賈波，楊宙，喻廣力，呂運(yùn)成，彭田紅

1.南華大學(xué)衡陽醫(yī)學(xué)院應(yīng)用解剖與生殖研究所，湖南 衡陽 421001；2.桂林醫(yī)學(xué)院廣西糖尿病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林 541001

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種慢性血管炎性病理過程，世界范圍內(nèi)與其相關(guān)的心腦血管疾病發(fā)病率居首位[1,2]。巨噬細(xì)胞是AS損害過程中最為重要和豐富的免疫細(xì)胞，泡沫細(xì)胞形成是AS的標(biāo)志性病理表現(xiàn)[3,4]。甲基轉(zhuǎn)移酶3（methyltransferaselike 3，METTL3）作為重要的N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine modification，m6A）修飾的寫入蛋白，催化反應(yīng)性甲基化合物中的甲基基團(tuán)并轉(zhuǎn)移到其第6個(gè)位置N原子上形成m6A修飾[5]，進(jìn)而影響底物RNA的穩(wěn)定性、剪接、轉(zhuǎn)運(yùn)、定位和翻譯[6,7]。研究證實(shí)，METTL3催化的m6A修飾通過調(diào)控脂代謝相關(guān)基因表達(dá)影響胞內(nèi)脂質(zhì)含量：METTL3修飾可上調(diào)硬脂酰輔酶a去飽和酶1（SCD-1）mRNA水平，促進(jìn)脂質(zhì)合成，從而升高肝脂質(zhì)水平[8]。SPRING1是一種新型的脂質(zhì)生成調(diào)節(jié)因子，有文獻(xiàn)報(bào)道，SPRING1通過調(diào)節(jié)SREBPs表達(dá)，加速細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的合成及攝取，促進(jìn)肝細(xì)胞的脂質(zhì)蓄積[9,10]。但目前對SPRING1表達(dá)的調(diào)控研究鮮有報(bào)道。鑒于m6A修飾可廣泛影響脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)，而SPRING1是調(diào)控脂質(zhì)代謝的重要因子，與肝細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)水平密切相關(guān)，因而探討METTL3是否可以調(diào)控SPRING1表達(dá)則顯得十分必要。本研究探討METTL3對SPRING1的調(diào)控作用及機(jī)制，觀察其通過SPRING1對THP-1細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響，以期為揭示METTL3介導(dǎo)的甲基化影響巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的作用及潛在機(jī)制提供新的研究思路，為維持巨噬細(xì)胞膽固醇平衡和抗動(dòng)脈粥樣硬化的治療策略提供以METTL3為靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與處理

THP-1細(xì)胞購自美國模式菌種收集中心ATCC。復(fù)蘇細(xì)胞后，于超凈臺(tái)中配置好完全培養(yǎng)基（胎牛血清：RPMI-1640培養(yǎng)基＝1：9），將細(xì)胞接種于完全培養(yǎng)基中。然后置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每次實(shí)驗(yàn)處理前用160 nmol/L佛波酯（phorbol12-myristate13-acetate，PMA，購自Sigma公司）孵育24 h誘導(dǎo)其分化為貼壁的巨噬細(xì)胞。

1.2 研究方法

1.2.1 Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞并提取蛋白，BCA測定蛋白濃度并配平后，根據(jù)目的蛋白的分子量，選擇配置適宜濃度的分離膠。恒壓80 V電泳30 min后轉(zhuǎn)恒壓120 V電泳60 min。根據(jù)檢測的目的蛋白的分子量，對比彩色蛋白預(yù)染分子量marker選擇相應(yīng)的切膠區(qū)域；裁剪尺寸適合的PVDF膜（膜預(yù)先用無水甲醇激活至少15 s）；按照由下到上：海綿濾紙、PVDF膜、膠、海綿濾紙的順序擺放整齊；恒壓13 V、45 min，半干轉(zhuǎn)。轉(zhuǎn)膜完成后用封閉液封閉15 min后，METTL3（2000：1）或SPRING1（2000：1）抗體孵育，置于搖床上，4℃孵育過夜。隨后TBST漂洗5 min×3次，室溫?fù)u床孵育羊抗兔IgG（5000：1）抗體2 h。TBST溶液洗膜5 min×3次。提前將ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑A、B液按1：1配制成ECL工作液。PVDF膜蛋白面向上，將ECL工作液涂抹于PVDF膜上，Tanon MP凝膠成像系統(tǒng)顯影分析。用Image J軟件分析灰度值，結(jié)果所示的光密度值與內(nèi)參β-tubulin對比并進(jìn)行半定量分析。

