易莉莎，鄭博宇，劉志紅，黃子健

(廣州市婦女兒童醫(yī)療中心 婦產(chǎn)科，廣東 廣州 510623)

子宮內(nèi)膜癌是最常見的婦科惡性腫瘤，也是婦女中發(fā)病率居第四位的腫瘤。隨著化療、放療和外科手術(shù)聯(lián)合治療的開展，子宮內(nèi)膜癌患者生存率有顯著提高。早期子宮內(nèi)膜癌患者的5年生存率可高達(dá)90%，但Ⅲ期和Ⅳ期患者5年生存率僅有60%或20%[1]。

長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度大于200nt不具有蛋白編碼功能的RNA[2]，研究證實多個lncRNA可參與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生發(fā)展。lncRNA NEAT1通過調(diào)控miR-144-3p/EZH2軸促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖、遷移和浸潤[3]，抑制lncRNA CCAT2可通過吸附miR-216b抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移[4]，lncRNA HEIH可通過活化MAPK信號通路增加子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞對紫杉醇的耐藥[5]。

多項研究顯示，LINC00958在腫瘤中高表達(dá)并發(fā)揮癌基因的作用。LINC00958(BLACAT2)在膀胱癌組織中高表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[6]，并通過吸附miR-379a-3p上調(diào)IGF1R的表達(dá)[7]。Luo Z等證實LINC00958可通過調(diào)控JNK/c-JUN信號通路促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的增殖和轉(zhuǎn)移[8]。最近，有研究發(fā)現(xiàn)LINC00958通過吸附miR-625-5p上調(diào)LRRC8E的表達(dá)從而促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[9]。除了可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，LINC00958還被證實可通過與miR-5095結(jié)合增加宮頸癌細(xì)胞的放療敏感性[10]。此外，抑制LINC00958可通過靶向miR-3619-5p抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、浸潤和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11]?？梢?，LINC00958在多種腫瘤中發(fā)揮癌基因的作用，并可通過吸附miRNA發(fā)揮其功能。

而LINC00958在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)和作用尚未見報道，本文擬通過生物信息學(xué)分析LINC00958在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)及其與臨床分期、預(yù)后的關(guān)系，并檢測其對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響，通過預(yù)測和驗證可與LINC00958結(jié)合的miRNA探討LINC00958調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的分子機制，初步闡明其在子宮內(nèi)膜癌中表達(dá)的意義和作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞系MEG3、HEC-1B購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。試劑：高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購自美國Thermo Fisher公司、Lipofectamine 2000(貨號：11668019)、Trizol(Invitrogen公司)；CCK-8試劑盒(C0038，上海碧云天生物)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(RR037A，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)；SYBR定量PCR試劑盒(RR820A，寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司)；miRNA檢測試劑盒(上海吉瑪生物)；雙熒光素酶活性報告分析試劑盒(Promega公司)；所有引物、siRNA由華大基因合成。

1.2 生物信息學(xué)分析

利用在線數(shù)據(jù)庫GEPIA(http:∥gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析TCGA數(shù)據(jù)庫中LINC00958在子宮內(nèi)膜癌組織及正常子宮內(nèi)膜組織中表達(dá)差異、LINC00958在不同級別子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)差異，篩選與LINC00958表達(dá)密切相關(guān)的前20個基因。利用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫(http:∥kmplot.com/analysis)繪制不同LINC00958表達(dá)子宮內(nèi)膜癌患者的生存曲線。利用在線軟件Kobas3.0(http:∥kobas.cbi.pku.edu.cn/kobas3)分析LINC00958及與其表達(dá)密切相關(guān)的20個基因參與的信號通路。采用ENCORI(http:∥starbase.sysu.edu.cn/index.php)預(yù)測能與LINC00958結(jié)合的miRNA并分析LINC00958在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)MEG3、HEC-1B細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。

1.4 細(xì)胞總RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄cDNA

收集1×106個細(xì)胞，加入1 mL Trizol裂解5 min，再加入200 μL氯仿，劇烈震蕩混勻后冰上靜置10 min，4℃ 12000 rpm離心15 min，取400μl上清加入400 μL異丙醇，劇烈震蕩混勻后置于-20 ℃沉淀30 min，4 ℃ 12 000 rpm離心10 min，棄上清，1 mL預(yù)冷的75%無酶水乙醇洗滌2次，加入30 μL無酶水溶解。采用Nanodrop2000測定RNA濃度。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書取1 μg total RNA在20 μL體系中合成cDNA。

