殼聚糖具有更好的溶解性和優(yōu)越的功能特性，例如：低分子量的殼聚糖更易被人體吸收而廣泛用于食品添加劑和保健品行業(yè)[4]，另外，相對分子量低的殼聚糖具有更優(yōu)的抗菌和抗氧化性能而在食品保鮮領域中發(fā)揮著重要作用[5]。由此可見，低聚殼聚糖的制備十分關鍵，而殼聚糖的降解是獲得低聚殼聚糖的一種有效途徑。

水力空化是一種應用廣泛的綠色新技術[6-7]，具有操作簡單、成本低、能耗低等優(yōu)點，近年來廣泛用于殼聚糖的降解研究[8-9]。水力空化對殼聚糖的降解作用主要源于“空化效應”產(chǎn)生的物理(機械剪切)效應及化學(自由基)效應。朱新鋒等[10]發(fā)現(xiàn)剪切效應主要是引起β-(1,4)-糖苷鍵發(fā)生斷裂，增大剪切力有利于該鍵的斷裂。Yan等[11]對水力空化降解殼聚糖的機理進行了研究，指出自由基化學效應是隨機切割糖苷鍵，且是引起殼聚糖降解的主要因素。因此，增強任何一種效應都會對殼聚糖的降解過程起到強化作用。

本課題組的前期研究表明[12]，水力空化能夠促進殼聚糖的有效降解，但降解速率較慢。楊鋒等[13]研究了不同氣體對渦流空化降解殼聚糖的影響，結(jié)果表明空氣對渦流空化降解殼聚糖有明顯的促進作用。本文嘗試通過在微型文丘里管內(nèi)引入空氣氣流來增強空化的物理及化學效應，探究殼聚糖降解過程的強化機制，尋求一種能夠?qū)崿F(xiàn)殼聚糖高效降解的新途徑。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

殼聚糖(工業(yè)級，脫乙酰度90%)：深圳中發(fā)源生物科技有限公司；冰乙酸和三水合乙酸鈉：均為分析純，西隴科學股份有限公司。

1.2 主要儀器與設備

微型空化器 自制；WT300-1JB微型齒輪泵 蘭格恒流泵有限公司；BT100S蠕動泵 保定雷弗流體科技有限公司；PHS-3E型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司；烏氏黏度計(0.58 mm) 合肥申誼玻璃制品有限公司；HSVision EoSens Cube 7高速相機 德國HSVision公司；Nicolet 6700紅外光譜儀 美國Thermo Fisher公司。

1.3 實驗裝置及原理

本研究采用的實驗裝置示意圖見圖1。

圖1 實驗裝置示意圖Fig.1 The schematic diagram of experimental devices注：1為恒溫水浴鍋；2為燒杯；3和4為齒輪泵；5為空化器；6為蠕動泵；7為高速相機；8為電腦；9為光源；10和11為壓力表。

采用T型進料的方式，兩股殼聚糖溶液分別經(jīng)微型齒輪泵輸送，通過蠕動泵引入一定量的空氣進入溶液，兩股氣-液混合流體在T型入口端碰撞混合成一股流體進入微型文丘里管的空化段，發(fā)生空化，空化流體(含有大量空化泡的氣-液兩相混合流體)形成并在壓力恢復段發(fā)生空化泡的潰滅，殼聚糖發(fā)生降解，降解后的溶液回收至原燒杯中，進行循環(huán)降解。

本實驗的空化發(fā)生器選取文丘里管，其結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。兩個入口端的直徑均是5 mm，出口端的直徑是6 mm；文丘里管的入口錐角是30°，出口錐角是21°；喉部直徑是0.5 mm，喉部長1.5 mm。

圖2 水力空化器的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.2 The schematic diagram of hydraulic cavitator注：圖中標注尺寸的單位為mm。

在流體輸送穩(wěn)定后，采用CCD高速相機觀測和記錄氣-液兩相流體流經(jīng)空化段時的流動狀態(tài)，結(jié)果見圖3。

圖3 氣-液兩相流體流經(jīng)空化段時的流動狀態(tài)圖Fig.3 The flow state diagram of gas-liquid two-phase fluid flowing through cavitation section

由圖3可知，當引入的空氣泡通過喉部到擴徑段時，因壓力的減小，瞬間被撕裂形成大量微小的空氣泡，當氣泡完全通過喉部時，產(chǎn)生的氣泡群范圍最大，流體湍動也最劇烈。

