梁玉鍵, 張 濤, 李 草, 郅軍銳

(貴州大學(xué)昆蟲研究所, 貴州省山地農(nóng)業(yè)病蟲害重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 貴陽(yáng) 550025)

海藻糖(trehalose)是由兩分子葡萄糖以α,α-1,1-糖苷鍵構(gòu)成的一種非還原性雙糖，廣泛分布于昆蟲的各種組織和器官中(Elbeinetal., 2003)，其含量會(huì)隨昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、生命活動(dòng)及外界環(huán)境的變化而發(fā)生適應(yīng)性調(diào)節(jié)(Thompson, 2003)。海藻糖不僅作為一種貯存性的能源物質(zhì)，為昆蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和各項(xiàng)生命活動(dòng)提供能量(于彩虹等, 2008)，而且具有特殊的分子結(jié)構(gòu)，對(duì)多種生物活性物質(zhì)具有非特異性的保護(hù)作用，是生物體內(nèi)一種高效的抗逆應(yīng)激代謝產(chǎn)物(Tsonevetal., 1994; Wang and Haymet, 1998; Chenetal., 2002; Thompson, 2003)。此外，海藻糖代謝還對(duì)昆蟲蛻皮過(guò)程中幾丁質(zhì)的合成和降解具有調(diào)控作用(Yangetal., 2017; 唐斌等, 2018; Yuetal., 2021)。因此，海藻糖被認(rèn)為是昆蟲體內(nèi)最重要的一類雙糖，被稱為昆蟲的“血糖”(于彩虹等, 2008)。昆蟲在海藻糖-6-磷酸合成酶/6-磷酸海藻糖磷酸酯酶(trehalose-6-phosphate synthase/trehalose-6-phosphate phosphatase, TPS/TPP)的共同作用下合成海藻糖(Tangetal., 2018)。TPS首先將尿苷二磷酸葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸催化合成6-磷酸海藻糖；然后6-磷酸海藻糖在TPP的作用下去磷酸化生成海藻糖(Giaeveretal., 1988)。如在蔥蠅Deliaantiqua(Guoetal., 2015)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Tangetal., 2010)等多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)海藻糖的含量變化與TPS的表達(dá)和TPS酶活性變化存在一致性，證明了TPS是昆蟲體內(nèi)海藻糖合成的重要調(diào)控因子。雖然昆蟲體內(nèi)海藻糖的合成需要TPS/TPP兩類酶的共同參與，但是目前只在蔥蠅(Guoetal., 2015)、沙蔥螢葉甲Galerucadaurica(路標(biāo), 2018)、嗜眠搖蚊Polypedilumvanderplanki(Mitsumasuetal., 2010)等少數(shù)昆蟲中同時(shí)克隆得到TPS和TPP兩種調(diào)控海藻糖合成的基因。在大多數(shù)昆蟲中均只克隆得到TPS一種基因，但這些昆蟲體內(nèi)TPS所編碼的氨基酸序列通常包含TPS和TPP兩個(gè)功能結(jié)構(gòu)域(Guoetal., 2015; 唐斌等, 2019)，因此有學(xué)者推測(cè)一些昆蟲中可能只存在TPS一種調(diào)控海藻糖合成的基因(Tangetal., 2018)。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，已經(jīng)從黑腹果蠅Drosophilamelanogaster(Chenetal., 2002)、棉鈴蟲Helicoverpaarmigera(Xuetal., 2008)、甜菜夜蛾(Tangetal., 2010)、褐飛虱Nilaparvatalugens(唐斌等, 2019)和赤擬谷盜Triboliumcastaneum(Chenetal., 2018)等近40多種昆蟲中克隆得到TPS。并且在褐飛虱、赤擬谷盜等少數(shù)昆蟲中發(fā)現(xiàn)了多個(gè)不同的TPS，這些不同的TPS在系統(tǒng)進(jìn)化和三級(jí)結(jié)構(gòu)上均存在較大的差異(唐斌等, 2019)。由此可見，不同昆蟲體內(nèi)海藻糖的合成存在不同的分子調(diào)控機(jī)制，同種昆蟲體內(nèi)海藻糖的合成也是一個(gè)復(fù)雜的分子調(diào)控過(guò)程。

