解恒昌，付小雨，沈偉

上?？萍即髮W(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 201210

北京時(shí)間2021年10月4日，2021年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)評(píng)選結(jié)果揭曉。諾貝爾獎(jiǎng)委員會(huì)宣布將今年的諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予戴維·朱利葉斯(David Jay Julius)和阿登·帕塔普蒂安(Ardem Patapoutian)以表彰他們?cè)凇鞍l(fā)現(xiàn)溫度和觸覺感受器”方面作出的巨大貢獻(xiàn)。本文對(duì)辣椒素受體TRPV1和機(jī)械力受體PIEZO的發(fā)現(xiàn)過程及最新進(jìn)展作以綜述。

1 TRPV1與PIEZO的發(fā)現(xiàn)

感知和適應(yīng)環(huán)境的能力對(duì)于所有生物體的生存都是必不可少的，觸覺、本體感覺、溫度感覺使生物體能夠感受外界環(huán)境和自身狀態(tài)，在復(fù)雜的自然環(huán)境中存活。發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)這些感覺的受體，是解碼這些感覺的基礎(chǔ)，并可促進(jìn)人們對(duì)痛覺和本體感覺異常疾病的理解。

戴維·朱利葉斯出生于1955年，先后在麻省理工學(xué)院和加州大學(xué)伯克利分校獲得本科和博士學(xué)位，隨后在哥倫比亞大學(xué)諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)獲得者理查德·阿克塞爾(Richard Axel)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行博士后訓(xùn)練。朱利葉斯在博士后期間利用表達(dá)克隆技術(shù)鑒定了5-羥色胺1C受體。他將體外克隆的候選cDNA導(dǎo)入非洲爪蟾的卵母細(xì)胞中進(jìn)行異源表達(dá)，驗(yàn)證表達(dá)細(xì)胞對(duì)5-羥色胺的敏感性，最終發(fā)現(xiàn)了5-羥色胺1C受體[1]。

1989年，朱利葉斯在加州大學(xué)舊金山分校建立了自己的實(shí)驗(yàn)室。由于對(duì)“自然界中的天然物質(zhì)如何與人類受體相互作用”這一科學(xué)問題的興趣，朱利葉斯逐漸從對(duì)5-羥色胺受體研究轉(zhuǎn)向克隆辣椒素受體。他認(rèn)為對(duì)辣椒素受體作用的深入探究有助于科學(xué)家對(duì)痛覺更深入地了解。朱利葉斯與他的博士后研究員邁克爾·凱瑟琳(Michael J. Caterina)進(jìn)行了候選文庫(kù)的克隆表達(dá)和篩選。他們用嚙齒動(dòng)物的背根神經(jīng)節(jié)制作了cDNA文庫(kù)，使用這些cDNA分批次轉(zhuǎn)入對(duì)辣椒素不敏感的細(xì)胞，最終分離出單個(gè)的cDNA克隆，將它轉(zhuǎn)入細(xì)胞可以使原本對(duì)辣椒素沒有反應(yīng)的細(xì)胞對(duì)辣椒素產(chǎn)生反應(yīng)，并將其命名為香草素受體1(VR1)[2](圖1)。隨后的功能實(shí)驗(yàn)中，朱利葉斯等發(fā)現(xiàn)該受體對(duì)溫度敏感，高熱量導(dǎo)致表達(dá)該受體的細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，其激活閾值大于40°C，接近于熱痛。至此，朱利葉斯鑒定出辣椒素受體TRPV1，并建立起該受體與溫度感受和痛覺的聯(lián)系。在小鼠中，TRPV1在傷害性神經(jīng)元中表達(dá)，并被證實(shí)參與感受傷害性疼痛及炎癥性痛覺過敏[3]。隨后，朱利葉斯實(shí)驗(yàn)室通過類似的方法還鑒定了薄荷醇受體TRPM8，并發(fā)現(xiàn)其同時(shí)也是感應(yīng)冷刺激(<15°C)的受體[4]。

圖1 辣椒素受體TRPV1的發(fā)現(xiàn)[2]。(a)用cDNA克隆庫(kù)轉(zhuǎn)染的HEK293細(xì)胞。在DRG-11池中，一些細(xì)胞對(duì)辣椒素有反應(yīng)。經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，鑒定了一個(gè)對(duì)應(yīng)于TRPV1(VR1)的克隆。(b)表達(dá)VR1的卵母細(xì)胞對(duì)辣椒素(10 μmol/L)和4種辣椒提取物的反應(yīng)

