王歡歡, 呂圣蘭, 趙 瑞, 梁 沛, 張 帥,高希武, 張 雷,*, 谷少華,*

(1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲(chóng)學(xué)系, 北京100193; 2. 全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心, 北京 100026)

草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda，又稱(chēng)秋黏蟲(chóng)，屬鱗翅目(Lepidoptera)夜蛾科(Noctuidae)灰翅夜蛾屬Spodoptera，原分布于美洲，最早記載于1797年，1856年報(bào)道為害棉花，1917年報(bào)道了其防治方法(Murúaetal., 2009; 李永平等, 2019)。該蟲(chóng)以多食性著稱(chēng)，具有很強(qiáng)的遷移和擴(kuò)散能力，對(duì)玉米、小麥、水稻、高粱、甘蔗及棉花等多種作物造成嚴(yán)重為害(Casmuzetal., 2015)。2018年12月草地貪夜蛾從緬甸入境入侵我國(guó)云南省并迅速擴(kuò)散，現(xiàn)已成為我國(guó)主要的入侵害蟲(chóng)之一(Sunetal., 2021)。

2000年之前，美洲地區(qū)對(duì)草地貪夜蛾以化學(xué)防治為主(Gutiérrez-Morenoetal., 2019)。由于抗藥性問(wèn)題，當(dāng)?shù)赜?000年開(kāi)始種植Bt抗蟲(chóng)玉米(表達(dá)Cry1F)，但自2007年起陸續(xù)在多個(gè)國(guó)家發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)對(duì)Cry1F產(chǎn)生抗性并導(dǎo)致Bt抗蟲(chóng)玉米防效下降(Storeretal., 2010; Xiao, 2021)，因此南美洲大部分地區(qū)又重新使用殺蟲(chóng)劑進(jìn)行防控。目前草地貪夜蛾已對(duì)41種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了不同程度的抗性，產(chǎn)生抗性的殺蟲(chóng)劑既包括有機(jī)磷類(lèi)、擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)等傳統(tǒng)殺蟲(chóng)劑，也包括雙酰胺類(lèi)、多殺菌素等新型殺蟲(chóng)劑(APRD, 2019; Sparksetal., 2020)。入侵我國(guó)的草地貪夜蛾已經(jīng)攜帶有高頻率的對(duì)有機(jī)磷類(lèi)和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑的抗性基因(李妍等, 2020; Zhangetal., 2020)。

由于我國(guó)尚未推廣種植轉(zhuǎn)基因玉米，目前對(duì)草地貪夜蛾防治主要依靠化學(xué)殺蟲(chóng)劑。但由于我國(guó)地域廣闊，草地貪夜蛾在不同地區(qū)的發(fā)生情況不同，因此不同地區(qū)的用藥品種、強(qiáng)度和頻次也都存在差異，導(dǎo)致不同地區(qū)草地貪夜蛾種群對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性發(fā)展也不一致。因此，加強(qiáng)不同地區(qū)草地貪夜蛾抗藥性水平監(jiān)測(cè)，對(duì)于指導(dǎo)合理用藥、有效治理草地貪夜蛾具有重要意義。而進(jìn)行抗藥性監(jiān)測(cè)的前提就是建立靶標(biāo)害蟲(chóng)對(duì)不同藥劑的敏感基線(吳益東等, 2001)。雖然國(guó)外已經(jīng)有草地貪夜蛾對(duì)殺蟲(chóng)劑敏感基線的相關(guān)報(bào)道(Yu, 1991; Yuetal., 2003; Gutiérrez-Morenoetal., 2019)，但這些敏感基線都是用室內(nèi)絕對(duì)敏感種群建立，其敏感基線數(shù)據(jù)不宜用于我國(guó)草地貪夜蛾抗性監(jiān)測(cè)和指導(dǎo)用藥。