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾屬Spodoptera，是一種原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶的害蟲，具有極強(qiáng)的遷飛和危害能力(Goergenetal., 2016)，草地貪夜蛾對(duì)極端溫度具有極強(qiáng)的適應(yīng)能力。鑒于海藻糖特殊的分子功能，其極有可能是草地貪夜蛾抵御溫度脅迫的重要因子之一。目前，關(guān)于草地貪夜蛾體內(nèi)海藻糖合成的分子機(jī)制，以及TPS在草地貪夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程和抵御溫度脅迫中是否具有重要的調(diào)控作用還不清楚。因此，本研究以草地貪夜蛾為對(duì)象，運(yùn)用分子生物學(xué)技術(shù)，克隆和鑒定草地貪夜蛾TPS，并測(cè)定TPS在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段、5齡幼蟲不同組織和極端溫度脅迫下的表達(dá)變化，旨在初步明確TPS在草地貪夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的重要作用，以及應(yīng)對(duì)極端溫度脅迫時(shí)的響應(yīng)機(jī)制，為進(jìn)一步研究草地貪夜蛾體內(nèi)海藻糖代謝的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源及處理

草地貪夜蛾幼蟲于2019年5月從貴州省貴陽(yáng)市花溪區(qū)天鵝村的玉米植株上采集，然后放置在實(shí)驗(yàn)室RXZ型多段編程人工氣候箱(寧波江南儀器廠，溫度25±1℃，相對(duì)濕度70%±5%，光周期14L∶10D)保種。幼蟲用人工飼料進(jìn)行飼養(yǎng)，飼料配方參照李子園等(2019)飼料配方Ⅱ并稍作改進(jìn)，配方組成成分為：蒸餾水1 200 mL，黃豆粉120 g，麥麩粉120 g，酵母粉48 g，干酪素24 g，瓊脂24 g，山梨酸2.4 g，膽固醇0.24 g，肌醇0.24 g，抗壞血酸9.6 g，氯化膽堿1.2 g。成蟲用10%的蜂蜜水飼養(yǎng)。根據(jù)草地貪夜蛾不同發(fā)育階段或齡期的蛻皮和發(fā)育時(shí)間，每個(gè)發(fā)育階段或齡期取前、中、后3個(gè)時(shí)間段的樣品，即：卵期(前期：卵期4 h；中期：卵期24 h；后期：卵期48 h)、1齡幼蟲(前期：4 h；中期：24 h；后期：36 h)、2-5齡幼蟲(前期：4 h；中期：12 h；后期：24 h)、6齡幼蟲(前期：4 h；中期：24 h；后期：72 h)、蛹(前期：4 h；中期：72 h；后期：120 h)、成蟲(前期：4 h；中期：72 h；后期：120 h)共27個(gè)處理。每個(gè)處理設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)(下同)，其中卵200粒左右為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)；1-2齡幼蟲30頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)；3齡幼蟲10頭為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)；4-6齡幼蟲、蛹和成蟲均為5頭蟲為一個(gè)生物學(xué)重復(fù)。取草地貪夜蛾5齡第1天幼蟲于冰上解剖獲得體壁、中腸、脂肪體等組織。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)共解剖15頭幼蟲以保證樣品量充足，樣品經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱待用。根據(jù)草地貪夜蛾生物學(xué)習(xí)性，本實(shí)驗(yàn)共設(shè)10℃和35℃兩個(gè)溫度處理，將飼養(yǎng)在溫度25±1℃的草地貪夜蛾5齡第1天幼蟲分別放置到溫度為10℃和35℃(其他飼養(yǎng)條件與25℃正常飼養(yǎng)相同)的人工氣候箱內(nèi)分別脅迫2, 4和8 h，以正常(25℃)飼養(yǎng)2, 4和8 h的草地貪夜蛾5齡第1天幼蟲為對(duì)照。每個(gè)生物學(xué)重復(fù)取5頭草地貪夜蛾5齡第1天幼蟲。樣品經(jīng)液氮速凍后置于-80℃冰箱待用。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