阿登·帕塔普蒂安出生于1967年，曾在黎巴嫩的貝魯特美國(guó)大學(xué)學(xué)習(xí)化學(xué)，而后在加州大學(xué)洛杉磯分校獲得細(xì)胞和發(fā)育生物學(xué)學(xué)士學(xué)位，在加州理工學(xué)院獲得發(fā)育生物學(xué)博士學(xué)位。他在加州大學(xué)舊金山分校完成了博士后階段的工作后，于2000年加入斯克里普斯研究所(The Scripps Research Institute)。

帕塔普蒂安在事業(yè)發(fā)展的早期也加入溫度受體的研究，曾與朱利葉斯實(shí)驗(yàn)室同時(shí)分別發(fā)現(xiàn)了冷覺受體TRPM8[5]。隨后，帕塔普蒂安開始關(guān)注更為復(fù)雜的機(jī)械力感受機(jī)制。他和他的博士后伯特蘭·科斯特(Bertrand Coste)首先篩選確定Neuron2A細(xì)胞系可以感受機(jī)械壓力，并對(duì)其表達(dá)基因進(jìn)行分析。他們確定了72個(gè)候選基因，并對(duì)候選基因進(jìn)行RNA干擾以分別沉默這些基因的表達(dá)，對(duì)沉默后的細(xì)胞系進(jìn)行壓力測(cè)試并使用膜片鉗記錄其電流。最終，他們發(fā)現(xiàn)使用RNA沉默的辦法敲除FAM38A基因可以消除機(jī)械力激活的電流，該基因表達(dá)的蛋白被命名為PIEZO1(希臘語(yǔ)為壓力的意思)[6](圖2)。將PIEZO1表達(dá)在人胚胎腎細(xì)胞細(xì)胞系(HEK-293)中，可以使原本對(duì)機(jī)械力不敏感的細(xì)胞產(chǎn)生機(jī)械力敏感電流。隨后根據(jù)PIEZO1同源分析又發(fā)現(xiàn)了第二個(gè)機(jī)械力敏感通道PIEZO2[6]。PIEZO2在背根神經(jīng)節(jié)感覺神經(jīng)元中表達(dá)，隨后在轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)敲除PIEZO2的小鼠缺乏輕觸感覺。此外，PIEZO2還參與小鼠本體感受，缺失會(huì)導(dǎo)致小鼠運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)和肢體位置異常。至此，帕塔普蒂安等鑒定出了一種全新的脊椎動(dòng)物機(jī)械力敏感通道，并確認(rèn)它們?cè)跈C(jī)體觸覺和本體感覺中的關(guān)鍵性作用。

自此，以朱利葉斯和帕塔普蒂安兩位科學(xué)家為首的科研團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了溫度感覺和觸覺的關(guān)鍵受體，其中TRP通道是介導(dǎo)溫度感覺和相關(guān)痛覺的核心，PIEZO通道是機(jī)體具有觸覺和本體感覺的關(guān)鍵。兩位科學(xué)家的工作拓展了感覺神經(jīng)生物學(xué)的維度，揭示了機(jī)體感知世界的生物學(xué)基礎(chǔ)，解開了軀體感覺如何讓我們感受物理世界并與之互動(dòng)的未解之謎。在朱利葉斯和帕塔普蒂安的工作基礎(chǔ)上，科學(xué)家對(duì)機(jī)體溫度感覺和觸覺的了解不斷加深，在這一領(lǐng)域涌現(xiàn)出大量的研究成果?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，除了作為光、溫度和疼痛的感受器外，擁有7個(gè)亞族的TRP通道家族也在呼吸系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)疾病如哮喘、心衰等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，并在前列腺癌等多種癌癥的遷移以及中風(fēng)、皮膚病等多種疾病中被報(bào)道有所參與[7]。而PIEZO家族在終端觸覺、本體感覺中發(fā)揮重要作用，并通過分布在血管和肺部的神經(jīng)末梢感知壓力，影響紅細(xì)胞體積和血管生理功能，引發(fā)多種人類遺傳疾病[8](詳見第2部分)。此外，科學(xué)家還依據(jù)TRP和PIEZO的結(jié)構(gòu)和功能開展了痛覺和本體感覺失調(diào)疾病的藥物研發(fā)[8-9](詳見第3部分)。

