劉 雙 趙 新 李瑞環(huán) 劉 娜 蘭青闊 檀建新 王 永,*

(1.天津市農(nóng)業(yè)科學院 生物技術研究所，天津 300381；2.河北農(nóng)業(yè)大學 食品科技學院，河北 保定 071001)

自1996年國際上首次種植轉基因作物至今已有24年的時間。轉基因作物的發(fā)展突飛猛進，很多國家和地區(qū)均實施了標識管理制度，并設定了閾值。如歐盟實施強制性的轉基因標識制度[1]，我國目前對轉基因產(chǎn)品也實施強制標識制度。目前，轉基因檢測的方法主要是基于核酸檢測的聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術[2]、核酸雜交技術[3]和基因芯片技術[4]；基于蛋白質檢測的Western Blot[5]和酶聯(lián)免疫吸附測定[6]等。其中應用最廣泛的是基于核酸檢測的普通PCR方法和實時熒光PCR方法。我國已經(jīng)研制了‘ZH 10-6’大豆的定性PCR檢測方法，實時熒光定量PCR方法[7]已初步建立，但是其數(shù)字PCR定量方法尚未見報道。相對于轉基因成分定性PCR檢測方法，定量PCR檢測方法不僅可以檢測產(chǎn)品含有的轉基因成分，而且可以確定轉基因成分的含量，更加有助于轉基因產(chǎn)品的監(jiān)管。

數(shù)字PCR(digital polymerase chain reaction，dPCR)是在實時熒光PCR基礎上發(fā)展起來的微量DNA分子定量檢測新技術。dPCR是將PCR體系分配到足夠小的反應單元中，實現(xiàn)每個反應單元只有單個模板分子進行PCR擴增，再采用泊松分布原理，根據(jù)陽性微滴與陰性微滴數(shù)的比例計算目標分子拷貝數(shù)，實現(xiàn)絕對定量[8-10]。該方法降低了標準曲線對測量結果產(chǎn)生影響等問題，降低了基體效應，實現(xiàn)了PCR擴增的樣品分離，消除了本底信號的影響，提高了低拷貝DNA的擴增靈敏度[11]。相比實時熒光PCR，數(shù)字PCR具有更好的測量獨立性，且無需任何校準物，具有更高的特異性、靈敏度、精確性和穩(wěn)定性。

轉基因耐除草劑大豆品種‘ZH 10-6’是由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所研發(fā)的轉G2-EPSPS和GAT基因耐除草劑大豆新品種[12]。研發(fā)人采用農(nóng)桿菌介導轉化法，將整合有G2-EPSPS和GAT2個基因的獨立表達載體DNA導入大豆受體中，通過多代篩選獲得對草甘膦具有抗性的‘ZH 10-6’轉化體，在我國具有重要產(chǎn)業(yè)化應用前景，已獲得轉基因安全證書。但是其數(shù)字PCR定量檢測方法尚未見報道。本研究以‘ZH 10-6’特異性序列為靶標，通過對引物探針濃度的優(yōu)化確定擴增體系，并對其特異性、靈敏度和準確度等進行測試，旨在建立該轉基因大豆品種‘ZH 10-6’的微滴式數(shù)字PCR精準定量檢測方法，以期為該轉基因大豆品種的安全評價、行政監(jiān)管和知識產(chǎn)權保護提供重要的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

轉基因耐除草劑大豆品種‘ZH 10-6’；非轉基因大豆品種‘ZH 10’；轉基因玉米品種混合樣(‘Bt 11’、‘Bt 176’、‘MON 810’、‘MON 863’、‘GA 21’、‘NK 603’、‘T 25’、‘TC 1507’、‘MON 89034’、‘MON 88017’、‘59122’、‘MIR 604’、‘3272’、‘MON 87460’、‘MIR 162’、‘DAS 40278-9’、‘雙抗12-5’、‘IE09S034’、‘C0030.3.5’、‘C0010.3.7’、‘4114’、‘MON 87427’和‘5307’)；轉基因大豆品種混合樣(‘GTS 40-3-2’、‘MON 89788’、‘CV 127’、‘A 5547-127’、‘A 2704-12’、‘305423’、‘356043’、‘MON 88302’、‘73496’、‘MON 87769’、‘MON 87705’、‘FG 72’、‘DAS 68416-4’和‘SHZD 32-1’)；轉基因油菜品種混合樣(‘Ms 1’、‘Ms 8’、‘RF 1’、‘RF 2’、‘RF 3’、‘T 45’、‘oxy 235’、‘Topas 19/2’、‘MON 88302’和‘73496’)；轉基因水稻品種混合樣(‘TT 51-1’、‘科豐6號’、‘M 12’、‘科豐8號’、‘科豐2號’、‘G6H1’和‘T1 C-19’)；轉基因棉花品種混合樣(‘MON 531’、‘MON 1445’、‘MON 15985’、‘MON 88913’、‘GHB 614’、‘COT 102’)。以上樣品均由本實驗室收集保存。