取出1.1節(jié)中各處理樣品，使用Eastep?Super Total RNA Extraction Kit試劑盒(上海普洛麥格生物有限公司)提取樣品的總RNA，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA的質(zhì)量，運(yùn)用分光光度計(jì)(Nano PhotometerTMP-Class)檢測(cè)RNA的濃度和純度。分別取2 μL各樣品的總RNA模板，按照HiFiScript cDNA Synthesis Kit試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)合成cDNA，將總RNA和cDNA模板分別置于-80℃和-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 草地貪夜蛾TPS克隆

在NCBI中搜索獲得草地貪夜蛾TPS的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及其他昆蟲中已知的TPS數(shù)據(jù)，運(yùn)用DNAMAN 7.0進(jìn)行比對(duì)，篩選昆蟲中TPS的保守區(qū)域，運(yùn)用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)引物P-TPS1(表1)。以1.2節(jié)中草地貪夜蛾2齡幼蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增草地貪夜蛾TPS的目的片段。總反應(yīng)體系(25 μL): Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 plus dye)12.5 μL, cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, ddH2O 8.5 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性3 min; 95℃變性30 s, 54℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，檢測(cè)到目的條帶后，用柱式PCR產(chǎn)物純化試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，將純化后的目的片段連接至5×pClone007 Versatile Simple Vector Mix(北京擎科生物技術(shù)有限公司)載體并轉(zhuǎn)化入大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂平板，挑取單菌落進(jìn)行菌落PCR鑒定，將檢測(cè)到目的片段的菌落接種于2 mL的含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃過(guò)夜培養(yǎng)。最后將擴(kuò)大培養(yǎng)的菌液送至上海生工生物有限公司測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

在獲得第1段草地貪夜蛾TPS的目的片段后，繼續(xù)設(shè)計(jì)引物P-TPS2(退火溫度55℃)和P-TPS3(退火溫度53℃)(表1)，經(jīng)PCR反應(yīng)、連接轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，送公司測(cè)序后獲得草地貪夜蛾TPS的全長(zhǎng)編碼區(qū)。

1.4 草地貪夜蛾TPS序列分析

運(yùn)用DNAMAN 7.0的Sequence Assembly對(duì)克隆得到的3段草地貪夜蛾TPS序列進(jìn)行組裝，使用NCBI的Blast(https:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome)工具對(duì)組裝得到的TPS進(jìn)行比對(duì)分析；使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的ORFfinder(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder)預(yù)測(cè)草地貪夜蛾TPS的開放閱讀框；利用ExPASy ProtParam(https:∥web.expasy.org/protparam/)工具分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；應(yīng)用SignalP-5.0 Server(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)使用TMHMM Server 2.0((https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0)；使用NetNGlyc-1.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)和NetOGlyc-4.0(https:∥services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetOGlyc-4.0)預(yù)測(cè)N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)；運(yùn)用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的Conserved Domains工具分析蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；以草地貪夜蛾TPS序列為詢問(wèn)序列，在GenBank中搜索鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅目、直翅目共17種昆蟲的TPS序列，應(yīng)用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列的同源性比對(duì)；以中國(guó)對(duì)蝦Fenneropenaeuschinensis的TPS(GenBank登錄號(hào): ACD74843.1)為外群，用MEGA6.0軟件中的鄰接(neighbor-joining)法重復(fù)運(yùn)行1 000次構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹；利用在線分析軟件SOPMA(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_seccons.html)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用Biozentrum SWISS-MODEL預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)(https:∥swissmodel.expasy.org/interactive)，并用PlyMOL 1.1軟件進(jìn)行3D建模。