1.2.2 脂質(zhì)攝取實(shí)驗(yàn) 將THP-I細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板內(nèi)進(jìn)行爬片，經(jīng)160 ng/mL PMA誘導(dǎo)細(xì)胞貼壁后，換不含血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h；種板細(xì)胞用高壓蒸汽滅菌過的PBS浸洗2次后，換無血清培養(yǎng)基。同時(shí)，加入細(xì)胞膜紅色熒光標(biāo)記探針LDL（DiI-Ac-LDL），確保DiI-Ac-LDL的培養(yǎng)濃度為25μg/mL；于細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，棄去培養(yǎng)基，再用滅菌后的PBS洗3遍，以清除殘留的DiI-Ac-LDL（此步驟需注意避光操作）。然后，用4%的多聚甲醛固定20 min，PBS洗3次，以清除殘留多聚甲醛。最后用含DAPI染色液的抗熒光淬滅封片劑進(jìn)行封片15～30 min，并用熒光顯微鏡觀察采集圖像。

1.2.3 qRT-PCR檢測mRNA水平 根據(jù)所購試劑說明書提取細(xì)胞總RNA（注意保持實(shí)驗(yàn)溫度，避免RNA降解）。然后用試劑盒測其濃度和純度，并篩選處于光密度值260～280 OD范圍（比值1.8～2.2）的樣本，用于合成反轉(zhuǎn)錄互補(bǔ)DNA。實(shí)驗(yàn)所用引物，均由Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)，隨后交由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司進(jìn)行合成：SPRING1正引物：5’-ACTTGGGCAATAGCAGTCGTC-3’；SPRING1反 引物：5’-GCAAACGTAGCCGAGTTCAT-3’。使 用TaKaRa RT-PCR試劑盒，在實(shí)時(shí)定量PCR儀（購自美國BioRAD公司）中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，95℃作用3 min后，采用3步法PCR如下：變性，95℃30 s；退火，58℃30 s；延伸，72℃30 s，共35個(gè)循環(huán)。溶解曲線：95℃0 s變溫速度20℃/s，55℃15 s變溫速度20℃/s，95℃0 s變溫速度0.1℃/s。根據(jù)溶解曲線和所有結(jié)果，使用比較循環(huán)閾值（CT）（2-ΔΔCt）方法定量RNA的相對量，tubulin用作內(nèi)部對照。

1.2.4 高效液相色譜分析 收集各處理組細(xì)胞，加入裂解液裂解后，用BCA試劑盒檢測其總蛋白濃度。然后，加入15%氫氧化鉀溶液，震蕩器混勻，再加入三氯乙酸用以沉淀蛋白質(zhì)，取上清備用。采用C18色譜柱和C18保護(hù)柱測定樣本總膽固醇（total cholesterol，TC），膽固醇酯（cholesterol ester，CE）和游離膽固醇（free cholesterol，F(xiàn)C，加入氧化酶后產(chǎn)生），并保存結(jié)果，以蛋白內(nèi)參校準(zhǔn)，統(tǒng)計(jì)峰面積，最后計(jì)算膽固醇酯與總膽固醇比值。

1.2.5 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 METTL3慢病毒載體（LVMETTL3）和METTL3的shRNA序列（LV-shMETTL3）由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司構(gòu)建并進(jìn)行純化。按照說明書，向脂質(zhì)孵育THP-1細(xì)胞（1×106個(gè)細(xì)胞/孔）轉(zhuǎn)染相應(yīng)慢病毒載體24 h，并保持病毒的最佳滴度。轉(zhuǎn)染24 h后換液（時(shí)間可延長至48 h），檢測轉(zhuǎn)染效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6 生物信息學(xué)分析 在NCBI數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）輸入SPRING1基因名，查找下載其全長FASTA序列（人和鼠）；在SRAMP數(shù)據(jù)庫（http://www.cuilab.cn/sramp/）輸入SPRING1（人和鼠）全長FASTA序列，用以預(yù)測全長轉(zhuǎn)錄本序列中m6A位點(diǎn)；在 RMBase數(shù)據(jù)庫(http://rna.sysu.edu.cn/rmbase/）輸入SPRING1基因名，預(yù)測全長轉(zhuǎn)錄本序列中m6A位點(diǎn)，相關(guān)的甲基化酶及識(shí)別酶。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 脂質(zhì)孵育的巨噬細(xì)胞中METTL3和SPRING1的表達(dá)上調(diào)

