葉夢(mèng)婷，周佩燕

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第五醫(yī)院，廣東 廣州 519000；2.廣州市白云區(qū)第三人民醫(yī)院，廣東 廣州 510000)

神經(jīng)母細(xì)胞瘤(Neuroblastoma，NB)是兒童最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1,2]。神經(jīng)母細(xì)胞瘤起源于原始的神經(jīng)脊細(xì)胞，惡性程度高、進(jìn)展快、預(yù)后差，在早期即容易發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。近年來(lái)，盡管對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療方式(包括手術(shù)切除、放療、化療以及分子靶向治療等)取得了很大的進(jìn)展，但是患兒的5年生存率仍低于40%，嚴(yán)重威脅患兒的身體健康[3]。因此，我們亟需篩選出神經(jīng)母細(xì)胞瘤的關(guān)鍵生物學(xué)標(biāo)志物，并闡明其在調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤的惡性增殖以及高度侵襲性的生物學(xué)機(jī)制，進(jìn)而在基因?qū)用娓深A(yù)腫瘤的惡性進(jìn)展。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LincRNA)是一種由基因組中非編碼序列轉(zhuǎn)錄生成的，其核酸序列長(zhǎng)度一般大于200個(gè)堿基，不具有翻譯成蛋白質(zhì)的能力[4,5]。研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)鏈非編碼RNA具有廣泛的組織表達(dá)譜，與編碼蛋白質(zhì)的mRNA相比較，其具有更強(qiáng)的組織和細(xì)胞表達(dá)特異性。越來(lái)越多的研究表明，LincRNA在調(diào)節(jié)惡性腫瘤細(xì)胞的增殖能力、侵襲轉(zhuǎn)移能力等多個(gè)方面發(fā)揮重要作用[6,7]。其中，linc00662就是一種能調(diào)控腫瘤細(xì)胞惡性進(jìn)展的關(guān)鍵分子標(biāo)志物，其定位于人類(lèi)染色體19q11的內(nèi)含子LincRNA，長(zhǎng)度為2085bp。近年來(lái)，linc00662已被鑒定為各種癌癥中的一種關(guān)鍵致癌基因，包括胃癌、肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌等[8-10]。然而，目前尚不清楚LincRNA00662在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及生物學(xué)效應(yīng)?；诖?，本研究主要探索LincRNA00662在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)特性及其與患兒臨床病理特征之間的關(guān)系，并進(jìn)一步研究其對(duì)正常背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 材料與方法

1.1 組織樣本信息

本研究共收集40對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織和配對(duì)的正常組織標(biāo)本，并且對(duì)其臨床病理特征進(jìn)行評(píng)價(jià)。所有參與本研究的組織樣本均購(gòu)買(mǎi)于廣州鋮銨生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人類(lèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系(SK-N-SH，IMR-32，Kelly和SH-SY5Y)和正常背根神經(jīng)節(jié)(DG)細(xì)胞均從中國(guó)上海公司ATCC獲得。將細(xì)胞系培養(yǎng)在含10%胎牛血清的McCoy’s5a培養(yǎng)基中(Gibco,Grand Island,NY ,USA)以37 ℃、5%CO2的環(huán)境培養(yǎng)。

1.3 RNA干擾

我們采用小RNA干擾技術(shù)(siRNA)以及脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Thermo Fisher) 構(gòu)建linc00662表達(dá)下調(diào)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系 (siRNA-1和siRNA-2三組)。同時(shí)用相應(yīng)的陰性對(duì)照(NC)序列(si-Control) 轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.4 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-qPCR)檢測(cè)

首先，用試劑TRIzol (Invitgen，USA)從冰凍組織和細(xì)胞系中提取總RNA，然后用PrimeScript RT Master Mix(T Akara)轉(zhuǎn)錄成cDNA。隨后，使用試劑盒SYBR PreMix Ex T AQ II Kit(T Akara)分析linc00662的表達(dá)。并以β-肌動(dòng)蛋白作為內(nèi)源性對(duì)照。本研究使用的引物下所示：linc00662,5’-CAC GCT TCT GAA ACT GGT GT-3’,5’-TGT ACA GCC TGG TGA CAG AG-3’; β-actin,5’-CGC TCT CTG CTC CTC CTG TTC-3’,5’-ATC CGT TGA CTC CGA CCT TCA C -3’.