1.5 草地貪夜蛾TPS的表達(dá)分析

以1.2節(jié)中樣品的cDNA第1鏈為模板，以草地貪夜蛾核糖體蛋白L27(ribosomal protein L27，RPL27)基因(GenBank登錄號(hào): AF400191.1)為內(nèi)參基因，引物為Q-RPL27(擴(kuò)增效率為98.43%)(Karamipouretal., 2018)；用草地貪夜蛾TPS的編碼區(qū)設(shè)計(jì)用于RT-qPCR的特異性引物Q-TPS(擴(kuò)增效率為100.90%)(表1)。運(yùn)用FastStart Essential DNA Green Master(Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Germany)進(jìn)行熒光定量?？偡磻?yīng)體系(20 μL): cDNA模板2 μL, ddH2O 6 μL,上下游引物(10 μmol/L)各1 μL, FastStart Essential DNA Green Master 10 μL。反應(yīng)程序: 95℃預(yù)變性10 min; 95℃變性30 s, 56℃退火30 s, 40個(gè)循環(huán); 65℃ 5 s, 95℃ 5 s。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法計(jì)算草地貪夜蛾TPS的相對(duì)表達(dá)量(Livak and Schmittgen, 2001)，運(yùn)用Microsoft Excel 2019和SPSS 23.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析；不同溫度脅迫下，草地貪夜蛾TPS相對(duì)表達(dá)量的差異顯著性用單因素方差分析Turkey氏法，運(yùn)用Origin 2018作圖。

2 結(jié)果

2.1 草地貪夜蛾SfTPS的克隆及序列特征

克隆獲得草地貪夜蛾TPS的cDNA全長(zhǎng)序列2 571 bp，命名為SfTPS(GenBank登錄號(hào): MT920672)，開放閱讀框(ORF)長(zhǎng)2 481 bp，編碼826個(gè)氨基酸。預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)分子量為92.70 kD，等電點(diǎn)(pI)為6.45，分子式為：C4130H6504N1144O1200S41，推測(cè)半衰期為30 h，失穩(wěn)系數(shù)為41.49，是一種不穩(wěn)定蛋白質(zhì)?？偲骄H水性指數(shù)為-0.265，為親水性蛋白質(zhì)。無(wú)信號(hào)肽，無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)域。預(yù)測(cè)SfTPS具有N-糖基化位點(diǎn)3個(gè)，O-糖基化位點(diǎn)18個(gè)。蛋白結(jié)構(gòu)域分析表明，SfTPS具有TPS和TPP兩個(gè)保守的功能結(jié)構(gòu)域，其中TPS結(jié)構(gòu)域定位在第18-494位氨基酸(E=0e+00)，TPP結(jié)構(gòu)域定位在第532-763位氨基酸(E=2.12e-63)，分別對(duì)應(yīng)酵母的OtsA和OtsB。在草地貪夜蛾SfTPS的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋(α-helix)，β-折疊(β-sheet)和無(wú)規(guī)則卷曲(random coil)的占比分別為38.14%, 12.23%和48.55%。基于5hut.1.A進(jìn)行草地貪夜蛾SfTPS的3D建模，結(jié)果表明，草地貪夜蛾SfTPS的建模殘基(modelled residue range)范圍為17-499，序列同源性(sequence identity)為37.85%，用PyMOL構(gòu)建的草地貪夜蛾SfTPS的三級(jí)結(jié)構(gòu)為同源二聚體(homo-dimer)，由α-螺旋、β-折疊和無(wú)規(guī)則卷曲連接而成(圖1)。

圖1 草地貪夜蛾SfTPS的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 1 Predicted 3D structure of SfTPSof Spodoptera frugiperda紅色表示α-螺旋，黃色表示β-折疊，綠色表示無(wú)規(guī)卷曲。The red represents α-helix, the yellow represents β-sheet, and the green represents random coil.