2.1.1 脂質(zhì)孵育巨噬細(xì)胞并觀察METTL3和SPRING1表達(dá) 為探究METTL3和SPRING1在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)情況，用蛋白質(zhì)免疫印跡檢測蛋白水平，qPCR檢測mRNA水平。結(jié)果顯示，與對照組相比，Ac-LDL孵育巨噬細(xì)胞后，METTL3蛋白水平顯著上調(diào)，SPRING1 mRNA和蛋白水平明顯升高（圖1）。以上結(jié)果提示，脂質(zhì)孵育巨噬細(xì)胞中METTL3和SPRING1的表達(dá)上調(diào)。

圖1 50μg/ml Ac-LDL處理巨噬細(xì)胞后METTL3及SPRING1表達(dá)的變化（*P＜0.05，與對照組比較）A：Ac-LDL孵育的巨噬細(xì)胞中，METTL3蛋白水平較正常組顯著上調(diào) B、C：Ac-LDL孵育的巨噬細(xì)胞中，SPRING1 mRNA和蛋白水平較正常組顯著上調(diào)Fig.1 Changes in the expression of METTL3 and SPRING1 after treatment of macrophages with 50μg/ml Ac-LDL（*:P＜0.05 vs Control group）A:METTL3 protein level significantly upregulated compared with the normal group in Ac-LDL incubated macrophages;B,C:SPRING1 mRNA and protein levels significantly upregulated compared with thenormal group in Ac-LDL incubated macrophages

2.1.2 構(gòu)建脂質(zhì)孵育巨噬細(xì)胞METTL3高表達(dá)及低表達(dá)模型 為探究THP-1細(xì)胞中METTL3和SPRING1的關(guān)系，構(gòu)建脂質(zhì)孵育巨噬細(xì)胞METTL3高表達(dá)及低表達(dá)模型并觀察SPRING1表達(dá)。首先檢測轉(zhuǎn)染效率，顯示轉(zhuǎn)染成功；進(jìn)一步檢測SPRING1表達(dá)情況，結(jié)果顯示，高表達(dá)METTL3后，SPRING1的蛋白水平明顯上調(diào)，沉默METTL3后SPRING1蛋白水平明顯降低（圖2）。以上結(jié)果說明，METTL3上調(diào)控巨噬細(xì)胞SPRING1蛋白表達(dá)。

圖2 脂質(zhì)孵育巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-METTL3及LV-shMETTL3構(gòu)建METTL3高表達(dá)及低表達(dá)模型（*P＜0.01，與LV-對照組比較）A：干預(yù)METTL3表達(dá)，檢測其蛋白水平 B：干預(yù)METTL3表達(dá)檢測SPRING1表達(dá)變化Fig.2 Lipid-incubated macrophages were transfected with LV-METTL3 and LVshMETTL3 to construct high and low METTL3 expression models(*:P＜0.01 vs LV-Control)A:Protein level was detected after intervening in the METTL3 expression;B:Changes of SPRING1 expression was detected after intervening in the METTL3 expression

2.2 抑制甲基化水平會(huì)降低SPRING1表達(dá)

2.2.1 環(huán)亮氨酸抑制SPRING1表達(dá) 由于METTL3是甲基化重要的催化酶，因而其對SPRING1調(diào)控可能是通過m6A修飾進(jìn)行。使用m6A抑制劑環(huán)亮氨酸（Cycloleucine，CL）處理脂質(zhì)孵育巨噬細(xì)胞，觀察SPRING1的表達(dá)。結(jié)果顯示，與LV-METTL3組相比，加入CL并不影響METTL3的表達(dá)；但是，加入CL會(huì)抑制由過表達(dá)METTL3所致的SPRING1升高（圖3）。以上結(jié)果說明，METTL3可能通過m6A修飾上調(diào)巨噬細(xì)胞SPRING1水平。