而國(guó)內(nèi)目前尚無(wú)草地貪夜蛾對(duì)常用殺蟲(chóng)劑敏感基線的報(bào)道，因此迫切需要在草地貪夜蛾入侵我國(guó)初期、尚未產(chǎn)生明顯抗藥性之前建立可靠的敏感基線并進(jìn)行抗性監(jiān)測(cè)，以便準(zhǔn)確掌握草地貪夜蛾田間種群的抗藥性水平及發(fā)展動(dòng)態(tài)，及時(shí)調(diào)整用藥策略，在有效防治草地貪夜蛾的同時(shí)延緩其抗藥性發(fā)展。鑒于不同研究人員進(jìn)行草地貪夜蛾抗藥性監(jiān)測(cè)時(shí)所采用的生物測(cè)定方法不同，本研究分別采用點(diǎn)滴法、浸葉法和飼料藥膜法3種常用生測(cè)方法建立了草地貪夜蛾對(duì)甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(甲維鹽)等6大類(lèi)共7種常用殺蟲(chóng)劑的相對(duì)敏感基線，為草地貪夜蛾的抗藥性監(jiān)測(cè)及其抗藥性治理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

根據(jù)2019年中國(guó)草地貪夜蛾對(duì)殺蟲(chóng)劑的抗性監(jiān)測(cè)結(jié)果(未發(fā)表數(shù)據(jù))，選擇其中最敏感的云南種群用于建立對(duì)甲維鹽、乙基多殺菌素和四氯蟲(chóng)酰胺的敏感基線，海南種群用于建立對(duì)蟲(chóng)螨腈、虱螨脲和茚蟲(chóng)威的敏感基線，湖北種群用于建立對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的敏感基線。3個(gè)種群均是2019年6月份采自當(dāng)?shù)赜衩滋?。所有種群均在室內(nèi)26±1℃、相對(duì)濕度70%±5%、光暗周期16L∶8D條件下用人工飼料飼養(yǎng)5～7代，期間不接觸任何殺蟲(chóng)劑。

1.2 供試藥劑及試劑

95%四氯蟲(chóng)酰胺(沈陽(yáng)科創(chuàng)化學(xué)品有限公司)，99%乙基多殺菌素(陶氏益農(nóng)中國(guó)有限公司)，92%甲氨基阿維菌素苯甲酸鹽(河北沃德豐藥業(yè)有限公司)，96%蟲(chóng)螨腈(江蘇維尤納特精細(xì)化工有限公司)，96%虱螨脲(瑞士先正達(dá)作物保護(hù)有限公司)，90%茚蟲(chóng)威(京博農(nóng)化科技有限公司)，95%氯蟲(chóng)苯甲酰胺(蘇州富美實(shí)植物保護(hù)劑有限公司)；二甲基亞砜(DMSO)、丙酮均為分析純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，Triton X-100(美國(guó)Amresco公司)。

1.3 毒力測(cè)定

1.3.1浸葉法：參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1154.14-2008農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺蟲(chóng)劑第14部分：浸葉法》進(jìn)行生物測(cè)定，略有改動(dòng)。具體步驟為：將原藥配制成母液，除氯蟲(chóng)苯甲酰胺用二甲基亞砜溶解外，其余原藥均用丙酮溶解。然后用0.1% Triton X-100水溶液將母液按等比稀釋成5～7個(gè)系列濃度，將喇叭口期的非轉(zhuǎn)基因新鮮玉米葉片剪成長(zhǎng)×寬=1 cm×1 cm的葉段。分別將葉段在不同濃度的藥液中浸泡20 s后，放在濾紙上陰干后置于12孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)板每孔預(yù)先倒入1.5%瓊脂1 mL保濕。每孔6個(gè)葉段，并接入1頭3齡第2天幼蟲(chóng)。每處理重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)不少于12頭幼蟲(chóng)。以0.1% Triton X-100水溶液處理為對(duì)照。根據(jù)不同藥劑作用特點(diǎn)，雙酰胺類(lèi)藥劑以及虱螨脲在處理后96 h檢查結(jié)果，其余藥劑均在處理后48 h檢查結(jié)果。用毛筆輕觸幼蟲(chóng)無(wú)反應(yīng)則視為死亡。