2.2 草地貪夜蛾SfTPS同源性比對(duì)及系統(tǒng)進(jìn)化

氨基酸序列比對(duì)分析結(jié)果表明，草地貪夜蛾TPS與斜紋夜蛾SpodopteralituraTPS(GenBank登錄號(hào): ADA63844.1)的序列一致性最高，為99.15%；與黑腹果蠅TPS (GenBank登錄號(hào): NP608827.1)的序列一致性最低，為72.58%；與甜菜夜蛾TPS(GenBank登錄號(hào): ABM66814.2)、棉鈴蟲TPS(GenBank登錄號(hào): ACH88521.1)、東亞飛蝗LocustamigratoriamanilensisTPS(GenBank登錄號(hào): ABV44614.1)和褐飛虱TPS(GenBank登錄號(hào): ACV20871.1)的序列一致性分別為98.79%, 97.22%, 78.32%和74.06%(圖2)。

系統(tǒng)發(fā)育樹表明(圖3)，昆蟲綱的17種昆蟲和甲殼綱十足目的中國(guó)對(duì)蝦形成了兩個(gè)大分支；其中，鱗翅目、雙翅目、鞘翅目、半翅目和直翅目各目的昆蟲分別聚為一支。在鱗翅目中，SfTPS與斜紋夜蛾TPS的親緣關(guān)系最近，置信度為70%，與甜菜夜蛾、棉鈴蟲等鱗翅目昆蟲的親緣關(guān)系較近，與豆野螟Marucavitrata的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。由此可見，昆蟲的海藻糖合成酶TPS具有較高的保守性，其系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系符合昆蟲傳統(tǒng)分類體系。

2.3 草地貪夜蛾SfTPS的時(shí)空表達(dá)譜

以草地貪夜蛾1齡幼蟲4 hSfTPS的mRNA表達(dá)量為基準(zhǔn)，分析SfTPS在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段的表達(dá)情況。結(jié)果表明，SfTPS在草地貪夜蛾整個(gè)發(fā)育階段均有表達(dá)(圖4: A)，SfTPS在卵期和1-5齡幼蟲期的表達(dá)量相對(duì)較低，除2齡幼蟲4 h外，其他時(shí)段SfTPS的表達(dá)量均低于標(biāo)準(zhǔn)參量。在6齡幼蟲期、蛹期和成蟲期SfTPS的表達(dá)量相對(duì)較高，除成蟲4 h外，其他時(shí)段SfTPS的表達(dá)量均高于標(biāo)準(zhǔn)參量。其中SfTPS在成蟲72 h的相對(duì)表達(dá)量最高，為標(biāo)準(zhǔn)參量的6.01倍；5齡幼蟲12 h表達(dá)量最低，只有標(biāo)準(zhǔn)參量的0.04倍。當(dāng)草地貪夜蛾發(fā)育至6齡幼蟲后，SfTPS的表達(dá)量明顯升高。蛹期4, 72和120 h草地貪夜蛾SfTPS的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；成蟲期4, 72和120 h草地貪夜蛾SfTPS的表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)。此外，草地貪夜蛾SfTPS的相對(duì)表達(dá)量在卵到1齡幼蟲4 h、6齡幼蟲72 h到蛹4 h、蛹72 h到成蟲4 h等變態(tài)前后的變化較大。

圖2 草地貪夜蛾與其他昆蟲TPS蛋白多序列比對(duì)Fig. 2 Multiple sequence alignment of TPS proteins of Spodoptera frugiperda and other insectsTPS蛋白來(lái)源物種及GenBank登錄號(hào)Origin species of TPS proteins and their GenBank accession numbers: SfTPS: 草地貪夜蛾S. frugiperda, MT920672; SlTPS: 斜紋夜蛾S. litura, DA63844.1; SeTPS: 甜菜夜蛾S. exigua, ABM66814.2; HaTPS: 棉鈴蟲Helicoverpa armigera, ACH88521.1; NlTPS: 褐飛虱Nilaparvata lugens, ACV20871.1; DmTPS: 黑腹果蠅Drosophila melanogaster, NP608827.1; LmTPS: 東亞飛蝗Locusta migratoria manilensis, ABV44614.1.