1.4 方法

1.4.1 實驗方法

以乙酸-乙酸鈉緩沖溶液為溶劑，殼聚糖為溶質(zhì)，配制一定濃度的殼聚糖溶液。取150 mL殼聚糖溶液在反應溫度下預熱30 min后，同時開啟兩個齒輪泵輸送流體，然后開啟蠕動泵輸入一定量的空氣，通過調(diào)節(jié)齒輪泵的轉(zhuǎn)速來控制入口壓力的大小，在設定條件下反應一段時間后，測定殼聚糖原溶液及降解產(chǎn)物的特性黏度，探究不同因素對殼聚糖降解效果的影響。實驗分別選取蠕動泵轉(zhuǎn)速為30，60，90，120，150 r/min；入口壓力為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 MPa；降解溫度為30，40，50，60，70 ℃；降解時間為10，30，50，70，90 min；殼聚糖原溶液濃度為0.1，0.3，0.5，0.7，0.9 g/L；殼聚糖分子量為100，500，1000，2000，5000 kDa；溶液pH為2.6，3.8，4.2，4.6，5.0。

1.4.2 特性黏度下降率的計算

以特性黏度下降率(η)來反映殼聚糖的降解效果，計算公式如下：

式中：[η]0、[η]1分別表示殼聚糖降解前、后溶液的特性黏度，mL/g。其中特性黏度[14]的定義如下：

式中：ηsp(ηsp=ηr-1)為增比黏度，表示高分子溶液黏度大于溶劑黏度的相對增量，ηr為相對黏度，是用同一支黏度計測定的殼聚糖溶液流出時間(t)與純?nèi)軇┝鞒鰰r間(t＇)的比值，計算公式如下：

1.4.3 黏均分子量的計算[15]

殼聚糖的黏均分子量(Mη)可根據(jù)Mark-Houwink方程來確定，計算公式如下：

式中：K(K=1.635×10-30×DD14)為經(jīng)驗常數(shù)，cm3/g，其中DD為殼聚糖的脫乙酰度；Mη為黏均分子量，kDa；α為經(jīng)驗常數(shù)，計算式為α=-1.02×10-2×DD+1.82；[η]為特性黏度，mL/g。

1.4.4 紅外光譜測定[16]

采用KBr壓片法制備殼聚糖固體樣品，在波數(shù)為400～4000 cm-1范圍內(nèi)對殼聚糖原料及降解產(chǎn)物的樣品進行紅外光譜分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對殼聚糖降解效果的影響

2.1.1 蠕動泵轉(zhuǎn)速的影響

空氣通過蠕動泵輸送，不同蠕動泵轉(zhuǎn)速對殼聚糖降解效果的影響在一定程度上反映了不同氣流量對殼聚糖降解效果的影響。本實驗選取的條件為：入口壓力0.4 MPa，溫度40 ℃，降解時間50 min，殼聚糖溶液濃度0.3 g/L，分子量1000 kDa，溶液pH 4.6，在不同蠕動泵轉(zhuǎn)速下進行實驗，考察蠕動泵轉(zhuǎn)速對殼聚糖降解效果的影響，結(jié)果見圖4。

圖4 蠕動泵轉(zhuǎn)速對殼聚糖特性黏度下降率的影響Fig.4 The effect of rotating speed of peristaltic pump on the reduction rate of characteristic viscosity of chitosan

由圖4可知，當蠕動泵轉(zhuǎn)速從30 r/min增大到150 r/min時，殼聚糖的特性黏度下降率先增大后略有降低，當蠕動泵轉(zhuǎn)速為120 r/min時的特性黏度下降率最大。這是因為蠕動泵轉(zhuǎn)速越大，輸入體系的空氣量越大，形成的空氣泡越多。當空氣泡通過文丘里管的空化段時，因壓力變化促使空氣泡瞬間產(chǎn)生大量的微小氣泡(見圖3)，增加了溶液中空化核的數(shù)量，此時會有更多的水蒸氣進入空化泡中，空化泡潰滅產(chǎn)生的瞬時高溫、高壓會促使水分子分解產(chǎn)生更多的羥自由基，強化了空化的化學效應[17-18]。同時，引入的空氣量越大，空氣泡通過喉部到擴徑段處引起的流場擾動越大，流體間的機械剪切作用力增大，促進了殼聚糖的降解。但當蠕動泵轉(zhuǎn)速增大到一定程度時，引入的空氣量過大，會阻礙殼聚糖溶液的流動，一定時間內(nèi)殼聚糖溶液的循環(huán)量和循環(huán)次數(shù)減少，從而使殼聚糖的特性黏度下降率略有降低。為了能在高效范圍內(nèi)進行殼聚糖的降解研究，本實驗選擇蠕動泵轉(zhuǎn)速為120 r/min。