1.2 方法

1.2.1基因組DNA提取

以轉基因耐除草劑大豆品種‘ZH 10-6’新鮮葉片為材料，按照德國QIAGEN公司的DNeasy Plant Mini Kit提取試劑盒純化獲得基因組DNA，利用NanoDrop ND-1000核酸蛋白定量儀(Thermo Scientific公司，美國)測定DNA質量并將其稀釋至統(tǒng)一濃度25 ng/μL，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物和探針設計

轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的外源基因插入位置為第17號染色體，插入位點為含有G2-EPSPS和GAT2個基因的完整表達框，以及只含G2-EPSPS基因的表達框，不同外源基因片段之間以大豆基因組DNA片段相連接(圖1)。

根據(jù)轉基因耐除草劑大豆‘ZH10-6’外源插入片段的2個5′端側翼序列，采用Primer Express 3.0設計了多種引物探針組合，引物由上海生工有限公司合成，引物探針信息，見表1。

圖1 轉基因耐除草劑大豆‘ZH10-6’外源基因插入位點Fig.1 Insertion site of foreign gene in transgenic herbicide-tolerant soybean ‘ZH10-6’

表1 微滴式數(shù)字PCR引物探針序列信息Table 1 Sequence information of droplet digital PCR primer probe

1.2.3反應體系和條件

PCR反應的總體積為20 μL，包括BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes 10 μL，10 μmol/L上游引物1 μL，10 μmol/L下游引物1 μL，10 μmol/L探針1 μL，25 ng/μL DNA模板1 μL，用無菌ddH2O補充至20 μL。

PCR擴增反應條件：94 ℃預變性10 min，1個循環(huán)；94 ℃變性30 s，60 ℃退火1 min，40個循環(huán)；98 ℃酶失活10 min，1個循環(huán)。

1.2.4引物探針初篩

使用上述通用體系和程序，以轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’基因組DNA為模板，采用合成的引物探針組合配制20 μL的PCR體系，將體系混勻后轉移至微滴生成卡槽的樣品列小室中，在oil列加入70 μL的微滴生成油，蓋上膠墊放入微滴生成器BIO-RAD QX100 Droplet Generator(Bio-Rad公司，美國)中由儀器自主生成微滴，再將生成的微滴小心轉移至96孔板中，175 ℃于BIO-RAD PX1 PCR Plate Sealer(Bio-Rad公司，美國)熱封膜，最后置于Analytik jena Easy Cycler梯度PCR儀(Bio-Rad公司，美國)中進行PCR擴增，待PCR擴增結束后，將96孔板放入微滴分析儀BIO-RAD QX100 Droplet Reader(Bio-Rad公司，美國)中讀取信號，并進行分析。篩選陽性和陰性微滴界限區(qū)分清晰且僅以轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’基因組DNA為模板時，生成有陽性微滴的引物探針組合，每個反應設置2個平行。

1.2.5PCR反應體系和程序優(yōu)化

根據(jù)BIO-RAD ddPCR Supermix for Probes推薦的引物探針體積，分別設置5個濃度梯度的引物探針(體系終濃度為0.3、0.4、0.5、0.6和0.7 μmol/L)對微滴式數(shù)字PCR體系進行優(yōu)化，篩選出陽性與陰性微滴界限清楚，且熒光信號相對較高的引物探針組合作為本研究的最優(yōu)反應體系。