圖3 鄰接法構(gòu)建的基于氨基酸序列的草地貪夜蛾與其他物種TPS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(1 000次重復(fù))Fig. 3 Phylogenetic tree of TPS proteins of Spodoptera frugiperda and other species based on the amino acidsequence constructed by the neighbor-joining method (1 000 repetitions)節(jié)點(diǎn)處的數(shù)值代表重復(fù)1 000 次的bootstrap 值。Numbers at nodes represent bootstrap values by 1 000 repeats.

SfTPS的組織分布結(jié)果表明，SfTPS在草地貪夜蛾5齡幼蟲脂肪體中高表達(dá)，在中腸和體壁中低表達(dá)。SfTPS在脂肪體中的表達(dá)量是體壁中(標(biāo)準(zhǔn)參量)的9.87倍，在中腸中的表達(dá)量只有標(biāo)準(zhǔn)參量的0.53倍(圖4: B)。

圖4 草地貪夜蛾SfTPS不同發(fā)育階段(A)和5齡幼蟲不同組織中(B)表達(dá)水平Fig. 4 Relative expression levels of SfTPS in different developmental stages (A) and different tissuesof the 5th instar larvae (B) of Spodoptera frugiperdaE: 卵 Egg; 1L-6L: 分別為1-6齡幼蟲1st-6th instar larva, respectively; P: 蛹Pupa; Ad: 成蟲Adult. I: 體壁Integument; M: 中腸Midgut; F:脂肪體Fat body. 時(shí)間為對(duì)應(yīng)發(fā)育階段下的發(fā)育時(shí)間。圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。The time is the development time during the corresponding developmental stages. Data in the figure are mean±SE.

2.4 短期高低溫脅迫后草地貪夜蛾SfTPS的表達(dá)水平

在10和35℃的極端溫度脅迫下草地貪夜蛾體內(nèi)SfTPS的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照(25℃)(P<0.05)，其中，10℃低溫脅迫后，SfTPS的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的4.43～9.34倍，而35℃高溫脅迫后SfTPS的相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照的2.50～6.03倍(圖5)。在10℃低溫處理下，隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)草地貪夜蛾SfTPS的表達(dá)量呈先上升后下降，SfTPS的相對(duì)表達(dá)量在脅迫4 h后達(dá)到最高，脅迫8 h后顯著降低(P<0.05)；在35℃高溫處理下，經(jīng)8 h處理后SfTPS的相對(duì)表達(dá)量顯著高于處理2 h和4 h時(shí)的(P<0.05)。

圖5 短期溫度脅迫后草地貪夜蛾5齡幼蟲中SfTPS的相對(duì)表達(dá)量Fig. 5 Relative expression levels of SfTPS inthe 5th instar larvae of Spodoptera frugiperdaunder short-term temperature stress圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；柱上不同小寫字母和大寫字母分別表示同一溫度不同時(shí)間處理間和同一時(shí)間不同溫度處理間基因表達(dá)水平存在顯著差異(P<0.05, Turkey氏法)。Data in the figure are mean±SE. Different lowercase and capital letters above bars indicate that there are significant differences in the gene expression level among different exposure time at the same temperature and among different temperature treatments at the same time (P<0.05, Turkey’s test), respectively.