2.1.2 入口壓力的影響

本實驗選取的條件為：蠕動泵轉(zhuǎn)速120 r/min，溫度40 ℃，降解時間50 min，殼聚糖溶液濃度0.3 g/L，分子量1000 kDa，溶液pH 4.6，在不同入口壓力條件下進行實驗，考察入口壓力對殼聚糖降解效果的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 入口壓力對殼聚糖特性黏度下降率的影響Fig.5 The effect of inlet pressure on the reduction rate of characteristic viscosity of chitosan

由圖5可知，隨著入口壓力的增大，引入氣流和不引入氣流兩種條件下的殼聚糖特性黏度下降率均逐漸增大，且引入氣流條件下的特性黏度下降率高于不引入氣流條件下的特性黏度下降率。這是因為入口壓力越大，流體的流動速度越大，空化數(shù)(Cv)越小，空化數(shù)是反映空化過程強弱的無因此準數(shù)，空化數(shù)越小表示空化效果越好[19]。在相同的壓力下，引入氣流會增加溶液中空化核的數(shù)量，空化泡數(shù)量增加，空化泡潰滅幾率增大，從而增強空化效應?？紤]到入口壓力越大，對管路的耐壓和密封性能要求更高，安全性能降低且能耗增大，因此，本實驗選擇在0.4 MPa壓力條件下進行其他單因素實驗。

2.1.3 溶液溫度的影響

本實驗選取的條件為：蠕動泵轉(zhuǎn)速120 r/min，入口壓力0.4 MPa，降解時間50 min，殼聚糖溶液濃度0.3 g/L，分子量1000 kDa，溶液pH 4.6，在不同溫度下進行實驗，考察溫度對殼聚糖降解效果的影響，結(jié)果見圖6。

圖6 溫度對殼聚糖特性黏度下降率的影響Fig.6 The effect of temperature on the reduction rate of characteristic viscosity of chitosan

由圖6可知，殼聚糖的特性黏度下降率受溫度的影響較大，當溫度從30 ℃增大到70 ℃時，引入氣流條件下的特性黏度下降率從7.75%增大到26.73%，不引入氣流條件下的特性黏度下降率從6.41%增大到23.69%?？梢詮囊韵聨讉€方面來分析：(1)溫度越高，液體的飽和蒸氣壓越大，空化數(shù)越小，空化更易發(fā)生；(2)隨著溫度的升高，溶液的黏度降低，空化泡更易生長和發(fā)生潰滅；(3)溫度的升高會使得溶液中的氫鍵和鹽鍵發(fā)生斷裂，位阻減小，從而使得糖苷鍵更易發(fā)生斷裂[20]；(4)氣流的引入增加了溶液中的空化核，提高了發(fā)生空化的幾率。綜上所述，溫度越高越有利于殼聚糖的降解，但從節(jié)能降耗的角度考慮，溫度不宜過高，本實驗選擇降解溫度為40 ℃來進行其他單因素實驗。

2.1.4 降解時間的影響

本實驗選取的條件為：蠕動泵轉(zhuǎn)速120 r/min，入口壓力0.4 MPa，溫度40 ℃，殼聚糖溶液濃度0.3 g/L，分子量1000 kDa，溶液pH 4.6，控制殼聚糖降解不同的時間，考察時間對殼聚糖降解效果的影響，結(jié)果見圖7。

圖7 時間對殼聚糖特性黏度下降率的影響Fig.7 The effect of time on the reduction rate of characteristic viscosity of chitosan

由圖7可知，隨著降解時間的延長，引入氣流和不引入氣流兩種條件下殼聚糖的特性黏度下降率均呈明顯的上升趨勢。當降解時間從10 min延長到90 min時，引入氣流時的特性黏度下降率從4.72%增大到21.53%，不引入氣流時的特性黏度下降率從2.41%增大到10.84%，分別增大了3.56倍和3.50倍，增幅都較大，說明時間對殼聚糖的降解過程有明顯的影響，時間越長，糖苷鍵被作用的次數(shù)越多，更易發(fā)生斷裂，殼聚糖的降解效果越好。另外，當時間分別為10 min和90 min時，引入氣流較不引入氣流時的特性黏度下降率分別提高了0.96倍和0.99倍，說明引入氣流對殼聚糖的降解有明顯的促進作用。