1.5 實時熒光定量PCR

利用 SYBR定量PCR試劑盒檢測細(xì)胞中LINC00958的表達(dá)水平。上游引物序列：5’-CAGCGAAAGGCAGCTGATTC-3’，下游引物序列：5’-ATAAAGTGGTCTGGGCCTGC-3’，以GAPDH為內(nèi)參，上游引物序列：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物序列：5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。每個樣本設(shè)立3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次，目的基因相對表達(dá)水平以2-△△Ct表示。采用miRNA逆轉(zhuǎn)錄和qPCR檢測試劑盒(上海吉瑪生物)檢測miR-129-2-3p的表達(dá)，以U6為內(nèi)參。

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染前24 h，取對數(shù)生長期的細(xì)胞，接種于6孔板中，密度為5×105/孔，按照Lipofectamine2000說明書，每孔加入2條LINC00958 siRNA各100 pmol(siRNA1序列：5’- UACUUGAAAACUCAUAGUGAG -3’，siRNA2序列：5’- AACAGUUUUAAAAAUUAG-CUG -3’)、對照序列(si-NC：5’-UUUUUAUUGAGU-CUAUUUGAU-3’)，分別與含5μl Lipofectamine 2000的DMEM混合后，靜置20 min，加入1.5 mL培養(yǎng)基中。miR-129-2-3p mimics和對照序列的轉(zhuǎn)染步驟與siRNA轉(zhuǎn)染步驟相同，轉(zhuǎn)染48小時后，采用RT-qPCR檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.7 雙熒光素酶報告分析

根據(jù)ENCORI在線軟件預(yù)測到的LINC00958與miR-129-2-3p結(jié)合位點，設(shè)計合成野生型序列：5’-CCAGGACAACAGGGAAGCTTGCAGCAAGATA-GCTCCAGGTTGGATTCATGCTTCGCACCCCAAGGG-CTGCCAGCCAGAGAGGAGGAGAAGCAATCACTCC-TGCAGTTTCTGAACACTAC- 3’和突變型序列：5’-CCAGGACAACAGGGAAGCTTGCAGCAAGATAGCTCCAGGTTGGATTCATGCTTCGCACCCCGGAAATCGCCAGCCAGAGAGGAGGAGAAGCAATCACTCCTGCAGTTTCTGAACACTAC- 3’，并克隆至pMIR-report載體，構(gòu)建pMIR-WT(野生型)和pMIR-MUT(突變型)載體。分別將質(zhì)粒與miR-129-2-3p與對照序列(NC)共轉(zhuǎn)染接種于24孔板的HEC-1B細(xì)胞，培養(yǎng)48h后裂解細(xì)胞，采用雙熒光素酶報告分析試劑盒檢測各組細(xì)胞中熒光素酶活性。每組設(shè)3個重復(fù)孔，實驗獨立重復(fù)3次。

1.8 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖

細(xì)胞轉(zhuǎn)染24小時后，調(diào)整細(xì)胞密度為1×104/孔接種于96孔板中，其中一部分實驗組分2組：對照組，si-LINC00958組；另一部分實驗分2組：miRNA對照序列與siRNA對照序列共轉(zhuǎn)染組、miR-129-2-3p mimics與si-LINC00958共轉(zhuǎn)染組。每組設(shè)6個復(fù)孔，然后將96孔板放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃培養(yǎng)箱孵育2 h，檢測OD450 nm處的值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以3次獨立實驗的均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表達(dá)，兩樣本間均數(shù)的比較采用t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00958在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)

在線數(shù)據(jù)庫GEPIA分析顯示LINC00958在174例子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織(n=91，P<0.001)(見圖1A)；ENCORI數(shù)據(jù)庫分析548例子宮內(nèi)膜癌組織中LINC00958的表達(dá)也顯著高于35例正常子宮內(nèi)膜組織(P<0.001)(見圖1B)；但是LINC00958的表達(dá)在不同級別子宮內(nèi)膜癌組織中無差異(見圖1C)。

2.2 LINC00958表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者預(yù)后的關(guān)系

Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析LINC00958表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者總生存率的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LINC00958高表達(dá)患者總生存率高于低表達(dá)患者，P=0.00073(見圖2A)，LINC00958高表達(dá)患者的無病生存率也高于低表達(dá)患者，P=0.017(見圖2B)。

A.GEPIA數(shù)據(jù)庫分析LINC00958在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，Tumor：子宮內(nèi)膜癌組織，Normal：正常子宮內(nèi)膜組織，n：病例數(shù)，*P<0.05；B.ENCORI數(shù)據(jù)庫分析LINC00958在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，Tumor：子宮內(nèi)膜癌組織，Normal：正常子宮內(nèi)膜組織；C.GEPIA數(shù)據(jù)庫分析LINC00958在不同分級子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)。