3 討論

昆蟲的TPS基因具有較高的保守性，其編碼的氨基酸序列一般在750～850個(gè)氨基酸之間，無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，通常存在TPS和TPP兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域(Xuetal., 2008; Tangetal., 2010; 秦資等, 2012; 路標(biāo)等, 2017)。本研究克隆獲得草地貪夜蛾SfTPS的cDNA序列2 571 bp，其開放閱讀框長(zhǎng)2 481 bp，編碼826個(gè)氨基酸，無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，其編碼氨基酸存在TPS(第18-494位氨基酸)和TPP(第532-763位氨基酸)兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，與酵母OtsA和OtsB兩個(gè)海藻糖合成途徑的關(guān)鍵酶相對(duì)應(yīng)。分析發(fā)現(xiàn)，SfTPS與鱗翅目昆蟲TPS的親緣關(guān)系最近，與昆蟲綱其他昆蟲的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。在三級(jí)結(jié)構(gòu)上，SfTPS與褐飛虱的TPS1(唐斌等, 2019)較為相似，推測(cè)SfTPS與褐飛虱TPS1的功能可能存在相似性。綜上所述，草地貪夜蛾SfTPS屬于昆蟲的TPS家族。

本研究發(fā)現(xiàn)SfTPS在草地貪夜蛾不同發(fā)育階段和5齡幼蟲不同組織中的表達(dá)特性，其中SfTPS在6齡幼蟲期、蛹期和成蟲期高表達(dá)(圖4: A)，表明草地貪夜蛾在這些時(shí)期會(huì)大量積累海藻糖，Wyatt(1967)也發(fā)現(xiàn)昆蟲蛹期海藻糖的含量通常高于其他發(fā)育階段。一方面，合成的海藻糖被用于提供昆蟲靜止期所需的能量(于彩虹等, 2008)。另一方面，海藻糖還能作為抗逆應(yīng)激的代謝產(chǎn)物，提高昆蟲靜止期的抗逆能力。張悅等(2020)發(fā)現(xiàn)草地貪夜蛾蛹期的過(guò)冷卻點(diǎn)和結(jié)冰點(diǎn)會(huì)明顯低于其他發(fā)育階段，這種抗寒能力的提升極有可能與其蛹期的海藻糖含量較高有關(guān)。草地貪夜蛾作為一種典型的遷飛性害蟲(Westbrooketal., 2019)，其遷飛時(shí)需要消耗大量能量，而海藻糖是昆蟲飛行時(shí)的能量來(lái)源之一(Geetal., 2011; Zhaoetal., 2011)。葛世帥等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾3日齡成蟲的飛行能力最強(qiáng)，3日齡后草地貪夜蛾成蟲的飛行能力逐漸減弱，推測(cè)草地貪夜蛾的遷飛發(fā)生在卵巢稚嫩期(3日齡以前)。SfTPS的表達(dá)量在草地貪夜蛾成蟲72 h時(shí)達(dá)到整個(gè)發(fā)育階段的最高水平(圖4： A)，這種高表達(dá)極有可能與草地貪夜蛾的遷飛活動(dòng)相關(guān)。另外SfTPS的相對(duì)表達(dá)量在卵到幼蟲、幼蟲到蛹、蛹到成蟲等變態(tài)前后的變化較大(圖4: A)，推測(cè)SfTPS還與草地貪夜蛾的變態(tài)蛻皮等生理功能相關(guān)。TPS對(duì)幾丁質(zhì)代謝具有調(diào)控作用已在褐飛虱、白背飛虱等昆蟲中得到證實(shí)(Yangetal., 2017; 張道偉等, 2019)。本研究還發(fā)現(xiàn)SfTPS在5齡幼蟲脂肪體中表達(dá)豐度最高(圖4: B)，推測(cè)草地貪夜蛾的海藻糖主要在脂肪體中合成，這一研究結(jié)果與海藻糖在昆蟲脂肪體中合成的理論相符(Thompson, 2003; Tangetal., 2010; 唐斌等, 2014)。目前，化學(xué)防治還是草地貪夜蛾應(yīng)急防控的主要手段，但由于農(nóng)藥使用不合理，草地貪夜蛾已對(duì)多種現(xiàn)有農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性(Carvalhoetal., 2013; Bolzanetal., 2019)，因此，亟需尋找草地貪夜蛾體內(nèi)安全有效的農(nóng)藥作用靶標(biāo)。SfTPS是調(diào)控草地貪夜蛾體內(nèi)海藻糖合成的關(guān)鍵基因，在草地貪夜蛾能量供給、幾丁質(zhì)合成及抗逆等方面均發(fā)揮著重要作用，是一種具有研究前景的農(nóng)藥潛在靶標(biāo)。