2.1.5 殼聚糖溶液濃度的影響

本實驗選取的條件為：蠕動泵轉(zhuǎn)速120 r/min，入口壓力0.4 MPa，溫度40 ℃，降解時間50 min，分子量1000 kDa，溶液pH 4.6，在不同殼聚糖溶液濃度下進行實驗，考察濃度對殼聚糖降解效果的影響，結(jié)果見圖8。

圖8 濃度對殼聚糖特性黏度下降率的影響Fig.8 The effect of concentration on the reduction rate of characteristic viscosity of chitosan

由圖8可知，引入氣流和不引入氣流兩種條件下的特性黏度下降率均隨殼聚糖溶液濃度的增大而降低，且引入氣流條件下的特性黏度下降率下降得更快。這是因為殼聚糖的降解是化學效應和物理(機械剪切)效應共同作用的結(jié)果，一方面，隨著濃度的增大，溶液的黏度增大，表面張力增大，空化泡的生長和潰滅受到抑制，減少了空化自由基的產(chǎn)生，在一定程度上削弱了空化化學效應；另一方面，溶液黏度的增大會削弱流體間的機械剪切作用，導致受機械剪切作用而發(fā)生斷裂的殼聚糖數(shù)量減少，從而削弱空化機械效應[21]。因此，溶液黏度的增大不利于殼聚糖的降解。另外，溶液黏度會對氣流引入產(chǎn)生影響，溶液黏度越大，氣流引入的阻力越大，進氣量減少，從而減少空化核的產(chǎn)生數(shù)量，削弱了空化效應，所以會出現(xiàn)在引入氣流條件下的特性黏度下降率下降得更快。

2.1.6 殼聚糖分子量的影響

本實驗選取的條件為：蠕動泵轉(zhuǎn)速120 r/min，入口壓力0.4 MPa，溫度40 ℃，降解時間50 min，殼聚糖溶液濃度0.3 g/L，溶液pH 4.6，在不同殼聚糖分子量條件下進行實驗，考察分子量對殼聚糖降解效果的影響，結(jié)果見圖9。

圖9 分子量對殼聚糖特性黏度下降率的影響Fig.9 The effect of molecular weight on the reduction rate of characteristic viscosity of chitosan

由圖9可知，當殼聚糖分子量從100 kDa增大至5000 kDa時，引入氣流和不引入氣流兩種條件下的特性黏度下降率均增大，且前者較后者的特性黏度下降率增大的趨勢更強。這是由于隨著殼聚糖分子量的增大，溶液的黏度增大，空化泡的生長和潰滅受到抑制，削弱了空化的化學效應，但是分子量越大，殼聚糖的分子鏈越長，更容易發(fā)生鏈的斷裂，即使因黏度增大而有所削弱的空化效應也能促進長鏈殼聚糖的有效降解。另一方面，殼聚糖的分子鏈越長，越容易受到機械剪切力作用而發(fā)生斷裂，所以會出現(xiàn)殼聚糖的特性黏度下降率隨分子量增大而增大的現(xiàn)象。當有氣流引入時，一方面可產(chǎn)生更多的空化核，強化空化的化學效應；另一方面，空化泡潰滅產(chǎn)生瞬時高溫、高壓及強烈的沖擊波和微射流，使流場發(fā)生擾動，在微尺度的受限空間內(nèi)，流體的湍動更為劇烈，大大增強了機械剪切效應。空化的化學和機械效應都對高分子量的長鏈殼聚糖作用更強[22]，所以會出現(xiàn)有氣流引入時的殼聚糖特性黏度下降率受分子量影響更大的現(xiàn)象。

2.1.7 pH的影響

本實驗選取的條件為：蠕動泵轉(zhuǎn)速120 r/min，入口壓力0.4 MPa，溫度40 ℃，降解時間50 min，殼聚糖溶液濃度0.3 g/L，分子量1000 kDa，在不同溶液pH下進行實驗，考察pH對殼聚糖降解效果的影響，結(jié)果見圖10。

圖10 pH對殼聚糖特性黏度下降率的影響Fig.10 The effect of pH on the reduction rate of characteristic viscosity of chitosan