1.3.2點(diǎn)滴法：參照中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《NY/T 1154.1-2006農(nóng)藥室內(nèi)生物測(cè)定試驗(yàn)準(zhǔn)則殺蟲(chóng)劑第1部分：點(diǎn)滴法》進(jìn)行生物測(cè)定，略有改動(dòng)。具體步驟為：將原藥配制成母液，除氯蟲(chóng)苯甲酰胺用二甲基亞砜溶解外，其余原藥均用丙酮溶解。將配制好的母液再按等比稀釋成5～7個(gè)系列濃度，用微量點(diǎn)滴器(Hamilton PB600-1)逐個(gè)點(diǎn)滴于3齡第2天幼蟲(chóng)(平均體重約0.005 g)的前胸背板上，每頭點(diǎn)滴0.2 μL，將點(diǎn)滴后的試蟲(chóng)轉(zhuǎn)入直徑9 cm培養(yǎng)皿中，放入足量人工飼料正常飼養(yǎng)。每處理重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)10頭幼蟲(chóng)，以相應(yīng)溶劑點(diǎn)滴處理為對(duì)照。在處理后24 h檢查結(jié)果，用毛筆輕觸幼蟲(chóng)無(wú)反應(yīng)或有明顯的中毒癥狀(畸形、顫搐、停止取食等)則視為死亡。由于虱螨脲以胃毒作用為主，觸殺作用差，所以本方法中未測(cè)定虱螨脲的毒力。

1.3.3飼料藥膜法：參考Bolzan等(2019)的方法有改進(jìn)。具體步驟為：將原藥配制成母液，除氯蟲(chóng)苯甲酰胺用二甲基亞砜溶解外，其余原藥均用丙酮溶解。將配制好的母液用0.1% Triton X-100水溶液等比稀釋成5～7個(gè)系列梯度。在24孔培養(yǎng)板中，每孔分別加入冷卻至60℃左右的液態(tài)人工飼料1 mL并放涼使其自然固化。然后每孔滴入50 μL不同濃度藥液并均勻涂布于飼料表面，置于室溫下晾干后每孔接入1頭2齡幼蟲(chóng)。每處理重復(fù)4次，每個(gè)重復(fù)12頭幼蟲(chóng)，以0.1% Triton X-100水溶液處理為對(duì)照。除虱螨脲在處理后96 h檢查結(jié)果外，其余藥劑均在處理后48 h檢查結(jié)果，結(jié)果檢查方法同1.3.2節(jié)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)用POLO軟件(LeOra Software Inc., California, 美國(guó))進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)照死亡率小于10%為有效測(cè)定，并用對(duì)照死亡率進(jìn)行校正，求出毒力回歸線Slope值及其標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)、致死中濃度(LC50)或致死中劑量(LD50)值及其95%置信限、卡方值(χ2)、自由度(df)以及P值。

2 結(jié)果

2.1 浸葉法測(cè)定的草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)對(duì)7種殺蟲(chóng)劑的相對(duì)敏感基線

浸葉法測(cè)定結(jié)果表明，草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)對(duì)甲維鹽最敏感，LC50值為0.054 mg/L；對(duì)虱螨脲、四氯蟲(chóng)酰胺、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、乙基多殺菌素和蟲(chóng)螨腈等5種殺蟲(chóng)劑敏感性較高，LC50值均小于2 mg/L；對(duì)茚蟲(chóng)威敏感性中等，LC50值為12.131 mg/L。草地貪夜蛾對(duì)不同藥劑的敏感性由高到低依次為甲維鹽、虱螨脲、四氯蟲(chóng)酰胺、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、乙基多殺菌素、蟲(chóng)螨腈和茚蟲(chóng)威(表1)。

2.2 點(diǎn)滴法測(cè)定的草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)對(duì)6種殺蟲(chóng)劑的相對(duì)敏感基線

點(diǎn)滴法測(cè)定結(jié)果表明，各藥劑對(duì)草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)的LD50值均在5 μg/g以下，其中對(duì)甲維鹽最敏感，LD50值為0.355 μg/g，對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺和乙基多殺菌素次之，LD50值分別為0.410和0.518 μg/g。四氯蟲(chóng)酰胺、蟲(chóng)螨腈和茚蟲(chóng)威對(duì)草地貪夜蛾LD50值分別為1.244, 2.097和4.707 μg/g。草地貪夜蛾對(duì)不同藥劑的敏感性由高到低依次為甲維鹽、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、乙基多殺菌素、四氯蟲(chóng)酰胺、蟲(chóng)螨腈和茚蟲(chóng)威(表2)。

