王錦,張強(qiáng)*,張松,孫紅,黃巖

(1.蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科， 2.腫瘤外科，安徽 蚌埠 233000)

前列腺素(prostaglandin，PG)是花生四烯酸的生物活性內(nèi)源性代謝物家族，具有多種生理功能，包括調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥、細(xì)胞生長和分化。前列腺素D2(PGD2)是其中一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子[1]。PGD2合酶有兩種不同的同工型，即造血型和脂環(huán)蛋白型(L-PGDS)，L-PGDS是主要集中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)表達(dá)的一種分泌蛋白；PGD2受體2(PTGDR2)主要在嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞和Th2淋巴細(xì)胞中表達(dá)[2]。有研究結(jié)果表明，PGD2可抑制癌癥細(xì)胞的遷移和侵入，與肺癌和結(jié)腸癌血管生成有關(guān)，但國內(nèi)有關(guān)PGD2在胃癌中的表達(dá)及作用的研究不多[3]。本研究旨在探討L-PTGDS和PTGDR2在胃癌患者組織中的表達(dá)水平及其與臨床病理特征的相關(guān)性，有望能揭示胃癌新的治療靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2020年10月蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院收治的胃癌手術(shù)患者為研究對象，排除晚期復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、肝腎功能障礙及術(shù)前接受化療治療患者。最終納入68例，其中男35例，女33例；年齡40～78歲，平均年齡(56.19±9.98)歲。患者及家屬均知情本研究內(nèi)容并簽署同意書，本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批。

1.2 實驗方法

1.2.1標(biāo)本取樣及處理 于患者行胃癌術(shù)中收集胃癌組織和及其癌旁正常組織標(biāo)本(距離癌組織邊緣>5 cm)，所有標(biāo)本經(jīng)病理檢查，去除標(biāo)本壞死組織后以10%的中性甲醛進(jìn)行固定和保存。

1.2.2實時熒光定量PCR 儀器采用CFX-96熒光定量PCR儀及其配套試劑盒，配制PCR反應(yīng)體系。組織細(xì)胞總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄后，取l μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物分裝入定量管中，加入1 μL cDNA，瞬離，使管內(nèi)液體沉淀，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。設(shè)置反應(yīng)條件及參數(shù)，根據(jù)反應(yīng)的CT值，以β-actin作為對照，利用2-ΔΔCt法計算L-PTGDS和PTGDR2基因的相對表達(dá)水平。

1.2.3免疫組化 將脫蠟的4 μm厚切片與1%過氧化氫的甲醇溶液溫育30 min，用0.1%Triton X-100和3%的牛血清白蛋白在PBS溶液中處理15 min。一抗在4 ℃下處理過夜。洗滌后，將二抗處理3 h，然后與抗生物素蛋白-生物素過氧化物酶復(fù)合物反應(yīng)。反應(yīng)后，將切片用含有0.033%過氧化氫的0.02%3，3′-二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽溶液處理。蘇木精復(fù)染3～5 min，30%蔗糖中脫水24 h脫水后在組織芯片上面滴入封固液以進(jìn)行組織芯片封片，在400倍放大率下在顯微鏡下在4個隨機(jī)選擇的視野中對細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)。

1.3 結(jié)果判斷

免疫組化陽性結(jié)果著色一般為黃色或棕黃色，把陽性信號的強(qiáng)度及頻度作為評價免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果的指標(biāo)，陽性強(qiáng)度(0～3)：陰性(0)、弱陽性(1)、陽性(2)及強(qiáng)陽性(3)；陽性頻率(0～4)：0%(0)、1%～25%(1)、26%～50%(2)、51%～75%(3)、76%～100%(4)。根據(jù)免疫組織化學(xué)檢測的結(jié)果綜合評分，分為4種程度：0分為陰性(-)、1～4分弱陽性(+)、5～8為陽性(++)、9～12分為強(qiáng)陽性(+++)[4]。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗進(jìn)行比較，計數(shù)資料以例(%)表示，采用χ2檢驗進(jìn)行比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌組織和癌旁正常組織中L-PTGDS、PTGDR2基因相對表達(dá)量比較