2 TRP蛋白與PIEZO蛋白的研究進(jìn)展

TRP家族首次在果蠅光感受突變體中被鑒定，都由6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域組成，它們組成四聚體復(fù)合物發(fā)揮功能，可分為TRPC、TRPV、TRPM、TRPN、TRPA亞家族及進(jìn)化距離更遠(yuǎn)的TRPP及TRPML亞家族[10-11]。TRP蛋白家族進(jìn)化上保守，在果蠅、線蟲、斑馬魚、嚙齒類動(dòng)物及靈長(zhǎng)類動(dòng)物中，對(duì)視覺、味覺、機(jī)械感覺、溫度感覺都有重要的作用。TRPV1蛋白結(jié)構(gòu)是使用冷凍電鏡解析的第一個(gè)膜蛋白結(jié)構(gòu)，由朱利葉斯和程亦凡實(shí)驗(yàn)室在2013年合作完成[12-13]。冷凍電鏡解析蛋白結(jié)構(gòu)表明，TRPV1有兩個(gè)離子通過位點(diǎn)，在陽(yáng)離子傳導(dǎo)孔的兩端形成兩個(gè)突出的物理結(jié)構(gòu)，辣椒素的結(jié)合位點(diǎn)位于靠近細(xì)胞質(zhì)側(cè)的膜深處的口袋。最近的一項(xiàng)結(jié)構(gòu)研究表明，有害熱量會(huì)在辣椒素結(jié)合的TRPV1通道中產(chǎn)生兩種構(gòu)象門控轉(zhuǎn)變：第一個(gè)過渡態(tài)為通道打開做好準(zhǔn)備，而第二個(gè)過渡態(tài)導(dǎo)致通道打開[14]。

除TRPV1外，其中至少7種TRP蛋白被證明在哺乳動(dòng)物溫度感應(yīng)中發(fā)揮作用，展現(xiàn)出不同的溫度閾值，被稱為thermoTRP[15]。TRPV1表達(dá)在背根神經(jīng)節(jié)和所發(fā)出的C類神經(jīng)纖維中，還表達(dá)于支配膀胱和氣道的感覺纖維和下丘腦中[10,16-20]。敲除TRPV1的小鼠可以完全抑制辣椒素引起的傷害性痛覺，但是對(duì)低度熱的響應(yīng)基本完整，只有傷害性高熱才存在差異。因此TRPV1并不能完全解釋熱感受現(xiàn)象，必然還存在著其他的熱感應(yīng)機(jī)制。Vriens等人[21]報(bào)道了TRPM3作為有害熱量的感受器之一，然而在敲除TRPV1和TRPM3的小鼠中，有害熱的反射并沒有完全消除。最終，Vandewauw等人[22]發(fā)現(xiàn)TRPM3/TRPV1/TRPA1的三敲除小鼠基本失去了對(duì)傷害性熱刺激的響應(yīng)。與TRPV1形成鮮明對(duì)比的是，TRPM8敲除小鼠完全失去了辨別中等低溫(10～26°C)的能力，說明此單一通道足以介導(dǎo)此溫度范圍的感受現(xiàn)象[23]。此外，另外的幾個(gè)thermoTRP被認(rèn)為也可以感受熱：TRPV2在高熱環(huán)境下被激活(52°C)，TRPV3和TRPV4在溫暖環(huán)境中激活(33°C和27～42°C)[24-27](圖3)。thermoTRP在外周及中樞神經(jīng)中如何參與溫度感應(yīng)和反饋性調(diào)節(jié)體溫也是當(dāng)前神經(jīng)生物學(xué)和生理學(xué)關(guān)注的重要焦點(diǎn)問題。

圖3 溫度瞬時(shí)受體電位(TRP)通道[27]。從結(jié)構(gòu)上講，thermoTRP是四聚體，每個(gè)亞基包含6個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域(S1～S6)、1個(gè)連接跨膜S5和S6的疏水孔環(huán)，以及細(xì)胞質(zhì)側(cè)的N-和C-末端。除了TRPM8，所有thermoTRP在N端都具有可變數(shù)量的錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域。thermoTRP顯示出從有害的寒冷(TRPA1)到有害高溫(TRPV2)的不同熱閾值。每個(gè)thermoTRP也被特定的天然或合成化合物激活，會(huì)誘導(dǎo)人類產(chǎn)生相關(guān)的熱感和疼痛感