由圖10可知，溶液pH對殼聚糖的降解有一定影響。隨著pH的增大，殼聚糖的特性黏度下降率出現(xiàn)先略減小再增大然后又下降的趨勢。分析其原因可知，殼聚糖降解首先是酸催化反應，當pH較低(pH為2.6～3.8)時，酸催化反應起主導作用，溶液pH減小有利于殼聚糖的溶解和降解。當pH較高(pH為4.2～5.0)時，溶液的酸性條件較弱，不利于殼聚糖的溶解和降解，而且較高的pH會抑制自由基的生成，從而削弱空化效應。當pH從3.8增大到4.2時，溶液中陰離子濃度隨H+濃度的減少而減少，形成的鹽鍵減少，使得糖苷鍵斷裂的位阻減小，從而提高了殼聚糖的降解速率。

2.2 黏均分子量分析

以濃度(c)為橫坐標，增比黏度與濃度的比值(ηsp/c)為縱坐標作圖，采用外推法[23]獲得了殼聚糖原料及其降解產(chǎn)物的黏均分子量，見圖11。

圖11 c與ηsp/c的關系圖Fig.11 The relationship diagram between c and ηsp/c

直線的截距(濃度c為0 g/mL處的數(shù)據(jù))即為特性黏度數(shù)。由圖11可知，殼聚糖原料、不加氣降解產(chǎn)物及加氣降解產(chǎn)物的特性黏度分別為667.39，590.06，560.62 mL/g。根據(jù)Mark-Houwink方程計算得出殼聚糖原料、不加氣及加氣降解產(chǎn)物的黏均分子量分別是663.8，579.1，547.1 kDa，說明水力空化能有效降解殼聚糖。加氣相比不加氣條件下殼聚糖降解產(chǎn)物的黏均分子量下降了5.5%，說明引入氣流能夠進一步促進殼聚糖的降解。

2.3 紅外光譜分析

課題組前期研究結(jié)果表明，水力空化條件下殼聚糖降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)未發(fā)生變化。故本研究只對有氣流引入條件下殼聚糖原料及其降解產(chǎn)物進行了紅外光譜分析，實驗結(jié)果見圖12。

圖12 殼聚糖降解前后的紅外吸收光譜圖Fig.12 The infrared absorption spectra of chitosan before and after degradation

由圖12可知，殼聚糖原料及其降解產(chǎn)物的特征吸收峰的位置基本沒有發(fā)生變化。殼聚糖的特征吸收峰有酰胺Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ譜帶特征吸收峰[24]、環(huán)伸縮振動的特征吸收峰和殼聚糖主鏈環(huán)狀結(jié)構(gòu)上的C-H伸縮振動吸收峰。殼聚糖原料的這些特征吸收峰分別位于1637，1597，1321，897，2927 cm-1處，而殼聚糖降解產(chǎn)物的這些特征吸收峰分別位于1643，1599，1319，901，2927 cm-1處。由此可見，這些特征吸收峰的位置基本未發(fā)生變化，說明降解過程中殼聚糖分子的酰胺結(jié)構(gòu)和環(huán)狀結(jié)構(gòu)均沒有被破壞。綜上分析可知，引入氣流強化殼聚糖的降解仍然是β-(1,4)-糖苷鍵斷裂引起的，不會引起殼聚糖基本結(jié)構(gòu)的變化，也進一步說明β-(1,4)-糖苷鍵是殼聚糖中最薄弱的化學鍵[25]，只要能促進該化學鍵的斷裂即可強化殼聚糖的降解過程。

3 結(jié)論

本文探究了氣流引入對殼聚糖降解過程的影響規(guī)律。研究結(jié)果表明，適宜的氣流(當蠕動泵轉(zhuǎn)速為120 r/min)能夠較好地促進殼聚糖的降解；入口壓力的增大、溶液溫度的升高、降解時間的延長、溶液濃度的減小或選用分子量大的殼聚糖原料都有利于促進殼聚糖的降解；溶液pH對殼聚糖的影響較為復雜，當pH為4.2時的降解效果最好。上述實驗均表明，有氣流引入相比無氣流引入時的殼聚糖降解效果更好。當蠕動泵轉(zhuǎn)速為120 r/min，殼聚糖原溶液濃度為0.3 g/L，分子量為1000 kDa，pH為4.6，溫度為70 ℃，入口壓力為0.4 MPa，降解時間為50 min時，殼聚糖的降解效果最明顯，特性黏度下降率為26.72%，同等條件下無氣流引入時的特性黏度下降率為23.69%。黏均分子量和紅外光譜的分析結(jié)果表明，引入氣流能夠進一步強化殼聚糖的降解，且氣流的引入不會改變殼聚糖降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)。本文為低聚殼聚糖的制備及其在食品領域的應用提供了參考依據(jù)。