1.5 CCK-8測(cè)定

首先，收集linc00662基因敲低的SH-SY5Y細(xì)胞株，以適當(dāng)?shù)臐舛?5×103個(gè)細(xì)胞/孔)接種于96孔板中。培養(yǎng)24、48、72、96h后，在McCoy's 5a培養(yǎng)基(CCK-8，Dojindo)中，每孔加入含10%CCK-8溶液100 μL。最后，使用微型平板讀取器(Bio-Rad,Hercules,CA,USA)讀取每孔的OD值。

1.6 流式細(xì)胞儀分析

本研究為了對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期進(jìn)行分析，采用細(xì)胞周期檢 測(cè)試劑盒(Keygen,Nanjing,China)進(jìn)行處理。并且我們采用FACSCantoII流式細(xì)胞儀(BD Biosciences)檢測(cè)處于細(xì)胞的細(xì)胞周期階段細(xì)胞百分比。

1.7 細(xì)胞遷移和侵襲性分析

本研究為了評(píng)估細(xì)胞遷移，我們將收集處理后的細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并將4×104細(xì)胞加入培養(yǎng)基 (0.8 μm; Corning,NY ,USA) 的上層并且在下層中加入含2 0%胎牛血清的McCoy5a培養(yǎng)液500 μL。24 h后用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用試劑0.1% crystal violet染色，最后使用光學(xué)顯微鏡成像觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

本研究所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示，所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。生存資料采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行分析并使用GraphPad Prism軟件(GraphPad Software,San Diego,California,USA)進(jìn)行曲線擬合分析。所有其他數(shù)據(jù)均采用Student's t-test進(jìn)行評(píng)估。當(dāng)P<0.05時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床表達(dá)與臨床參數(shù)相關(guān)性

為了進(jìn)一步探索LINC00662在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的生物學(xué)調(diào)控作用，我們首先檢測(cè)其在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織以及外周正常組織中的表達(dá)水平。qPCR結(jié)果顯示：LINC00662在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)水平明顯高于外周的正常組織(圖1，***P<0.001)。此外，我們根據(jù)LINC00662的表達(dá)水平中位數(shù)將40例患兒標(biāo)本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，并進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，結(jié)果顯示：LINC00662高表達(dá)往往與腫瘤分化程度低(P=0.008)、腫瘤分期晚(P=0.0267)以及淋巴結(jié)侵犯(P=0.011)等有著密切的聯(lián)系(表1)。這提示LINC00662有可能在神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展中擔(dān)任促癌角色。

表1 LINC00662表達(dá)水平和兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤臨床病理參數(shù)的關(guān)系

圖1 LincRNA00662在神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及外周正常組織中的表達(dá)水平，***P<0.001

2.2 神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞內(nèi)LINC00662的表達(dá)水平及LINC00662低表達(dá)的細(xì)胞模型構(gòu)建

為證實(shí)LINC00662是否與具有神經(jīng)母細(xì)胞瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，我們首先檢測(cè)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞以及正常背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中LINC00662的表達(dá)水平，qPCR結(jié)果顯示：相對(duì)于正常背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞，LINC00662在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，其中SH-SY5Y細(xì)胞在所有神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞中呈現(xiàn)相對(duì)高表達(dá)狀態(tài)(圖2A)?；诖?，我們利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建LINC00662低表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株，結(jié)果提示：相對(duì)于陰性對(duì)照組(si-Control)，siRNA轉(zhuǎn)染組(siRNA-1和siRNA-2)可顯著抑制SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)LINC00662的表達(dá)水平(圖2B)，這提示LINC00662低表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞模型被成功構(gòu)建，可用于后續(xù)的功能實(shí)驗(yàn)。

注：A.LINC00662在人類(lèi)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和正常背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中的表達(dá)水平；B.LINC00662低表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株的構(gòu)建，***P<0.001。

2.3 敲低LINC00662的表達(dá)后能顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力

無(wú)限增殖能力是所有惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，因此在本研究中我們通過(guò)CCK-8實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)一步探索LINC00662對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：下調(diào)SH-SY5Y細(xì)胞中LINC00662的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖水平較對(duì)照組顯著明顯減慢(圖3)，這說(shuō)明敲低細(xì)胞內(nèi)LINC00662的表達(dá)能顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力。

2.4 敲低LINC00662的表達(dá)后對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞周期分布的影響

為進(jìn)一步明確LINC00662對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞惡性增殖能力調(diào)控的作用機(jī)制，在本研究中我們利用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比較，敲低細(xì)胞內(nèi)LINC00662的表達(dá)后能使得S期細(xì)胞的比例明顯下降、而G2/M期的比例明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。這提示敲低LINC00662的表達(dá)能誘導(dǎo)更多的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，進(jìn)而抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤的惡性增殖能力。

2.5 敲低LINC00662的表達(dá)后能顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移能力

為了進(jìn)一步探究LINC00662對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，在本研究中我們還進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比較，siRNA-1和siRNA-2組的細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移數(shù)目均顯著減少(圖5)，這說(shuō)明敲低LINC00662表達(dá)后能顯著抑制細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力。

注：***P<0.001。

si-ControlsiRNA-1siRNA-2100080060040020001000800600400200010008006004002000204060801002000si-ControlsiRNA-1siRNA-26040200CellcycledistributionG1G2/MSDpG1DpG2DpSDpG1DpG2DpSDpG1DpG2DpS***********204060801002000204060801002000