2.3 抑制LINC00958對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染LINC00958 siRNA后，采用RT-qPCR檢測LINC00958在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞MEG3、HEC-1B中的表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染LINC00958 siRNA1和siRNA2后MEG3細(xì)胞中LINC00958的表達(dá)分別為對照組的0.567±0.054和0.618±0.078倍，HEC-1B細(xì)胞中LINC00958的表達(dá)分別為對照組的0.657±0.063和0.610±0.086倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明干擾成功(圖3A)。采用CCK8檢測干擾LINC00958的表達(dá)后子宮內(nèi)膜癌MEG3和HEC-1B細(xì)胞增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在MEG3細(xì)胞中抑制LINC00958的表達(dá)48 h和72 h后可顯著抑制細(xì)胞增殖(圖3B)，在HEC-1B細(xì)胞中轉(zhuǎn)染LINC00958 siRNA1后72 h，細(xì)胞增殖受抑制，而轉(zhuǎn)染siRNA2可在48h和72h抑制細(xì)胞增殖(見圖3C)。

2.4 LINC00958可與miR-129-2-3p結(jié)合

ENCORI在線軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)LINC00958可與miR-129-2-3p結(jié)合，且只有1個結(jié)合位點(見圖4A)。然后，我們通過GEPIA數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜癌組織中LINC00958與miR-129-2-3p的表達(dá)并不相關(guān)(圖4B)。隨后，我們采用雙熒光素酶報告分析發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-129-2-3p mimics與野生型載體組的熒光素酶活性為對照組的0.637±0.081倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而轉(zhuǎn)染miR-129-2-3p mimics與突變型載體組的熒光素酶活性為對照組的0.934±0.112倍，轉(zhuǎn)染對照序列和突變型載體組的熒光素酶活性為對照組的1.184±0.157倍，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(見圖4C)，說明miR-129-2-3p可與LINC00958結(jié)合。

2.5 LINC00958通過吸附miR-129-2-3p調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖

ENCORI在線軟件分析了538例子宮內(nèi)膜癌組織和35例正常子宮內(nèi)膜組織中miR-129-2-3p的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-129-2-3p在子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)顯著低于正常子宮內(nèi)膜組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)(圖5A)。向子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-129-2-3p mimics后，RT-qPCR檢測證實miR-129-2-3p在MEG3和HEC-1B細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(圖5B)。CCK8實驗檢測發(fā)現(xiàn)，在MEG3細(xì)胞中過表達(dá)miR-129-2-3p 72 h后，細(xì)胞增殖能力顯著下降(P<0.05)，在HEC-1B細(xì)胞中過表達(dá)miR-129-2-3p 48 h和72h后，細(xì)胞增殖能力也顯著下降(P<0.05和P<0.01)(圖5C和5D)。在過表達(dá)miR-129-2-3p的同時抑制LINC00958的表達(dá)72 h后可顯著抑制MEG3和HEC-1B細(xì)胞的增殖能力(圖5E和5F)。

A.Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析LINC00958表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者總生存率的關(guān)系；B.Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析LINC00958表達(dá)與子宮內(nèi)膜癌患者無病生存率的關(guān)系。紅色曲線為高表達(dá)組，黑色曲線為低表達(dá)組。

A： RT-qPCR檢測2條LINC00958 siRNA轉(zhuǎn)染MEG3和HEC-1B細(xì)胞后LINC00958的表達(dá)；B：CCK8檢測轉(zhuǎn)染2條LINC00958 siRNA后MEG3細(xì)胞增殖；C：CCK8檢測轉(zhuǎn)染LINC00958 siRNA后HEC-1B細(xì)胞增殖。*P<0.05，**P<0.01。

A：ENCORI在線軟件預(yù)測到miR-129-2-3p能與LINC00958結(jié)合；B：GEPIA數(shù)據(jù)庫分析子宮內(nèi)膜癌組織中miR-129-2-3p與LINC00958表達(dá)相關(guān)性；C：雙熒光素酶活性報告分析檢測子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中LINC00958能否與miR-129-2-3p結(jié)合，WT：與miR-129-2-3p結(jié)合位點野生型LINC00958序列，MUT：與miR-129-2-3p結(jié)合位點突變型LINC00958序列，Control：對照序列，miR-129-2-3p：miR-129-2-3p mimics。*P<0.05。