昆蟲是典型的變溫動(dòng)物，其生命活動(dòng)極易受到環(huán)境溫度的影響(張紅梅等, 2020)。草地貪夜蛾無(wú)滯育現(xiàn)象，每年均會(huì)北遷南回以躲避溫度變化和食料缺乏等不良環(huán)境(Sparks, 1979; 陳輝等, 2020)。姜玉英等(2021)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，草地貪夜蛾能在夏季30℃以上的高溫地區(qū)(海南、臺(tái)灣、廣州)發(fā)生危害，而冬季能在1月平均溫度10℃等溫線以南的地區(qū)(云南、廣東、海南、四川、廣西、福建、貴州)越冬繁殖。草地貪夜蛾經(jīng)短期高低溫脅迫后，其SfTPS的mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照(P<0.05)(圖5)，推測(cè)是草地貪夜蛾響應(yīng)極端溫度脅迫的一種抗逆機(jī)制。多位學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)沙蔥螢葉甲(路標(biāo)等, 2017)、異色瓢蟲Harmoniaaxyridis(秦資等, 2012)、德國(guó)小蠊Blattellagermanica(陳靜和張道偉, 2015)等昆蟲經(jīng)不同溫度脅迫后，其體內(nèi)TPS的mRNA表達(dá)量也明顯升高。本研究還發(fā)現(xiàn)在10℃處理下，SfTPS的表達(dá)量在4 h后就達(dá)到峰值；但在35℃下經(jīng)4 h處理后SfTPS的表達(dá)量還在升高，其表達(dá)量在8 h處理下最高(圖5)。而且低溫處理后SfTPS表達(dá)是對(duì)照的4.43～9.34倍，而高溫處理后SfTPS表達(dá)才達(dá)到對(duì)照的2.50～6.03倍(圖5)，預(yù)測(cè)SfTPS在響應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮的作用比在響應(yīng)高溫脅迫中更強(qiáng)。結(jié)合本研究結(jié)果，推測(cè)越冬越夏期間草地貪夜蛾體內(nèi)的海藻糖含量可能顯著高于其他時(shí)期，這種生理調(diào)節(jié)能夠提高草地貪夜蛾應(yīng)對(duì)極端溫度脅迫的能力，為草地貪夜蛾的定殖和入侵提供有利條件。本研究只測(cè)定了高低溫脅迫下SfTPS的表達(dá)變化，只能間接表明海藻糖能夠參與草地貪夜蛾對(duì)極端環(huán)境溫度脅迫的適應(yīng)。在后續(xù)的工作中，可以深入研究溫度脅迫后草地貪夜蛾體內(nèi)TPS活性變化和海藻糖含量變化，進(jìn)一步闡明海藻糖在草地貪夜蛾適應(yīng)極端環(huán)境溫度脅迫中的功能。

本研究結(jié)果提示，SfTPS是草地貪夜蛾海藻糖合成途徑的關(guān)鍵基因，對(duì)該蟲的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程起重要的調(diào)控作用。然而包括人類在內(nèi)的哺乳動(dòng)物不能自身合成海藻糖，因此TPS具有成為安全農(nóng)藥靶標(biāo)的潛力(Tangetal., 2018)。在后續(xù)的工作中應(yīng)結(jié)合RNAi技術(shù)進(jìn)一步探究SfTPS在草地貪夜蛾生長(zhǎng)發(fā)育、抗逆應(yīng)激和調(diào)控幾丁質(zhì)合成等方面的具體功能，為應(yīng)用SfTPS作為靶基因進(jìn)行草地貪夜蛾的防控奠定理論基礎(chǔ)。