注：***P<0.001。

3 討 論

神經(jīng)母細(xì)胞瘤是嬰兒與兒童最常見(jiàn)的顱外實(shí)體腫瘤[3]。近年來(lái)，隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)水平的提高和人們生活方式的改變，兒童的神經(jīng)母細(xì)胞瘤的患病率呈逐年增加的趨勢(shì)，已經(jīng)成為威脅兒童生命安全的重要疾病[11]。在日常診療中，神經(jīng)母細(xì)胞瘤起病隱匿、早期癥狀不明顯、極易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[12]，盡管神經(jīng)母細(xì)胞瘤的的早期篩查、診斷及治療方面取得了較明顯的進(jìn)展，但患兒的5年生存率仍處于較低的水平。其實(shí)，腫瘤的惡性演變過(guò)程是一個(gè)多因素、長(zhǎng)期累積突變的過(guò)程，闡明其發(fā)生機(jī)制可能為兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療帶來(lái)新的希望。隨著高通量測(cè)序技術(shù)及分子生物學(xué)的進(jìn)步，尋找神經(jīng)母細(xì)胞瘤的關(guān)鍵調(diào)控靶標(biāo)成為了可能，這將為臨床決策提供關(guān)鍵性的指導(dǎo)作用。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA在染色體構(gòu)象、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)控等多個(gè)過(guò)程起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，并參與惡性腫瘤的增殖、周期和侵襲轉(zhuǎn)移等生物過(guò)程[13]。隨著對(duì)長(zhǎng)鏈非編碼RNA分子研究的不斷深入，我們發(fā)現(xiàn)許多LincRNA的表達(dá)具有高度的組織特異性，有望成為惡性腫瘤的潛在生物學(xué)標(biāo)志為，具有巨大的應(yīng)用前景[14,15]。其中，linc00662是一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控分子，主要定位于人類(lèi)染色體19q11的內(nèi)含子上。Wang等人發(fā)現(xiàn)LINC00662在脊髓瘤的惡性進(jìn)展中起著重要的調(diào)控作用，其主要通過(guò)調(diào)控miR-16-5p/RNF44B信號(hào)軸促進(jìn)脊髓瘤細(xì)胞增殖、集落形成以及侵襲轉(zhuǎn)移的發(fā)生[16]。此外，Yao等人發(fā)現(xiàn)抑制細(xì)胞內(nèi)LINCRNA00662的表達(dá)后，能通過(guò)調(diào)控miR-145/c-myc軸抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖能力、誘導(dǎo)更多的結(jié)直腸癌細(xì)胞發(fā)生凋亡[17]。然而，迄今為止，LINC00662在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)方式和生物學(xué)功能尚不清楚，有待進(jìn)一步的探索。

基于此，為明確LINC00662在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的生物學(xué)調(diào)控作用，在本研究中我們首先通過(guò)RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)并分析了40例配對(duì)的兒童神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織及外周正常組織標(biāo)本中LINC00662的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中LINC00662的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。此外，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果也一致表明，LINC00662的高表達(dá)狀態(tài)往往預(yù)示著患兒腫瘤分化程度低、腫瘤分期晚以及淋巴結(jié)侵犯。由此可進(jìn)一步推測(cè)，對(duì)于神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒，LINC00662的表達(dá)水平越高意味著患兒的預(yù)后差、死亡率高，這提示LINC00662有可能在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中起促癌作用。

為進(jìn)一步明確LINC00662的生物學(xué)作用，我們通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)成功構(gòu)建了LINC00662過(guò)表達(dá)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞模型。研究結(jié)果提示，抑制細(xì)胞內(nèi)LINC00662的表達(dá)后能顯著抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖能力，但其機(jī)制尚不明確。既往研究發(fā)現(xiàn)，LincRNA的表達(dá)調(diào)控能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞增殖周期阻滯進(jìn)而影響細(xì)胞增殖水平[18-19]。Li等研究人員發(fā)現(xiàn)lncRNA CASC11能通過(guò)調(diào)控miR-340-5p/CDK1信號(hào)軸，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯，抑制胃癌細(xì)胞增殖[20]。因此，在本研究中，我們通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期的分布情況。有趣的是，研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)細(xì)胞內(nèi)LINC00662能誘導(dǎo)更多的神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞增殖抑制效應(yīng)。同時(shí)，侵襲轉(zhuǎn)移特性強(qiáng)是神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的重要生物學(xué)特征。因此，在本研究中，我們利用Transwell實(shí)驗(yàn)探索LINC00662對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)敲低細(xì)胞內(nèi)LINC00662的表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力。

綜上所述，LINC00662在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中呈高表達(dá)狀態(tài)，下調(diào)其的表達(dá)能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、抑制細(xì)胞增殖能力以及侵襲轉(zhuǎn)移能力，進(jìn)而發(fā)揮抑癌作用。LINC00662有望成為神經(jīng)母細(xì)胞瘤治療的潛在預(yù)測(cè)指標(biāo)及治療靶點(diǎn)，通過(guò)干擾其表達(dá)能最大程度的改善神經(jīng)母細(xì)胞瘤患兒的臨床預(yù)后。