PIEZO1是迄今為止鑒定出的最大的跨膜離子通道亞基。帕塔普蒂安、楊茂君、肖百龍、李雪明、羅德里克·麥金農(nóng)(Roderick MacKinnon)等實(shí)驗(yàn)室的工作揭示了PIEZO1和PIEZO2的高分辨率結(jié)構(gòu)，并表明這些通道形成具有中心離子傳導(dǎo)孔和三個(gè)外圍大型機(jī)械傳感螺旋槳形葉片的同三聚體結(jié)構(gòu)[28-29]。當(dāng)對(duì)膜施加機(jī)械力時(shí)，彎曲的葉片變平并導(dǎo)致中心孔的開口，帶有彎曲葉片的螺旋槳狀結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大的平面內(nèi)膜面積膨脹，從而感知到精細(xì)機(jī)械力[30-31]。

帕塔普蒂安的實(shí)驗(yàn)室在發(fā)現(xiàn)PIEZO1與PIEZO2之后的10年里，在小鼠與人中對(duì)這兩個(gè)機(jī)械力敏感的離子通道蛋白的功能進(jìn)行了多方面的研究。PIEZO1在血管發(fā)育與重塑以及血壓調(diào)節(jié)中有重要作用，參與淋巴瓣形成，調(diào)節(jié)角質(zhì)形成、細(xì)胞遷移和傷口愈合。PIEZO1將機(jī)械力與紅細(xì)胞體積聯(lián)系起來，非洲人群中常見的piezo1等位基因E275del可導(dǎo)致紅細(xì)胞脫水并減輕瘧原蟲感染。PIEZO1的功能獲得性突變會(huì)導(dǎo)致脫水遺傳性口型紅細(xì)胞增多癥，并且個(gè)體可能會(huì)隨著年齡增長(zhǎng)出現(xiàn)鐵過載癥狀。PIEZO1的功能喪失性突變與常染色體隱性遺傳淋巴管發(fā)育不良有關(guān)。PIEZO2在膀胱尿路上皮和支配感覺神經(jīng)元中都充當(dāng)傳感器。PIEZO2是一種氣道拉伸傳感器，它所介導(dǎo)的氣道支配感覺神經(jīng)元內(nèi)的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)對(duì)于在出生時(shí)建立有效的呼吸和維持成人的正常呼吸至關(guān)重要。若PIEZO2發(fā)生功能獲得性突變，會(huì)導(dǎo)致一種遠(yuǎn)端關(guān)節(jié)彎曲疾病亞型。PIEZO蛋白的詳細(xì)功能介紹及突變可能導(dǎo)致的疾病見表1。如何以PIEZO分子為突破口理解人類本體等多種復(fù)雜機(jī)械力的感受機(jī)制，以及如何利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)理解PIEZO相關(guān)突變的致病機(jī)制是當(dāng)前研究的重要熱點(diǎn)。

表1 PIEZO蛋白的表達(dá)與功能[8]