A.ENCORI數(shù)據(jù)庫分析miR-129-2-3p在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，Tumor：子宮內(nèi)膜癌組織，Normal：正常子宮內(nèi)膜組織；B.RT-qPCR檢測MEG3和HEC-1B細(xì)胞經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-129-2-3p mimics和對照序列后miR-129-2-3p的表達(dá)；C.CCK8實驗檢測MEG3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-129-2-3p mimics和對照序列24 h、48 h和72 h后細(xì)胞增殖能力；D.CCK8實驗檢測HEC-1B細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-129-2-3p mimics和對照序列24 h、48 h和72 h后細(xì)胞增殖能力；E.CCK8實驗檢測MEG3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-129-2-3p mimics的同時轉(zhuǎn)染LINC00958 siRNA或?qū)φ招蛄?4 h、48 h和72 h后細(xì)胞增殖能力；F.CCK8實驗檢測HEC-1B細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-129-2-3p mimics的同時轉(zhuǎn)染LINC00958 siRNA或?qū)φ招蛄?4 h、48 h和72 h后細(xì)胞增殖能力。*P<0.05，**P<0.01。

3 討 論

多項研究表明LINC00958在多種腫瘤中表達(dá)上調(diào)，包括乳腺癌[12]、肝細(xì)胞癌[13]、膠質(zhì)瘤[14]等，但LINC00958在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)尚不清楚。本研究首先采用在線數(shù)據(jù)庫GEPIA和ENCORI分析了LINC00958在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)顯著高于正常子宮內(nèi)膜組織，但其表達(dá)與患者臨床分期無關(guān)，在Ⅰ至Ⅳ期患者組織中的表達(dá)無差異。為了進(jìn)一步明確LINC00958在子宮內(nèi)膜癌中臨床檢測的意義，本研究采用Kaplan-Meier plotter數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)LINC00958高表達(dá)患者的總生存率和無病生存率均高于低表達(dá)患者，說明LINC00958在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)與患者預(yù)后呈正相關(guān)。由于沒有對子宮內(nèi)膜癌患者進(jìn)行分子分型，因此并不清楚LINC00958在ER陽性和陰性的患者中的表達(dá)差異及對兩組患者預(yù)后的影響，也不清楚LINC00958在POLE熱點突變、MSI穩(wěn)定、p53野生型與突變型患者中的表達(dá)差異和對患者預(yù)后的影響。

研究證實，lncRNA表達(dá)失調(diào)可促進(jìn)或抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖。Jian F等發(fā)現(xiàn)SOCS2-AS1可通過降解AURKA抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖[15]，抑制lncRNA SNHG9可抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖和糖酵解[16]，LINC00461通過靶向miR-219-5p/COX2信號軸促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞生長和遷移[17]，說明lncRNA在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮重要作用。本研究前期通過抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中LINC00958的表達(dá)，采用CCK8檢測細(xì)胞增殖情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抑制LINC00958可顯著抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞MEG3和HEC-1B的增殖，結(jié)果表明LINC00958同樣參與了子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的調(diào)控。

lncRNA發(fā)揮作用的機制之一就是吸附miRNA，釋放miRNA靶基因。有數(shù)項研究已證實LINC00958可與多個miRNA結(jié)合，參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控，如：miR-185-5p[18]、miR-5095[10]、miR-627-5p[19]等。為了明確LINC00958在子宮內(nèi)膜癌中調(diào)控增殖的作用機制，本研究首先采用ENCORI在線軟件預(yù)測了能可以LINC00958結(jié)合的miRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-129-2-3p可能與LINC00958結(jié)合，然后雙熒光素酶報告分析證實兩者在子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中可結(jié)合，但兩者表達(dá)不相關(guān)，說明LINC00958僅能吸附miR-129-2-3p，但不能調(diào)控其表達(dá)，而miR-129-2-3p也不能調(diào)控LINC00958的表達(dá)。為了進(jìn)一步證明miR-129-2-3p是否參與LINC00958對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的調(diào)控，本研究采用CCK8實驗證實在過表達(dá)miR-129-2-3p的同時抑制LINC00958，可更大程度抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖，說明LINC00958通過吸附miR-129-2-3p發(fā)揮調(diào)控子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞增殖的作用。

本研究初步闡明了LINC00958在子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)、臨床意義及通過吸附miR-129-2-3p調(diào)控細(xì)胞增殖的作用機制。在子宮內(nèi)膜癌中，LINC00958吸附miR-129-2-3p后可對哪些基因和信號通路產(chǎn)生影響，仍有待進(jìn)一步研究。