2.3 飼料藥膜法測(cè)定的草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)對(duì)7種殺蟲(chóng)劑的相對(duì)敏感基線

飼料藥膜法測(cè)定結(jié)果表明，草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)對(duì)不同殺蟲(chóng)劑的敏感性差異較小，LC50值均在0.3 μg/cm2以下，其中對(duì)甲維鹽最敏感，LC50值為0.003 μg/cm2。草地貪夜蛾對(duì)不同藥劑的敏感性由高到低依次為甲維鹽、虱螨脲、乙基多殺菌素、氯蟲(chóng)苯甲酰胺、四氯蟲(chóng)酰胺、蟲(chóng)螨腈和茚蟲(chóng)威(表3)。

表1 草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)對(duì)7種殺蟲(chóng)劑的相對(duì)敏感基線(浸葉法)Table 1 Relative susceptible baselines of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperdato seven insecticides (leaf-dip method)

表2 草地貪夜蛾3齡幼蟲(chóng)對(duì)6種殺蟲(chóng)劑的相對(duì)敏感基線(點(diǎn)滴法)Table 2 Relative susceptible baselines of the 3rd instar larvae of Spodoptera frugiperdato six insecticides (topical application)

表3 草地貪夜蛾2齡幼蟲(chóng)對(duì)7種殺蟲(chóng)劑的相對(duì)敏感基線(飼料藥膜法)Table 3 Relative susceptible baselines of the 2nd instar larvae of Spodoptera frugiperdato seven insecticides (diet surface overlay bioassay)

3 討論

目前農(nóng)業(yè)農(nóng)村部推薦的多數(shù)防治草地貪夜蛾的藥劑都兼具胃毒和觸殺作用。不同生物測(cè)定方法所測(cè)得的害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感性結(jié)果往往不同。點(diǎn)滴法主要測(cè)定殺蟲(chóng)劑的觸殺作用，定量準(zhǔn)確，是目前最為精準(zhǔn)的測(cè)定方法；浸葉法與田間莖葉噴霧處理的效果最為接近，能夠同時(shí)反映藥劑的觸殺和胃毒毒力；飼料藥膜法測(cè)定的也是殺蟲(chóng)劑觸殺和胃毒的聯(lián)合作用。因此，這3種方法都能反映目前生產(chǎn)上主推藥劑對(duì)草地貪夜蛾的毒力，因而在殺蟲(chóng)劑活性評(píng)價(jià)和抗性監(jiān)測(cè)中被廣泛使用。本研究以室內(nèi)建立的云南、海南和湖北3個(gè)草地貪夜蛾相對(duì)敏感種群為材料，分別采用點(diǎn)滴法、浸葉法和飼料藥膜法3種不同的生測(cè)方法建立了草地貪夜蛾對(duì)常用殺蟲(chóng)藥劑的敏感基線，為建立完善的草地貪夜蛾抗藥性監(jiān)測(cè)體系，盡早開(kāi)展抗藥性監(jiān)測(cè)工作提供支持。雖然本研究所用的云南、海南和湖北種群都是不接觸殺蟲(chóng)劑的情況下連續(xù)飼養(yǎng)多代的相對(duì)敏感種群，但3個(gè)種群對(duì)不同藥劑的敏感性還是存在一定差異。因此，我們?cè)跍y(cè)定3個(gè)種群對(duì)7種常用殺蟲(chóng)劑敏感性的基礎(chǔ)上，分別選擇中國(guó)最敏感的種群建立相應(yīng)敏感基線，如選擇云南種群建立對(duì)甲維鹽、乙基多殺菌素和四氯蟲(chóng)酰胺的敏感基線，選擇海南種群建立對(duì)蟲(chóng)螨腈、虱螨脲和茚蟲(chóng)威的敏感基線，選擇湖北種群建立對(duì)氯蟲(chóng)苯甲酰胺的敏感基線，以期為田間草地貪夜蛾的抗性監(jiān)測(cè)提供最接近實(shí)際情形的敏感基線。