分別設置6個梯度的退火溫度(54、56、58、60、62 和64 ℃)，對微滴式數(shù)字PCR程序進行優(yōu)化，篩選出陽性微滴與陰性微滴界限清楚，且熒光信號相對較高的引物探針組合作為本方法的最優(yōu)反應條件。

1.2.6特異性測試

以轉基因玉米混合樣，轉基因大豆混合樣，轉基因油菜混合樣，轉基因水稻混合樣，轉基因棉花混合樣，非轉基因大豆樣品的基因組DNA為模板，采用已優(yōu)化的反應體系進行PCR擴增，對檢測方法的特異性進行測試，每個反應設置2個平行。

1.2.7定量檢測線性動態(tài)范圍測定

將轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的基因組DNA(100%)用緩沖液稀釋至50.000%、10.000%、2.000%、0.400%、0.080%和0.016% 共7個濃度梯度，采用優(yōu)化后的體系進行PCR擴增以確定本方法的線性動力范圍，每個反應3次重復。

1.2.8檢出限和定量限驗證

以定量檢測線性動態(tài)范圍測定中線性范圍下限且RSD≤25%的基因組DNA濃度為模板，進行PCR擴增，每個反應設置10個平行，統(tǒng)計PCR反應結果確定本方法的定量限(limit of quantification, LOQ)；采用可以穩(wěn)定檢測的基因組DNA濃度，設置10個重復進行PCR擴增，統(tǒng)計10個平行PCR反應的結果，確定本方法的檢出限(limit of detection, LOD)。

1.2.9方法適用性測試

制備轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’含量分別為100.00%、5.00%和1.00%的樣品：以非轉基因大豆‘ZH 10’和轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’進行質量濃度配比混合，得到已知含量的定量測試樣品。提取其基因組DNA作為模板，進行數(shù)字PCR擴增，通過計算得到測試樣品的含量，對方法的定值適用性進行測試。

2 結果與分析

2.1 引物初篩

采用通用體系進行PCR擴增，初步篩選確定了陽性微滴與陰性微滴界限區(qū)分明顯且熒光信號值相對較高的引物探針組合2-5-F3/R3/P3(圖2)，作為本研究的引物探針進行后續(xù)的體系優(yōu)化和驗證試驗。

2.2 微滴式數(shù)字PCR體系優(yōu)化

由表2、圖3和圖4可知，微滴式數(shù)字PCR體系中引物和探針的終濃度為0.5 μmol/L，退火溫度56 ℃時，陽性微滴與陰性微滴界限清楚，且熒光信號值較高，確定擴增體系的引物終濃度為0.5 μmol/L，探針終濃度為0.5 μmol/L。

2.3 特異性測試

由圖5可知，僅以轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的基因組DNA為模板時，生成有陽性微滴，且陽性微滴與陰性微滴界限清楚，而以其他轉基因作物混樣和非轉基因大豆的基因組DNA為模板時，沒有陽性微滴生成，表明本研究所篩選的引物探針特異性良好，可以用于后續(xù)測定。

1和2，引物組合1-5-F1/R1/P1；3和4，引物組合1-5-F1/R2/P1；5和6，引物組合1-5-F2/R1/P2；7和8，引物組合1-5-F2/R2/P2；9和10，引物組合2-5-F1/R1/P1；11和12，引物組合2-5-F1/R2/P2；13和14，引物組合2-5-F2/R1/P1；15和16，引物組合2-5-F2/R2/P2；17和18，引物組合2-5-F3/R3/P3。1 and 2， primer combination 1-5-F1/R1/P1; 3 and 4， primer combination 1-5-F1/R2/P1; 5 and 6， primer combination 1-5-F2/R1/P2; 7 and 8， primer combination 1-5-F2/R2/P2; 9 and 10， primer combination 2-5-F1/R1/P1; 11 and12， primer combination 2-5-F1/R2/P2; 13 and 14， primer combination 2-5-F2/R1/P1; 15 and 16， primer combination 2-5-F2/R2/P2; 17 and 18， primer combination 2-5-F3/R3/P3.圖2 微滴式數(shù)字PCR引物初步篩選結果Fig.2 Preliminary screening results of droplet digital PCR primers

表2 微滴式數(shù)字PCR體系優(yōu)化拷貝數(shù)結果Table 2 Optimized copy number results of droplet digital PCR system