圖3 脂質(zhì)孵育巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV-METTL3及環(huán)亮氨酸CL處理（*P＜0.01，與LV-對照組比較#P＜0.05，與LV-METTL3組比較A：過表達(dá)METTL3并用CL抑制甲基化，檢測METTL3蛋白水平B：過表達(dá)METTL3并用CL抑制甲基化，檢測SPRING1蛋白水平Fig.3 Lipid-incubated macrophages were transfected with LV-METTL3 and treated with cycloleucine CL(*:P＜0.01 vs LV-Control group;#:P＜0.05 vs LV-METTL3 group）A:METTL3 protein level was detected after overexpression of METTL3 and adding CL;B:SPRING1 protein level was detected after overexpression of METTL3 and adding CL

2.2.2 SPRING1 mRNA有m6A修飾位點(diǎn) 使用生物信息學(xué)軟件分析人和鼠SPRING1 mRNA序列，以檢測是否有m6A修飾位點(diǎn)。生信網(wǎng)站NCBI、SRAMP和RMBase數(shù)據(jù)庫查找并分析SPRING1 mRNA序列，結(jié)果顯示，SPRING1 mRNA具有m6A修飾的共有序列“GGACU”、“GAACU”及“GGACC”（表1）。以上結(jié)果進(jìn)一步說明，METTL3通過m6A修飾上調(diào)巨噬細(xì)胞SPRING1水平。

表1 SRAMP分析人和鼠SPRING1-mRNA-m6A修飾位點(diǎn)Tab.1 SRAMPdatabase analysis SPRING1-mRNA-m6A modification sites of human and mouse

2.3 METTL3調(diào)控SPRING1水平促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積

由于SPRING1主要影響細(xì)胞對脂質(zhì)的攝取，而脂質(zhì)攝取實(shí)驗(yàn)顯示轉(zhuǎn)染LV-METTL3后巨噬細(xì)胞內(nèi)Dil-Ac-LDL升高，轉(zhuǎn)染LV-METTL3并加入CL后巨噬細(xì)胞內(nèi)Dil-Ac-LDL含量降低（圖4）；高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)，結(jié)果顯示同樣的變化趨勢（表2）。以上結(jié)果說明，METTL3上調(diào)SPRING1水平可促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。

圖4 過表達(dá)METTL3并用CL抑制甲基化，檢測巨噬細(xì)胞攝取Dil-Ac-LDL情況Fig.4 Detection of macrophagesuptakeof Dil-Ac-LDLafter overexpression of METTL3 and adding CL

表2 干預(yù)METTL3及CL處理對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)含量的影響（，mg/g）Tab.2 Effect on lipid content of macrophages after intervening of METTL3 and adding CL(Mean±SD,mg/g)

表2 干預(yù)METTL3及CL處理對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)含量的影響（，mg/g）Tab.2 Effect on lipid content of macrophages after intervening of METTL3 and adding CL(Mean±SD,mg/g)

注：*P＜0.05與LV-對照組比較#P＜0.05與LV-METTL3組比較Note:TC,total cholesterol;FC,free cholesterol;CE,cholesterol ester*:P＜0.05 vs LV-Control group;#:P＜0.05 vs LV-METTL3 group

3 討論

動(dòng)脈粥樣硬化（AS）是一種復(fù)雜的心血管病理變化，由脂質(zhì)代謝紊亂和炎癥引起，是心肌梗死和腦卒中的重要原因，已成為世界范圍內(nèi)威脅人類健康的主要疾病之一[11,12]。血管壁中低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）和極低密度脂蛋白（very low density lipoprotein，VLDL）殘余顆粒的滯留、積聚促進(jìn)AS的發(fā)生[13]。過量的LDL隨即進(jìn)行氧化或者其他化學(xué)修飾，氧化型的LDL能誘導(dǎo)血管發(fā)生炎癥反應(yīng)，進(jìn)而招募巨噬細(xì)胞將其吞噬，最終形成泡沫細(xì)胞，加速病變進(jìn)程[14]。目前，作為研究熱點(diǎn)的m6A轉(zhuǎn)錄后修飾通過影響RNA結(jié)構(gòu)、代謝和翻譯，對調(diào)節(jié)靶標(biāo)基因的表達(dá)至關(guān)重要。本研究探討m6A修飾在巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝中的作用機(jī)制，揭示甲基化酶METTL3對巨噬細(xì)胞SPRING1表達(dá)，膽固醇蓄積的影響及調(diào)控機(jī)制。本研究初步闡明METTL3通過m6A修飾在轉(zhuǎn)錄后水平促進(jìn)巨噬細(xì)胞SPRING1表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積和泡沫細(xì)胞的形成。