高祖鵬等(2020)以飼料藥膜法測(cè)得氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)草地貪夜蛾的LC50值為4.52 mg/L，是本研究結(jié)果(表3)的4倍。魯艷輝等(2020)以浸葉法測(cè)得氯蟲(chóng)苯甲酰胺對(duì)草地貪夜蛾的LC50值為4.483 mg/L，顯著高于本研究中浸葉法測(cè)定的結(jié)果(表1)。上述差異主要是因?yàn)楸狙芯克孟鄬?duì)敏感品系在室內(nèi)不接觸殺蟲(chóng)劑的情況下連續(xù)飼養(yǎng)了至少5～7代，而其他研究中所用草地貪夜蛾基本都是直接采自田間的種群，并非相對(duì)敏感種群。但這些結(jié)果也反映出我國(guó)的草地貪夜蛾田間種群已經(jīng)對(duì)常用藥劑產(chǎn)生了不同水平的抗性，更加凸顯了盡快建立敏感基線、對(duì)草地貪夜蛾抗藥性進(jìn)行系統(tǒng)監(jiān)測(cè)的緊迫性。而Lira等(2020)以浸葉法測(cè)得乙基多殺菌素對(duì)巴西草地貪夜蛾敏感品系的LC50值為0.63 mg/L，與本研究結(jié)果(表1)基本一致，說(shuō)明本研究中建立敏感基線所選擇的草地貪夜蛾品系是合適的。

由于草地貪夜蛾具有遷飛性和暴發(fā)性特點(diǎn)，化學(xué)殺蟲(chóng)劑將持續(xù)在其防治中扮演主要角色。而入侵我國(guó)的草地貪夜蛾種群本身已經(jīng)攜帶高頻率的抗性基因(李妍等, 2020)，加之目前以應(yīng)急防控為核心的少數(shù)幾種殺蟲(chóng)劑的大量、持續(xù)使用，必將加速草地貪夜蛾的抗藥性發(fā)展。而且我國(guó)不同地區(qū)(如周年繁殖區(qū)、遷飛過(guò)渡區(qū)和重點(diǎn)防范區(qū))因草地貪夜蛾發(fā)生情況不同，用藥種類(lèi)和頻率也各不相同，因此其產(chǎn)生抗藥性的速度和水平也會(huì)不同。系統(tǒng)監(jiān)測(cè)我國(guó)不同地區(qū)草地貪夜蛾的抗藥性對(duì)于因地制宜制訂抗性治理策略就顯得尤為重要(李永平等, 2019; 吳益東等, 2019)。害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑的敏感基線是評(píng)價(jià)其抗藥性水平的重要依據(jù)，在抗藥性監(jiān)測(cè)以及治理中具有重要意義。如棉鈴蟲(chóng)Helicoverpaarmigera(陳長(zhǎng)琨等, 2000)、麥長(zhǎng)管蚜Sitobionavenae(魯艷輝等, 2009)、甜菜夜蛾Spodopteraexigua(李秀環(huán)等, 2012)及稻縱卷葉螟Cnaphalocrocismedinalis(王世玉等, 2016)等重要害蟲(chóng)對(duì)殺蟲(chóng)劑敏感基線的建立，使得對(duì)這些害蟲(chóng)抗藥性的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)和科學(xué)防控成為可能。與其他害蟲(chóng)一樣，草地貪夜蛾理論上可以對(duì)任何用于其防治的殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性。Zhang等(2021)對(duì)云南等4個(gè)省份的5個(gè)草地貪夜蛾種群抗藥性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，除雙酰胺類(lèi)外，所有種群都對(duì)有機(jī)磷類(lèi)、噁二嗪和擬除蟲(chóng)菊酯類(lèi)殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了高水平抗性。但由于缺乏敏感基線，對(duì)草地貪夜蛾的抗藥性監(jiān)測(cè)無(wú)法正常進(jìn)行。因此，本文建立了草地貪夜蛾對(duì)常用殺蟲(chóng)劑的敏感基線，對(duì)于系統(tǒng)監(jiān)測(cè)其抗藥性、指導(dǎo)合理用藥以及評(píng)價(jià)抗藥性治理措施的有效性都具有重要意義。