2.4 定量線性范圍測定

由表3和圖6可知，大豆內(nèi)源基因Lectin和轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’特異性序列標準曲線的相關系數(shù)R2均>0.99。在模板含量為66.0個拷貝時，大豆內(nèi)源基因Lectin和轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’特異性序列的RSD≤25.00%，初步確定本研究的定量檢測下限為66.0個拷貝。

1，2，3, 4和5分別是引物濃度0.3，0.4，0.5，0.6和0.7 μmol/L。1， 2， 3, 4 and 5 indicate primer concentration 0.3， 0.4， 0.5， 0.6 and 0.7 μmol/L respectively.圖3 微滴式數(shù)字PCR體系優(yōu)化結果Fig.3 Optimization results of droplet digital PCR system

2.5 檢出限和定量限驗證

由表4可知，10次重復內(nèi)源基因Lectin的RSD為19.44%，轉基因大豆‘ZH 10-6’特異性序列的RSD為16.00%，內(nèi)源基因和特異性序列擴增RSD均≤25.00%，故確定定量限為66.0個拷貝。

1和2，54 ℃；3和4，56 ℃；5和6，58 ℃；7和8，60 ℃；9和10，62 ℃；11和12，64 ℃。圖4 微滴式數(shù)字PCR程序退火溫度優(yōu)化結果Fig.4 Optimization annealing temperature results of droplet digital PCR program

1和2，陽性對照；3和4，轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’；5和6，非轉基因大豆樣品；7和8，轉基因玉米混樣；9和10，其他轉基因大豆混樣；11和12，轉基因油菜混樣；13和14，轉基因水稻混樣；15和16，轉基因棉花混樣；17和18，陰性對照。1 and 2， positive control; 3 and 4， genetically modified herbicide-tolerant soybean ‘ZH 10-6’; 5 and 6， non-transgenic soybean sample; 7 and 8， genetically modified corn mixed samples; 9 and 10， other genetically modified soybean mixed samples; 11 and 12， genetically modified rapeseed mixed samples; 13 and 14， genetically modified rice mixed sample; 15 and 16， genetically modified cotton mixed sample; 17 and 18， negative control.圖5 微滴式數(shù)字PCR特異性檢測結果Fig.5 Specific detection results of droplet digital PCR

表3 微滴式數(shù)字PCR定量線性范圍測試結果Table 3 Test results of quantitative linear range of droplet digital PCR

圖6 大豆內(nèi)源Lectin(a)和轉基因耐除草劑大豆‘ZH10-6’特異性序列(b)基因定量線性范圍PCR擴增結果Fig.6 The quantitative linear range PCR amplification results of soybean endogenous Lectin (a) and genetically modified herbicide-tolerant soybean‘ZH10-6’ specific sequence (b)

以含量為13.0個拷貝的DNA為模板擴增時，10次擴增均有陽性微滴生成；以含量為2.6個拷貝的DNA為模板擴增時，10個重復中有8次檢測達到陽性微滴，2次未檢測到陽性微滴，確定檢出限為13.0個拷貝，見表4。

2.6 適用性測試結果

由表5和圖7可知，模擬樣品定值實際結果與預計結果偏差均在25%以內(nèi)，表明本方法的定值適用性良好。

表4 微滴式數(shù)字PCR定量限(LOQ)和檢出限(LOD)Table 4 Limit of quantification (LOQ) and limit of detection (LOD) of the droplet digital PCR

表5 數(shù)字PCR方法適用性測定Table 5 Applicability determination of digital PCR method

1和2，樣品1內(nèi)源基因；3和4，樣品1外源基因；5和6，樣品2內(nèi)源基因；7和8，樣品2外源基因；9和10，樣品3內(nèi)源基因；11和12，樣品3外源基因。1 and 2， sample 1 endogenous gene; 3 and 4， sample 1 exogenous gene; 5 and 6， sample 2 endogenous gene; 7 and 8， sample 2 exogenous gene; 9 and 10， sample 3 endogenous gene; 11 and 12， sample 3 foreign gene.圖7 數(shù)字PCR方法適用性測定結果Fig.7 Applicability test results of digital PCR method