3 TRPV1和PIEZO的藥物研發(fā)

當(dāng)前治療疼痛的藥物市場(chǎng)仍然由已經(jīng)存在了幾十年的藥物主導(dǎo)，慢性疼痛的治療常常不能令人滿意。如阿片類藥物雖然是有效的止痛藥，但作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，也會(huì)使人上癮。避免阿片類藥物副作用的合理策略是針對(duì)疼痛通路的起點(diǎn)——產(chǎn)生疼痛的傷害感受器研發(fā)新藥[32]。因此，制藥公司對(duì)響應(yīng)有害刺激的TRP通道表現(xiàn)出極大的興趣。高劑量的辣椒素和位點(diǎn)特異性注射被臨床證明在骨關(guān)節(jié)炎患者、帶狀皰疹后神經(jīng)痛和糖尿病多發(fā)性疼痛患者中有緩解疼痛的作用。但由于辣椒素會(huì)引發(fā)強(qiáng)烈的初始疼痛反應(yīng)，并會(huì)引起體溫改變[33]，限制了患者的耐受劑量[34]。為了減少這種不利影響，已經(jīng)開發(fā)了“非刺激性”TRPV1激動(dòng)劑，如olvanil (NE19550)和MRD-652，它們?cè)谑荏w的激活動(dòng)力學(xué)方面與辣椒素不同[35-36]。這些化合物顯示在疼痛的動(dòng)物模型中是有效果的，但其臨床價(jià)值仍有待證明。此外，TRPV1、TRPA1及TRPV4在呼吸系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，被認(rèn)為參與哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)的病理過程[37-38]。一種口服的、生物可利用的小分子TRPA1選擇性拮抗劑GDC-0334在呼吸系統(tǒng)疾病的臨床前模型中可以抑制幾種物種的咳嗽反應(yīng)、氣道平滑肌高反應(yīng)性和水腫形成，但其臨床效果有待試驗(yàn)驗(yàn)證[39]。此外，TRPV1拮抗劑PAC-14028(現(xiàn)處于III期臨床試驗(yàn)階段)可改善皮膚屏障功能并緩解特應(yīng)性皮炎患者的瘙癢[40]。遺傳失活(Trpv1-/-小鼠)或小分子拮抗劑BCTC291對(duì)TRPV1的藥理阻斷，均可使口服葡萄糖耐量和葡萄糖刺激的胰島素分泌得到改善。TRPV1拮抗劑XEN-D0501目前正在2型糖尿病(T2DM)患者中進(jìn)行II期臨床試驗(yàn)，具有良好的耐受性和安全性[41]。

PIEZO1和PIEZO2的非特異性阻滯劑包括RR、釓(Gd3+)以及肽毒素 GsMTx-4。2015年，帕塔普蒂安實(shí)驗(yàn)室篩選到了PIEZO1的第一個(gè)激動(dòng)劑Yoda1[42]。3年后，肖百龍實(shí)驗(yàn)室篩選到了PIEZO1的另外兩種激動(dòng)劑Jedi1和Jedi2[43]。而PIEZO2因?yàn)槠淇焖偈Щ畹膭?dòng)力學(xué)特性仍未找到特異性激動(dòng)劑?？偟膩碚f，當(dāng)前機(jī)械力敏感受體的藥理學(xué)研究仍處于起步階段，缺乏高特異性的激動(dòng)劑和拮抗劑，然而這對(duì)于機(jī)械力敏感受體相關(guān)的藥物開發(fā)是至關(guān)重要的。鑒于PIEZO1在各種組織和細(xì)胞類型中廣泛的生物學(xué)作用，一個(gè)明顯的挑戰(zhàn)是如何在實(shí)現(xiàn)理想治療效果的同時(shí)限制副作用。至于PIEZO2，雖然目前的研究表明它在外周感覺系統(tǒng)中的作用相對(duì)有限，但它參與多種基本的體感功能，這也可能對(duì)實(shí)現(xiàn)機(jī)械性異常性疼痛的特異性抑制提出挑戰(zhàn)。識(shí)別PIEZO2介導(dǎo)其特定功能的感覺神經(jīng)元類型可能會(huì)提高細(xì)胞靶向的特異性，而外用PIEZO2拮抗劑可能是專門治療機(jī)械性異常性疼痛的一種選擇。

4 結(jié)語(yǔ)

2021年度諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的工作是繼1914年“前庭器官的生理和病理方面工作”、1967年“視黃醛參與視覺形成機(jī)制的詮釋”、2004年“人體氣味受體和嗅覺系統(tǒng)組織方式的研究”后，又一次獲得諾貝爾獎(jiǎng)的感覺神經(jīng)生物學(xué)領(lǐng)域的研究。兩位科學(xué)家的出色工作發(fā)現(xiàn)了溫度感覺與觸覺這兩種極為重要但又“非經(jīng)典的”(不依賴于某一特定器官)感覺受體。其鑒定出的分子如TRPV1、TRPM8、PIEZO1、PIEZO2等蛋白作為分子開關(guān)，打開了解碼人類溫度、痛覺和機(jī)械力感覺等相關(guān)生理過程的大門。它們所介導(dǎo)的生理和病理功能正在被一一闡釋。其他相關(guān)的重要科學(xué)問題，如人體的體溫如何穩(wěn)定在37°C、冬眠的生物學(xué)機(jī)制、本體感覺的產(chǎn)生及神經(jīng)環(huán)路等也將有望解決。