胃癌組織L-PTGDS與PTGDR2相對表達(dá)量低于癌旁正常組織，兩組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 胃癌組織和癌旁正常組織中L-PTGDS、PTGDR2的相對表達(dá)量比較

2.2 胃癌組織和癌旁正常組織中L-PTGDS、PTGDR2表達(dá)情況比較

胃癌組織中L-PTGDS與PTGDR2陽性表達(dá)率均高于癌旁正常組織，兩組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 胃癌組織和癌旁正常組織中L-PTGDS、PTGDR2表達(dá)情況比較[n(%)，n=68]

2.3 胃癌組織L-PTGDS、PTGDR2表達(dá)情況與臨床病理特征的相關(guān)性

不同性別、年齡及分化程度的胃癌組織L-PTGDS、PTGDR2蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同腫瘤大小、TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者的胃癌組織L-PTGDS、PTGDR2蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見表 3。

表3 胃癌組織L-PTGDS、PTGDR2表達(dá)情況與臨床病理特征的相關(guān)性 [n(%)]

3 討 論

胃癌是消化道最常見的惡性腫瘤，目前臨床上以化學(xué)治療為主，但由于大多數(shù)胃癌患者在診斷時已處于疾病晚期，治療效果并不理想[5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，越來越多地研究表明，癌癥雖然具有共同的臨床表現(xiàn)，但其基因組具有巨大的復(fù)雜性[6]。進(jìn)行胃癌基因分子學(xué)的研究，可對該病的診斷與治療帶來潛在影響。

L-PTGDS影響PGD2的分泌，而PTGDR2是PGD2的受體之一。有研究顯示PGD2可抑制AGS細(xì)胞的生長，PGD2代謝物15-脫氧Δ12-14-PGJ2抑制胃癌細(xì)胞系的細(xì)胞生長和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[7～9]。為了確定L-PTGDS和PTGDR2在胃癌中的表達(dá)，本研究首先收集患者胃癌組織及胃旁正常組織，結(jié)果顯示，胃癌組織中的L-PTGDS和PTGDR2 相對表達(dá)水平均低于其對應(yīng)的胃旁正常組織，且L-PTGDS和PTGDR2 的表達(dá)水平顯示出相似的趨勢，這說明兩組基因的低表達(dá)可能參與著抑制了癌癥細(xì)胞的集落形成和遷移。Zhang等[10]的研究表明，L-PTGDS和PTGDR2對胃癌生物學(xué)功能的抑制作用可以通過PGD2/PTGDR2信號傳導(dǎo)來完成，L-PTGDS和PTGDR2在PGD2誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞抑制中的關(guān)鍵作用。另外，胃癌組織中L-PTGDS與PTGDR2陽性表達(dá)率分別為72.06%和77.94%，明顯高于胃旁正常組織，進(jìn)一步研究其分別與臨床病例特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示，L-PTGDS與PTGDR2陽性表達(dá)情況與腫瘤大小、TNM分期、胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移具有顯著相關(guān)性，這提示L-PTGDS與PTGDR2可能參與著腫瘤的生長、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等生物過程。我們推測，L-PTGDS和PTGDR2在體內(nèi)抑制了腫瘤的發(fā)生、生長和轉(zhuǎn)移，且可能通過PGD2/PTGDR2信號傳導(dǎo)在體外限制了胃癌細(xì)胞的自我更新，PGD2具有抑制細(xì)胞生長的能力，是胃癌治療的重要潛在靶標(biāo)。但是，目前有關(guān)PGD2控制胃癌細(xì)胞增殖的具體機(jī)制尚不清楚，且本研究僅限于體內(nèi)，有關(guān)PGD2在胃癌細(xì)胞株中的生物學(xué)功能實驗將在今后繼續(xù)開展。

綜上所述，L-PTGDS和PTGDR2在胃癌組織中的基因表達(dá)量明顯降低，且其蛋白陽性表達(dá)情況與腫瘤大小、TNM分期、胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)，L-PTGDS和PTGDR2在胃癌組織中的低表達(dá)可能導(dǎo)致外周血中PGD2表達(dá)降低，外周血中PGD2水平有望成為胃癌診斷中的新指標(biāo)。