3 討 論

隨著轉基因技術的廣泛應用，多數(shù)國家對轉基因產(chǎn)品均強制規(guī)定轉基因成分含量高于某一閾值時須進行標識，如何精準測定轉基因成分的含量已經(jīng)成為現(xiàn)今轉基因產(chǎn)品檢測技術研究的一個關鍵點。目前，用于分析基因拷貝數(shù)的方法主要有Southern Blot方法、實時熒光PCR定量方法和數(shù)字PCR定量方法。

Southern也被稱為凝膠電泳雜交技術。該方法利用了硝酸纖維素膜或尼龍膜的特性,即可吸附DNA進行印跡實驗。首先待測樣品進行凝膠電泳，然后將電泳的DNA條帶轉印到膜上，后直接在膜上進行被測DNA和同位素標記的探針之間的雜交。最后，通過放射自顯影設備來檢測雜交結果，以檢測DNA樣品中包含的特定DNA序列。Southern印跡法在檢測靶基因的拷貝數(shù)，鑒定轉基因植物，開發(fā)分子標記和篩選DNA文庫中起重要作用。但該項技術的操作步驟繁雜，要獲得理想的結果，通常會花費較多的時間和精力。傳統(tǒng)Southern印跡分析的探針通常用放射性同位素標記，但可能會對操作人員和環(huán)境造成放射性危害。傳統(tǒng)的Southern Blot方法分析基因拷貝數(shù)操作復雜、耗時長、工作量大且準確性相對較差[13]。

實時熒光PCR相對定量檢測方法是轉基因檢測中常用的方法之一。該方法具有特異性強、靈敏度高、可定量分析靶標序列含量等優(yōu)點，相對于普通PCR來說，實時熒光PCR相對定量檢測方法檢出限更低。實時熒光PCR定量方法分析基因拷貝數(shù)較Southern Blot方法耗時短，但依賴于標準品，需要同時構建內(nèi)源基因和轉化體特異性序列的標準曲線，是一種依賴于構建標準曲線的相對定量分析方法[14-15]，檢測結果也存在一定的不確定性。

微滴式數(shù)字PCR精準定量檢測方法是配置PCR體系后，通過微滴生成器將混勻后的體系生成上萬個油包水微滴，再放入PCR儀中進行擴增，最后放入微滴讀取儀中讀取陽性微滴和陰性微滴的個數(shù)，從而來精準定量靶標序列。微滴式數(shù)字PCR精準定量方法[16]較前2種分析基因拷貝數(shù)的方法，操作更加簡單，不需要標準物質，不依賴于標準曲線的構建，不僅可以更加準確的定量研究靶標序列，而且檢測時間更短，結果由儀器判讀也可避免操作人員的主觀因素，獲取數(shù)據(jù)更加方便，結果也更加穩(wěn)定可靠，實現(xiàn)了真正意義上的絕對定量[17-18]。微滴式數(shù)字PCR精準定量檢測方法的不足之處是比實時熒光PCR檢測方法成本高。

本研究采用的微滴式數(shù)字PCR精準定量方法用于分析基因的拷貝數(shù)，可有效避免實時熒光定量PCR擴增中體系的擴增效率、標準曲線構建的準確性對檢測結果帶來的影響，對于拷貝數(shù)少的基因定量檢測更加高效，應用前景廣闊[19-20]。本研究建立的轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的數(shù)字PCR精準定量檢測方法可以對轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’進行精準定量，精確度和準確度均符合《農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第323號-21-2020轉基因植物及其產(chǎn)品成分檢測數(shù)字PCR方法制定指南》[21]的相關要求，相較實時熒光定量PCR方法依賴于標準曲線的定量方法，更適合于轉基因產(chǎn)品的分析[22]。

4 結 論

本研究基于轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’的5’端邊界序列，建立的轉基因耐除草劑大豆‘ZH 10-6’數(shù)字PCR檢測方法特異于‘ZH 10-6’品種檢測，在相對標準偏差≤25.00%的情況下本方法的檢出限(LOD)為13.0個拷貝、定量限(LOQ)為66.0個拷貝；PCR擴增反應模板含量與樣品拷貝數(shù)之間線性R2≥0.998，DNA含量線性范圍為0.08%～100.00%。本方法重復性好，精密度和準確度均符合相關要求，適用于對農(nóng)產(chǎn)品和食品中轉基因大豆‘ZH 10-6’特異性序列的精準定量分析。