m6A修飾作為最豐富的RNA表觀遺傳修飾，已顯示在各種基本生物學(xué)過程和多種疾病諸如脂質(zhì)代謝、胚胎發(fā)生、癌變和神經(jīng)發(fā)生等發(fā)揮重要作用[15,16]。m6A RNA廣泛分布在不同的組織中，在人、小鼠和豬的肝中均已鑒定出“GRACH”基序[17]。METTL3耗竭介導(dǎo)的m6A降低導(dǎo)致代謝相關(guān)基因的RNA延長半衰期，從而保護(hù)小鼠免受HFD誘導(dǎo)的代謝綜合征的侵害。m6A mRNA修飾在脂肪形成中的重要作用毋庸置疑，但其具體機(jī)制尚待探索。本研究創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)METTL3可調(diào)控新靶標(biāo)SPRING1，參與巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝及AS發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。SPRING1是一種糖基化的高爾基體膜駐留蛋白，是固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBPs）的重要調(diào)節(jié)因子。文獻(xiàn)報(bào)道，SPRING1結(jié)合S1P，介導(dǎo)S1P的激活，促進(jìn)其對底物SREBP前體的剪切，進(jìn)而影響成熟的核SREBPs水平[18]。研究顯示，在Hap1及Hepa1-6人肝癌細(xì)胞和鼠原代肝細(xì)胞中敲低SPRING1可減少SREBPs信號(hào)傳導(dǎo)，細(xì)胞膽固醇合成酶及游離膽固醇水平均顯著降低。對SPRING1下游調(diào)控已有報(bào)道，但目前尚未闡明SPRING1參與脂質(zhì)代謝上游調(diào)控因子及機(jī)制。因此，本研究從m6A轉(zhuǎn)錄后修飾，開辟以SPRING1為靶點(diǎn)的上游調(diào)控機(jī)制的探索。

本研究首先在脂質(zhì)孵育THP-1細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)METTL3和SPRING1高表達(dá)；然后干預(yù)METTL3的表達(dá)，SPRING1蛋白水平隨之改變，初步證明METTL3對SPRING1表達(dá)的調(diào)控作用；接著用生物信息學(xué)分析及CL處理，進(jìn)一步闡明METTL3通過m6A修飾上調(diào)巨噬細(xì)胞SPRING1水平；最后，通過脂質(zhì)攝取實(shí)驗(yàn)觀察METTL3上調(diào)SPRING1對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積的影響。然而m6A修飾除了參與脂質(zhì)代謝，還參與炎癥的調(diào)控，METTL3能否通過m6A修飾影響炎癥進(jìn)而影響AS發(fā)生發(fā)展；METTL3通過m6A修飾影響SPRING1的具體位點(diǎn)；以及m6A修飾是否影響其他脂質(zhì)代謝因子，本研究未做進(jìn)一步探討。對m6A修飾及其在巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝中以及AS進(jìn)展中的研究任重道遠(yuǎn)，還需深入研究。

總之，本研究通過生信分析和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，初步闡明METTL3通過m6A修飾上調(diào)SPRING1表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞脂質(zhì)蓄積。本研究從轉(zhuǎn)錄后修飾角度出發(fā)，探討m6A mRNA修飾通過重要脂質(zhì)調(diào)節(jié)因子SPRING1對巨噬細(xì)胞脂質(zhì)代謝的影響和機(jī)制，為AS的預(yù)防和治療提供了新的思路和見解，有望成為防治AS的科研工作新的治療靶點(diǎn)。